優(yōu)質(zhì)大果楊梅新品系烏紫楊梅的生物學(xué)特性及其ＲＡＰＤ鑒定

摘 要：烏紫楊梅是從浙江省象山縣的自然實生資源中選出的一個優(yōu)質(zhì)、大果、早熟楊梅新品系。烏紫楊梅果實正圓形，果面紫黑色，單果重為23.49g；總糖、可溶性固形物和花色苷含量分別為83.6mg/g、13.26％、0.50mg/g，顯著高于東魁楊梅；總酸為0.92％，比東魁略低；成熟期為6月15～24日，比東魁楊梅早7～10d。RAPD分析顯示，烏紫楊梅新品系母本樹與烏紫楊梅嫁接后代(嫁接第1代、第2代、第3代、第4代)的相似性極高，為0.94－0.98；他們之間的遺傳距離也最小。而烏紫楊梅及嫁接后代與東魁、炭梅、水梅的之間相似性較低、遺傳距離也相距較遠。上述結(jié)果表明烏紫楊梅是一個不同于其他楊梅品種、后代表現(xiàn)穩(wěn)定的大果、優(yōu)質(zhì)楊梅新品系。

關(guān)鍵詞：烏紫楊梅；新品種；優(yōu)質(zhì)；大果；RAPD鑒定；遺傳穩(wěn)定性

中圖分類號：S667.6 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－64－04

楊梅為我國特有的水果與經(jīng)濟林木，經(jīng)濟栽培主要分布在浙江等南方省區(qū)。2004年浙江省楊梅種植面積已達600km²，產(chǎn)量超過27萬t，2者均位居全國第一。浙江楊梅資源豐富，擁有東魁、荸薺種、丁岙、晚稻4大楊梅良種，特別是大果型、品質(zhì)優(yōu)、適應(yīng)性強的東魁已成為全國發(fā)展最為迅猛的楊梅品種。但東魁楊梅為晚熟品種；目前，生產(chǎn)上缺少與之搭配的大果型早熟品種。近年來，我們在浙江省象山縣發(fā)現(xiàn)了一個優(yōu)質(zhì)、大果的楊梅實生單株，以及農(nóng)民自發(fā)從該優(yōu)質(zhì)單株上采穗嫁接后形成的后代群體。該新品系在浙江象山于6月中下旬成熟，比當?shù)貣|魁楊梅提早7～10d。目前將該新品系暫定名為烏紫楊梅。該新品系是繼東魁后又一個大果型的楊梅新品種，可拉長大果楊梅的供應(yīng)期，有極高的推廣應(yīng)用價值。為加快烏紫楊梅的品種鑒定和推廣，有必要對烏紫楊梅的生物學(xué)特性和嫁接后代的遺傳穩(wěn)定性進行觀察與鑒定。近年來，RAPD(randomly amplifiedpolymorphic DNA)分析因其快速、簡單、經(jīng)濟，廣泛應(yīng)用于楊梅、枇杷、李田、梨、櫻桃、獼猴桃、杏等果樹分類和品種鑒定，尤其是對來源于自然雜交的品種鑒別。為此，本研究以烏紫楊梅為材料，對該新品系的生長結(jié)果習(xí)性進行了觀察，并采用RAPD分子標記技術(shù)對烏紫楊梅母本樹及其嫁接后代與本地水梅、本地炭梅和東魁楊梅進行比較鑒別，以期明確該新品系的生物學(xué)特征、遺傳穩(wěn)定性，為烏紫楊梅新品系的栽培技術(shù)開發(fā)和新品種鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料

本試驗材料楊梅采自浙江省象山縣曉塘鄉(xiāng)焦頭村。RAPD分析所用幼葉采自烏紫楊梅新品系母本-樹、母本樹附近的雄株(雄株1、雄株2)、烏紫楊梅嫁接樹(嫁接第1代、第2代、第3代、第4代)、本地炭梅、本地水梅和東魁等楊梅春梢未完全展開的幼葉，采集后經(jīng)液氮冷凍，保存于70℃供DNA提取用。

1．2 生物學(xué)與植物學(xué)特性觀察

選14年生烏紫楊梅高接后代，主要觀察葉、花、果、梢的物候期和生長發(fā)育特性。

1．3 楊梅果實品質(zhì)分析

葡萄糖、果糖、蔗糖含量測定采用HPLC法，可溶性固形物含量(SSC)測定用手持折光儀法，可滴定酸含量用酸堿滴定法，花色苷測定用pH差示法。重復(fù)3次。

1．4 基因組DNA提取

楊梅幼葉基因組DNA提取參考Congiu等的方法略作改進：取1g葉片，加液氮研磨后轉(zhuǎn)入50mL離心管中，加入10mL預(yù)熱至65℃的C了AB提取液(含100mmol/L Tris-HCl，15mmol/L EDTA，1.2moL/LNaCl，2％CTAB，0.5％β－巰基乙醇，pH8.0)。將盛有樣品的提取液在65℃水浴中保溫45～60min。加入等體積氯仿一異戊醇(24:1)，搖勻，靜置5min，4℃下8000G離心10min，上清液中加入等體積預(yù)冷異丙醇，緩緩搖勻，可見白色或黃白色DNA絮狀沉淀，鉤出絮狀沉淀，在75％K，醇中洗滌沉淀2～3次，37℃或室溫下風干，加入適量(1mL左右)TE緩沖液(10mmol/L Tris-HC1.1 mmol/L EDTA，pH8.0)，溶解DNA，加入10mL RNase(10μg/L)，37℃下保溫1h，分別用等體積苯酚－氯仿、氯仿－異戊醇抽提純化DNA，上清液加入1/10體積NaAc，2倍體積無水乙醇，-20℃放置30min，4℃下10000g離心10min。最后將DNA溶于適量(200～300μL)TE緩沖液中，貯于-20℃。

1．5 RAPD反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)在了hermoHybaid PX2 PCR儀上進行，PCR反應(yīng)體系為：35μL ddH₂O，5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液(500mmol/L KCL。100mmol/L Tris-HCl，1.0％Triton X-100)，4μL 25mmol/L MgCL₂，4μL dNTPs，2μL 0.5μmol/L隨機引物(RAPD引物選用OPERON的RAPD^R10mer Kits中的68個隨機引物進行了PCR擴增)，0.5μL模板DNA(約25ng)，混勻后離心5s；將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，加入0.5U Taq DNA聚合酶，混勻后加入1滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，40個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取8μLPCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳，用BIO-RADXR凝膠成像系統(tǒng)對電泳條帶進行觀察和拍照。

1．6 RAPD譜帶統(tǒng)計和聚類分析

電泳圖譜中同一位點RAPD譜帶存在時賦值為1，不存在時賦值為O。利用NTSYSpc2.0聚類分析軟件計算品種間相似性和遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2．1 生物學(xué)特性

2004—2006年觀察表明，烏紫楊梅花芽2月下旬萌動，3月10日初花，3月22日-4月2日盛花，4月2-13日末花。葉芽萌動期3月22日，春梢發(fā)生期3月26日-5月19日，平均梢長6.5cm。夏梢6月24日-7月中旬；秋梢8月下旬-9月底。春梢和夏梢為主要結(jié)果母枝，結(jié)果母枝平均長度約為10cm。果實初果期為4月8日左右，4月28-30日定果，5月4-16日硬核，6月5日果實陰面轉(zhuǎn)白、少量著色見紅，6月9日果實紫紅色、味酸，6月16-18日果實紫黑色、第1批果實成熟。

烏紫楊梅葉長×葉寬為11.2cm×3.5cm，葉緣全緣，葉色深綠，葉尖為圓鈍，葉基呈鍥形。花序長為0.53～1.55cm，粗為0.20～0.28cm，每花序有7朵以上花可開放。果實呈正圓形(圓球形)，果頂平，果面縫合線不明顯。肉柱特征為長、粗、鈍、硬。種子呈橢圓形，縫合線突起，核面粗糙。

2．1 果實主要品質(zhì)特征

比較在象山同一地點栽培的烏紫楊梅、本地炭梅和東魁的品質(zhì)顯示，烏紫楊梅的葡萄糖、蔗糖和可溶性固形物含量顯著高于本地炭梅和東魁，而可滴定酸含量比本地炭梅和東魁低。花色苷含量也顯著高于東魁，單果質(zhì)量比東魁略低，但差異不顯著(表1)。上述結(jié)果表明，烏紫楊梅是一個優(yōu)質(zhì)、大果的楊梅新品系。

2．2 引物篩選和RAPD分析

為分析烏紫楊梅的遺傳穩(wěn)定性和與其他品種間的遺傳差異，我們選用了RAPD^R10mer Kits(OPERON)的68個隨機引物對烏紫楊梅母本樹及后代和其他楊梅品種等10個楊梅材料的DNA進行PCR擴增，篩選出了47個擴增結(jié)果較好且具有多態(tài)性的引物。所用的47個引物共計擴增出370個位點，其中多態(tài)性位點為250個，占總位點數(shù)的67.6％。擴增出的DNA片段長度多數(shù)在100～2500bp，個別引物能擴增出3000bp左右的片段。每個引物擴增出的DNA條帶數(shù)為11～32條，平均每個引物能擴增出20條帶。其中引物$35擴增出的多態(tài)性位點最多，圖1是引物$35擴增的烏紫楊梅母本樹及后代和其他楊梅品種等10個楊梅材料的DNA圖譜，該圖譜可明顯將烏紫楊梅與其他品種區(qū)分開來。

2．3 遺傳距離與相似性分析

對這47個引物擴增出的譜帶進行DICE相似性分析，采用UPGMA進行聚類分析，結(jié)果如圖2所示，烏紫楊梅母株及1～4代同屬于一族，其中烏紫楊梅第1代(烏紫1st)與母株之間的相似性最高，相似系數(shù)達0.98，烏紫楊梅第3代(烏紫3rd)與母株相似性最低，相似系數(shù)為0.93，烏紫楊梅第2代(烏紫2nd)和第4代(烏紫4th)與母株的相似系數(shù)分別為0.96和0.94。遺傳距離也是烏紫楊梅1～4代與母株之間最近。而烏紫楊梅1～4代及母株與東魁、炭梅、雄株和水梅之間的相似性較低，遺傳距離也較遠。

3 討 論

楊梅是我國特有水果，但除東魁外，大果楊梅新品種罕有報道。本研究顯示，烏紫楊梅單果質(zhì)量為23.49g、SSC 13.26％、總糖83.6mg/g、總酸0.92％、花色苷0.50mg/g。除單果質(zhì)量比東魁略低外，其他品質(zhì)指標均優(yōu)于東魁，表呀烏紫楊梅是一個品質(zhì)優(yōu)于東魁楊梅新品系。 由于烏紫楊梅的成熟期比東魁提早7-10 d，而單果質(zhì)量與東魁接近，因此，烏紫楊梅可拉長大果楊梅的供應(yīng)期，推廣發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

RAPD技術(shù)是利用PCR方法對所研究材料的基因組DNA進行擴增，以電泳譜帶形式檢測材料之間的多態(tài)性，能夠從DNA分子水平揭示品種間的遺傳差異。RAPD方法通常用于實生變異的品種區(qū)分和鑒別，并已在楊梅屬植物分類中得到應(yīng)用。本研究用RAPD分析顯示，烏紫楊梅母本樹及其嫁接后代之間的DNA水平的基本沒有差異，表明后代遺傳穩(wěn)定。用RAPD能明顯地將烏紫楊梅與東魁等品種區(qū)分開來，表明在DNA水平上烏紫楊梅母本樹及其嫁接后代與當?shù)厮贰⑻棵芳皷|魁之間存在較大差異，證明烏紫楊梅是一個遺傳上不同其他楊梅品種的實生變異。本研究結(jié)果也表明，從本試驗材料中用RAPD分析不能確定烏紫楊梅品種的起源。因此，要揭示烏紫楊梅的起源需要從當?shù)厥占嗟臈蠲凡牧虾蛻?yīng)用多態(tài)性條帶更多的AFLP等分子標記技術(shù)。

4 結(jié) 論

烏紫楊梅果大，可溶性固形物含量高，成熟期為6月15-24日。RAPD分析表明，烏紫楊梅新品系母本樹與烏紫楊梅嫁接后代之間的相似性極高，遺傳距離也十分接近。而烏紫楊梅母本及嫁接后代與東魁、炭梅、水梅之間的相似性較低、遺傳距離也較遠。因此，烏紫楊梅是一個遺傳穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)、大果、早熟楊梅新品系。

作者簡介：錢皆兵，男，高級農(nóng)藝師，從事果樹栽培研究。