山楂總ＤＮＡ提取方法的比較

摘 要：為選擇一種快速、簡單、有效的山楂總DNA的提取方法，分別應用改良CTAB法、改良SDS法和QIAGEN試劑盒法提取山楂幼嫩葉片的總DNA，用紫外分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳和RAPD對所提取的總DNA進行檢測。QIAGEN試劑盒法簡單省時，提取的山楂總DNA產量高、純度高、雜質少、DNA碎片少。以該法提取的總DNA為模板進行RAPD擴增，譜帶清晰，多態性、穩定性、重復性好。QIAGEN試劑盒法是較為理想的山楂總DNA提取方法，該法提取的總DNA適用于PCR擴增和其他分子生物學研究。

關鍵詞：山楂；總DNA；提取方法；RAPD

中圖分類號：S661.5 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－115－04

山楂是我國特有的果樹，栽培歷史悠久，資源十分豐富，果實和葉片具有藥用價值。近年來，關于山楂的生物學特性、栽培技術、分類、藥理研究等屢見報道，但分子生物學方面的研究極少。提取高質量的DNA樣品是進行分子生物學研究的必要前提。山楂葉片含有大量的黃酮類、三萜類、多酚類等次生物質，因而具有很高的營養保健價值，但同時也增加了總DNA的提取難度。本試驗對3種常用的提取植物總DNA的方法進行了比較研究，選擇出一種有效的提取、純化山楂總DNA的方法，為進一步開展山楂的分子生物學研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1．l 材料

試材取自沈陽農業大學山楂國家種質資源圃，其中包括3個山楂種，分別為彰武山里紅(Crataegusbrettshnederi Zhangwushanlihong)、毛山楂(C.maxi-mowicizii Maoshanzha)和寧安山楂(C.marimowicziiNing’an8hanzha)，以及5個山楂栽培品種，分別為聶家峪l號(C.pittnatifisda Niejiayu-1)、銀冶嶺1號(C.pinnatifida Yinyeling-1)、秋金星(C.pirtrtatifida Qiu-jinxing)、遼紅(C.pinnatifida Liaohong)和西豐紅(C.pinniatifida Xifcnzhong)。于2005年3月取幼嫩葉片，清水沖洗，濾紙吸干后，用MAXI dry Lyo真空濃縮凍干系統凍干，置于-70℃冰柜中貯藏備用。

1．2 總DNA提取方法

1．2．1 改良CTAB法將凍干山楂葉片20mg在液氮中研碎，迅速移入1.5mL離心管中。加入500μL預熱的CTAB提取緩沖液和0.4％巰基乙醇(預熱前加入)。于65℃保溫30min，期間顛倒幾次。加入500μL的氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕顛倒若干次。10000r/min離心10min。把上清液400μL移入新的1.5mL離心管，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕顛倒若干次，10000r/min離心5min。取上清液240μL，加入480μL冰冷的無水乙醇混勻，一20℃靜置30min。10000r/min離心10min。棄上清，加入350μL TE，當大部分沉淀溶解后，10000r/min離心10min。將上清液300μL轉移到新的1.5mL離心管中，加入1μL RNase(10μg/μL)，輕輕混勻后在37℃水浴1h。加入30μL的3mol/LNaAc(pH5.2)，混勻，加入660μL冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，-20℃靜置30min。10000r/min離心10min。棄上清，用70％乙醇洗滌DNA沉淀2次。在超凈工作臺上風干DNA。加入100μL 1/10(v/v)TE溶解DNA，于-20℃保存備用。

1．2．2 改良SDS法 將凍干山楂葉片20mg在液氮中研碎，迅速轉入含有400μL SDS提取緩沖液和0.4％巰基乙醇的離心管中，加入100μL10％(w/v)SDS溶液，充分混勻，于65℃保溫12min，期間顛倒幾次。加入150μL 5mol/L KAc，混勻(確保鹽未沉到管底)，冰水浴30min。然后置室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，混勻，4℃、10000r/min離心10min。取上清500μL轉移到新的1.5mL離心管中，加入1000μL冰冷的無水乙醇，-20℃放置20min，于4℃、10000r/min離心10min。棄上清，加入350μLTE，當大部分沉淀溶解后，10000r/min離心10min。將上清液300μL轉移到新的1.5mL離心管中，加入 1μL RNase(10μg/μL，輕輕混勻后在37℃水浴1h。加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕顛倒若干次，10000r/min離心5 min。取上清液240μL，加入24μL的3mmol/L NaAc(pH5.2)，混勻，加入528μL冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，-20℃靜置30min。10000r/min離心10min。棄上清，用70％乙醇洗滌DNA沉淀2次。在超凈工作臺上風干DNA。加入100μL 1/10(v/v)了E溶解DNA，于-20℃保存備用。

1．2．3 QIAGEN試劑盒法 采用QIAGEN公司的Plant DNeasy kit(CATN0.69104)，將凍干葉片20mg在液氮中研碎，最后用200μLBufferAE洗膜，得到約190μLDNA溶液。操作過程參照QIAGEN公司產品說明書(硅膠捕獲法)。

1．3 DNA樣品的檢測

1．3．1 光密度值測定取DNA樣品15μL稀釋200倍，通過DV 800 Nucleic Acid/Protein Analyzer測定DNA樣品的分光光度值D_260nm和D_280nm，并計算D_260nm/D_280nm比值和DNA濃度。

1．3．2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 瓊脂糖濃度0.8％。點樣體積8μL，電泳電壓100V，應用1×TBE電泳緩沖液。

1．4 RAPD分析

反應體系：2μL 10xPCR電泳緩沖液，1.5mmol/LMgCl₂，0.2mmol/L dNTP，1U Taq酶，5μL稀釋10倍的總DNA模板，0.3mmol/L引物(OPERON公司合成)，加滅菌超純水至20μL。

反應在Eppendoff Mastercycler Gradient PCR儀中進行。反應程序：94℃預變性30S，94℃變性30s，40℃退火2min，72℃延伸3min，45個循環，最后72℃延伸7min。反應結束后在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，應用1×TBE電泳緩沖液。

2 結果與分析

2．1 DNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳分析

采用3種方法所提取的山楂總DNA大小都在20kb左右(圖1)。改良CTAB法提取的亮度均勻一致，拖尾現象較改良SDS法輕，DNA降解不太嚴重，但點樣孔很亮，樣品中還殘留有較多的蛋白和糖類等雜質：改良SDS法提取的DNA有明顯的拖尾現象，DNA有降解，質量不高，但點樣孔不太亮；改良CTAB法和改良SDS法是分子生物學實驗中核酸提取的常用方法，但應用于山楂時，8個品種(系)中聶家峪1號和西豐紅都未檢測出譜帶，改良SDS法應用于寧安山楂時也幾乎檢測不到譜帶，因此這2種方法不適用于山楂總DNA的提取。QIAGEN試劑盒法應用于8個品種(系)都得到了清晰的譜帶，效果明顯優于改良CTAB法和改良SDS法。

2．2 DAN樣品的紫外分光光度計分析

從表1可以看出改良CTAB法提取的DNA產率偏低，D_260nmD_280nm較QIAGEN試劑盒法也略低，樣品中雜質較多：改良SDS法提取的部分樣品DNA產率很高，但產率差距很大，D_260nmD_280nm也較低，說明樣品中殘存的蛋白質、酚類及多糖類等雜質含量高，DNA斷裂嚴重，含有較多的碎片。純度不高；采用QIAGEN試劑盒法所得的DNA，D_260nmD_280nm比值比較穩定，都在1.7～1.9，產率也較高，表明蛋白質、多糖等雜質去除的比較干凈，DNA純度和產率均較高，是提取山楂總DNA的較好的方法。

2．3 DNA樣品的RAPD分析

用OPERON公司合成的隨機引物OPO-13和OPX-06對3種方法提取的DNA進行RAPD擴增。從擴增反應后的電泳圖譜(圖2)可以看出改良CTAB法提取的DNA做模板能夠得到清晰的譜帶，但電泳譜帶數較QIAGEN試劑盒法少，如改良CTAB法提取的聶家峪l號的DNA樣品應用引物OPO-13和OPX-06擴出的譜帶都為4條，而QIAGEN試劑盒法擴出的條帶分別為8條和6條，且此法提取的彰武山里紅的總DNA未擴出譜帶；改良SDS法所提取的DNA沒有擴出任何譜帶，說明此方法提取的DNA純度很低，不能用其做模板進行山楂分子生物學分析：QIAGEN試劑盒法提取的DNA做模板擴出的譜帶清晰整齊，RAPD擴增重復性、穩定性、多態性好，結果較為理想。

3 討 論

本研究在實驗條件完全相同的情況下，用改良SDS法同時提取草莓和幾個山楂品種幼葉的總DNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，發現草莓的DNA譜帶清晰，而山楂的DNA譜帶很弱，甚至檢測不到。改良CTAB法和改良SDS法提取梨、葡萄等葉片總DNA的報道也很多，用于山楂卻不能得到理想的結果，因此推測山楂葉片中可能含有某些特殊的次生代謝物質，干擾總DNA的提取，影響Taq DNA聚合酶的活性，使RAPD擴增不穩定，甚至失敗。尤其是改良SDS法，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后譜帶清晰，幾乎沒有殘留蛋白，但抽提過程中上清液非常黏稠，沉淀顏色發黃，RAPD擴增得不到任何譜帶，很有可能是受到這些特殊次生代謝物質的影響，使擴增反應不能正常進行，因而檢測不出譜帶。

通過對3種提取方法的比較研究發現，改良CTAB法和改良SDS法步驟繁瑣，反復溶解抽提沉淀，不僅增加了對DNA的剪切作用，降低了DNA的純度和產率，而且時間長，全部過程在6h以上，工作量大。QIAGEN試劑盒法雖價格昂貴，提取1個樣品約30元，但提取步驟簡單，耗時短，提取8個山楂品種(系)的全部過程僅需2h左右，得到的總DNA產率高、純度好，RAPD擴增穩定性、多態性、重復性好，可用于山楂分子生物學的研究。

4 結 論

本研究對3種常見的植物葉片總DNA的提取方法進行了比較研究，紫外分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳和RAPD檢測結果表明，QIAGEN試劑盒法提取的總DNA質量高、純度高，該法提取的總DNA適用于RAPD擴增。因此，QIAGEN試劑盒法是較為理想的山楂葉片總DNA的提取方法，這為進一步開展山楂的分子生物學研究奠定了基礎。

作者簡介：李媛媛，女，在讀博士生，主要從事果樹分子生物學研究。