龍眼梅ＰＧＩＰ基因的克隆及序列分析

摘 要：利用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)得到在龍眼梅(Prunus mume Sieb et Zucc.Longyan)嫩芽中特異性表達(dá)的PGIP基因。DNA序列分析表明，所獲得龍眼梅的PGIP eDNA的序列全長(zhǎng)為1045bp，該序列與已發(fā)表的PGIP基因有很高的同源性。

關(guān)鍵詞：龍眼梅；PGIP基因；克隆

中圖分類(lèi)號(hào)：S662.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009－9980(2007)01－55－04

龍眼梅(Prunus mume Sieb et Zucc.Longyan)是中國(guó)南方特產(chǎn)名果之一，其風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，藥用價(jià)值高，被譽(yù)為保健食品，深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài)。龍眼梅的果實(shí)因含酸量較高，很少用于鮮食。大部分用于加工，但由于果實(shí)采后迅速軟化，給貯運(yùn)和加工帶來(lái)很大的困難，尤其是交通不便的山區(qū)。果實(shí)采收后，因果實(shí)的軟化，在加工前出現(xiàn)品質(zhì)下降，甚至大量腐爛，給生產(chǎn)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此。選育出抗軟化和抗病蟲(chóng)害的龍眼梅品種是急需解決的問(wèn)題，也是解決龍眼梅果實(shí)軟化的主要途徑之一。

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonaseinhibiting protein.PGIP)是一種富含亮氨酸(LRR)的蛋白質(zhì)家族成員之一，能夠非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制多種植物病理性真菌的內(nèi)聚半乳糖醛酸酶(Polygalactur-onase，PGs)的酶活性，促進(jìn)寡半乳糖醛酸酶的增加，抑制植物細(xì)胞壁果膠的溶解，增加植物的抗毒素，激活植物的防御系統(tǒng)。PGIP基因可以干擾灰霉菌等多種真菌病害對(duì)植物組織的侵染過(guò)程，從而抑制這些真菌病害的發(fā)生。PGIP基因還與果實(shí)的發(fā)育過(guò)程、脅迫反應(yīng)、冷藏、漿果果實(shí)的病蟲(chóng)害等有一定關(guān)系。因而，PGIP基因受到國(guó)內(nèi)外研究者的高度重視并成為目前抗病蟲(chóng)害基因工程和果實(shí)耐貯藏基因工程研究的焦點(diǎn)。

本文以龍眼梅嫩芽為材料，對(duì)其PGIP(cDNA)基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，為進(jìn)一步開(kāi)展轉(zhuǎn)基因育種工作奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料

植物材料龍眼梅嫩芽采自福建農(nóng)林大學(xué)校園，液氮速凍，放-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｗ灾拼竽c桿菌DH5α；載體pGEM^R-TEasy vector購(gòu)于Promega公司；玻璃奶法回收片段試劑盒購(gòu)于北京原平皓公司。由上海生工生物工程公司測(cè)序。

1．2 方法

1．2．1 總RNA的提取及純化 總RNA的提取采用Trizol提取試劑盒。

1．2．2 基因組RNA含量和純度的測(cè)定 取2μL基因組RNA樣品稀釋50倍，在Ultrospec 2100 Pro紫外分析儀上測(cè)定D_260nm、D_280nm、D_260nm／D_280nm、RNA含量(μg/μL)。

1．2．3 基因組RNA的電泳分析 取5μL RNA樣品在1.0％瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液為1×TAE，電壓為120V的條件下電泳20min，溴化乙錠染色，在凝膠成像儀上觀(guān)察DNA分子的大小、完整性、電泳條帶的清晰度。

1．2．4 cDNA第1鏈的合成 cDNA第1鏈合成采用MBI Fermentas公司試劑盒，具體操作步驟參照使用說(shuō)明書(shū)。

1．2．5 RT-PCR反應(yīng)體系及程序 1)引物的選用與合成參照張開(kāi)春等和張軍科等的馬哈利櫻桃PGIP的序列合成一對(duì)引物，其上游引物為5-CGTTCACC CGCAATCACATlq'CTTATCC-3：下游引物為5-TGG CCGTGGGAATTATTFGCAGC-3；引物由上海生物工程公司合成。2)PCR反應(yīng)體系為20μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer(plus)2.0μL，dNTP(10mmoL/L)0.3μL，MgCl₂(25mmoL/L)0.3μL，TAQ(2.5μ/L)0.5μL，cDNA 1.0μL或cDNA25.0ng，上游引物(10μm/mL)0.6μL，下游引物(10μm/mL)0.6μL，ddH₂O 14.7μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃ 5min；94℃ 1min；60℃ 1min；72℃ 1min循環(huán)35次；72℃10min；4℃保存。3)電泳檢測(cè)：同RNA電泳檢測(cè)過(guò)程。

1．2．6 目的片段回收與克隆 PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳分析后，用玻璃奶法回收片段(操作步驟見(jiàn)北京原平皓公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))，以pGEM-T-Easy為克隆載體，16℃連接過(guò)夜，后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在加Amp的選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，搖菌并做菌液PCR，進(jìn)行初步鑒定后測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2．1 總RNA的提取

取2μL在紫外分光光度計(jì)上測(cè)其含量，得結(jié)原如下：D_230nm=0.110，D_260nm=0.221，D_280nm=0.122，D_260nm/D_230nm=2.14，D_260nm/D_280nm=1.81，濃度為2.13μg/μL。總RNA電泳后在凝膠成像儀上拍照結(jié)果如圖1。

2．2 龍眼梅cDNA的PGIP片段的獲得

以上、下游引物對(duì)龍眼梅的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到一條1045bp特異條帶，條帶清晰(圖2)。

龍眼梅cDNA的PGIP基因全序列的拼接結(jié)果如下：

2．3 龍眼梅cDNA的PGIP基因編碼蛋白質(zhì)序列的推導(dǎo)

用該引物獲得龍眼梅的氨基酸序列全長(zhǎng)330aa，起始密碼子是AUG，終止密碼于是UAA，分子量為36.7ku。

2．4 龍眼梅cDNA的PGIP基因編碼蛋白質(zhì)序列的Blast結(jié)果

通過(guò)Blast，發(fā)現(xiàn)用所獲得的龍眼梅PGIP基因可能編碼的氨基酸與其他物種的PGIP基因編碼的氨基酸相似系數(shù)較高，其相似系數(shù)分別為：與馬哈利櫻桃(只mahaleb)、杏(只dulcis)、雞麻(只hodotyposscandens)達(dá)91％；與山杏(P.armeniaca)、羽葉鐵樹(shù)(Lyonothamnus floribundus)、華空木(Stephanandrachinensis)達(dá)90％；與蘋(píng)果(Malus domestica)達(dá)83％；與砂梨(Pyrus pyrifolia)、西洋梨(p.communis)達(dá)82％：與巨桉(Eucalyptus grandis)達(dá)81％、與柳葉桉(Eucalyptus saligna)達(dá)86％；與月果桉(Zucalyptusnitens)、赤桉(E.camaldulensis)達(dá)85％；與柑橘類(lèi)(Citrus sp.cv.Sainumphung、C.jambhiri、C.iyo、C.unshiu、C.latipes 、C.sinensis、C.hystrix、C.aurantiifo-lia)、懸鉤子(Rubus idaeus)等達(dá)75％；與歐亞種葡萄(yitis vinifera)達(dá)71％；與棣棠花(Kerria japonica)達(dá)88％。

3 討 論

果實(shí)的軟化與多聚半乳糖醛酸酶(PC)活性的增強(qiáng)直接相關(guān)，研究認(rèn)為在蘋(píng)果、桃、柑橘、番茄、香蕉等果實(shí)成熟軟化中主要是PG起作用。通過(guò)PG的反義RNA技術(shù)，可有效抑制果實(shí)的軟化，但乙烯、果膠酯酶等活性并未受到任何影響，果實(shí)仍然正常成熟，沒(méi)有象預(yù)期的那樣推遲軟化或減少軟化程度。真菌侵染植物時(shí)，往往會(huì)釋放PG，使植物細(xì)胞壁遭到破壞，植物則相應(yīng)產(chǎn)生PGlP來(lái)抑制PG酶的活性。針對(duì)轉(zhuǎn)PG反義基因的缺點(diǎn)，考慮到PGIP能夠非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制多種植物病理性真菌的內(nèi)聚半乳糖醛酸酶的活性，促進(jìn)寡半乳糖醛酸酶的增加，抑制植物細(xì)胞壁果膠的溶解，增加植物的抗毒素。激活植物的防御系統(tǒng)。許多研究者探索新的抑制果實(shí)軟化和抵抗真菌侵染的途徑，即從植物體中分離PGIP(多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體使PGIP基因在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)量表達(dá)。從而抑制PG活性推遲果實(shí)的軟化和增強(qiáng)植物防御系統(tǒng)。

為了能進(jìn)一步驗(yàn)證所克隆的序列是我們所需的目的基因，需要進(jìn)行基因的功能鑒定，首要的是把我們的目的基因?qū)胫参镏校灾参餅槭荏w來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證此基因是否可以使果實(shí)耐貯藏。

4 結(jié) 論

通過(guò)龍眼梅的定向克隆引物和其PCR擴(kuò)增體系的建立，成功克隆了龍眼梅的PGIP基因，該基因的序列全長(zhǎng)1045bp，具有一個(gè)完整的開(kāi)放讀碼框架(由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開(kāi)始，到終止密碼為止的一個(gè)編碼序列)。把所得到的序列與其它物種的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)龍眼梅與其他物種的相似性較高(70％～90％)，從進(jìn)化角度看，龍眼梅的進(jìn)化相對(duì)較保守，尤其與馬哈利櫻桃(P.mahaleb)、杏(只dulcis)、雞麻(R.scandens)的相似系數(shù)達(dá)91％，初步證明我們所克隆的片段為PGIP基因，以便今后以此作為目的基因構(gòu)建表達(dá)載體，為進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種工作奠定了基礎(chǔ)。

作者簡(jiǎn)介：王家福，男，研究員。主要從事園藝植物生物技術(shù)研究。