一步法ＲＴ－ＰＣＲ檢測柑橘鱗皮病毒

摘 要：柑橘鱗皮病是一種極具破壞性的柑橘病害，廣泛分布于南美及地中海地區。我國目前缺乏對該病害的快速檢測技術。以柑橘鱗皮病毒(CPV)的外殼蛋白基因(CPG)為靶標，初步建立了一步法RT-PCR快速檢測體系，擴增產物與NCBI數據庫中已知CPV CPG的核苷酸序列進行比對，2者序列間同源性超過99％。

關鍵詞：柑橘鱗皮病毒；一步法RT-PCR；檢測

中圖分類號：S666 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－113－02

柑橘鱗皮病毒(Citrus psorosis virus.CPV)屬蛇形病毒屬，是一種多分體單鏈RNA病毒，主要分布于阿根廷、巴西、意大利、西班牙以及美國等國家，對柑橘產業造成十分嚴重的危害”。該病害可以隨種子、苗木等繁殖材料的調運進行遠距離傳播。目前國外對CPV的檢測方法主要有指示植物鑒定、血清學檢測、分子雜交檢測以及反轉最多聚酶鏈式反應(RT-PCR)檢測等。由于目前我國尚無柑橘鱗皮病在田間發生的報道，因此還沒有開展對CPV的深入研究。但是陳國慶等通過指示植物鑒定發現我國從摩洛哥引進的臍血橙可能感染了CPV。目前我國引入大量的國外優良柑橘品種，增大了CPV傳人我國的可能，因此為保護我國的柑橘產業的健康發展，必須盡快建立CPV的快速檢測體系。本研究依據中國農業科學院柑橘研究所保存的CPV毒源初步建立了CPV的一步法RT-PCR快速檢測體系。

1 材料和方法

1．1 材料

實驗于2004年11月將中國農業科學院柑橘研究所脫毒中心保存的來自澳大利亞的柑橘鱗皮病毒源澳鱗A嫁接到上Dweet橘橙，負對照無病材料為Dweet橘橙無病苗；正對照材料來自脫毒中心溫室保存的Dweet橘橙病株。PCR引物由上海生物工程公司合成。One-step RNA PCR Kit為Invitrogen公司產品。

1．2 總核酸提取

按照周常勇等的方法進行總核酸提取。

1．3 RT-PCR擴增

參考文獻[4]等的方法設計引物Primerl5’-TCGAAGCTGTATGATCcTcA-3’和Primer25’-TGCCATCTGCAGTGAGGCT-3’，特征產物片段大小約為433bp。經優化后建立的RT-PCR反應體系為：10μL體系包括RNA樣品1.0μL，2×buffCr 5.0μL，Mg²⁺1.6μL，Primer 10.1μL，Primer 20.1μL，RT/Taq1.0μL。PCR反應條件為：42℃反轉錄45min，94℃變性15s，45℃退火15S，72℃延伸30s，40個循環；最后72℃延伸5min。擴增產物進行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，經溴乙錠染色觀察結果。

1．4 RT-PCR產物的測序

RT-PCR產物經過PCR產物純化試劑盒(Promega)純化回收。在中國農業科學院柑橘研究所的CEQ2000測序儀上進行雙向測序。測序結果經DNAstar核正后在NCBI中進行同源性比較。

2 結果與分析

2．1 RT-PCR擴增結果

RT-PCR擴增后，經1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，CPV陽性樣品均能擴增出433 bp的特異性條帶，與前人，的結果一致，水對照和陰性對照均不能擴增出特異性條帶(圖1)。

2．2 PCR結果的測序

PCR產物經測序后于NCBI數據庫中與已知的CPV序列進行比對，結果表明，PCR產物核苷酸序列與已知CPV的外殼蛋白序列之間同源性超過99％，而與其他非目標序列的同源性最高只有38.2％。由此可以證實該擴增產物為CPV的特異性產物。

3 討 論

CPV是一種對柑橘產業具有毀滅性的病毒性病害，目前我國已在從摩洛哥引進的臍血橙中發現該病害的存在，然而我國對該病害的檢測技術尚無系統的研究。因此，在國內建立一種快速準確地鑒定CPV的方法顯得十分重要。

本研究首次在國內建立了CPV的一步法RT-PCR檢測體系。在進行一步法RT-PCR擴增時只會特異性的與CPV進行反應，而陰性對照和水對照均擴增不出目的條帶。由此，試驗結果說明本檢測體系具有特異性強、穩定性好的優點，這將為CPV檢疫工作提供技術支持，并為保障我國柑橘產業進行健康、持續、穩定的發展提供保證。

不足之處在于本檢測方法無法對樣品中的病毒含量進行定量，故尚未進行靈敏度方面的試驗。另外，同樣可以利用其他分子檢測技術對CPV進行檢測。

作者簡介：呂嬋娟，女，碩士。