菠蘿葉基愈傷組織誘導體細胞胚

摘 要：以菠蘿[Ananas conosus(L.)Merr.]吸芽上的葉基部組織為材料，研究了2，4-D、NAA、BA、TDZ在菠蘿愈傷組織誘導體細胞胚過程中的影響。結果表明，2，4-D在體細胞胚誘導過程中起著極為重要的作用，其適宜濃度為5mg/L，適當濃度(1mg/L)的BA在降低畸形胚比例和增加體細胞胚發生率方面有重要作用，但BA也會促進愈傷組織分化不定芽；低濃度的TDZ與BA效果相似，在不同生長調節物質處理組合中，MS+0.01ms/LTDZ+5mg/L2，4-D培養基的體細胞胚發生率最高(97％)。低濃度NAA(2～5mg/L)利于非胚性愈傷組織的增殖，而高濃度的NAA雖能促進體細胞胚發生，但這種體細胞胚很難繼續增殖，在萌發時只生根不發芽。成熟體細胞胚在MS+0.2％活性炭上30d時的轉株率為22.7％。

關鍵詞：菠蘿；愈傷組織；體細胞胚

中圖分類號：S668.3 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－59－05

菠蘿是世界三大熱帶果樹之一，也是我國主要熱帶果樹之一。自20世紀70年代以來，國內外許多學者對菠蘿離體培養經器官發生途徑再生植株開展了廣泛的研究，而通過體細胞胚發生途徑得到菠蘿再生植株的研究則是最近幾年才開始。Sripaoraya等首次用毒莠定(picjoram)從Phuket種的離體培養無菌苗葉片經胚性愈傷組織誘導得到了體細胞胚，其體細胞發生率為58％；FiroozabadY等以Smooth Cayenne的無菌苗為材料，采用毒莠定與賽苯隆(Thidiazuron)組合比較了不同培養條件及愈傷組織形態對體細胞胚發生的影響，使體細胞胚發生率亦在55％左右。但這些研究報道均以無菌苗為誘導材料和使用非常用的生長調節物質，體細胞胚發生率也較低，且未見對體細胞胚進行組織細胞學分析。國內迄今尚未見對菠蘿的體細胞胚發生的研究報道。本研究以廣東菠蘿主栽品種之一神灣吸芽葉基為材料，使用2.4-D、BA、NAA等常用植物生長調節物質及其他培養基附加成分對菠蘿體細胞胚發生過程、形成規律及其組織細胞學的鑒定等方面進行了的探索，希望以此建立起簡單、高效的菠蘿體細胞胚誘導系統，為菠蘿遺傳轉化和低成本快速繁殖等提供技術支撐。

1 材料和方法

1．1 材料

供試菠蘿品種為神灣，采自華南農業大學園藝學院園藝場。

1．2 方法

1．2．1 愈傷組織誘導和增殖 在晴天采下莖基粗0.5cm以上、發育正常的吸芽帶回實驗室，將衰老葉片從基部完全剝除，用自來水將吸芽沖洗干凈，離吸芽生長點上方約0.5cm處切斷所有葉片。將吸芽先以2％NaClO預消毒10min，無菌水沖洗3次；再以0.1％HgCl消毒8min，無菌水沖洗3次；以稍帶部分吸芽組織的形式切取每片著生在吸芽上的白色葉基，并將該葉基以0.1％HgCl消毒5min，無菌水沖洗3次，接種在MS+2.0mg/L BA+2.5mg/L NAA上進行愈傷組織誘導，4周后切下愈傷組織轉到增殖培養基(MS+3mg/L BA+2mg/L NAA)，每3周進行1次繼代培養。

1．2．2 體細胞胚的發生與萌發 取增殖培養上的愈傷組織，切成約3mm×3min×3mm(長×寬×厚)大小接種于體細胞胚誘導培養基上，每瓶接種8塊愈傷組織，重復6次，在黑暗條件下培養40d，統計體細胞胚發生率、體細胞胚發生量和不定芽發生情況等。挑取愈傷組織表面的體細胞胚分別置于無激素MS上，培養30d后，觀察體細胞發育情況并統計體細胞胚萌發率。

1．2．3 組織形態學觀察 將材料浸于FAA中固定24h，按常規石蠟切片法制片，用番紅一蘇木精對染。切片在Mitotic B1 Series雙筒顯微鏡觀察拍照。體細胞胚等的表面形態在Mitotic ZM 140 Series雙筒體視鏡下觀察拍照。

1．2．4 培養條件 本實驗所有培養基均以MS(Murashige and Skoog，1962)為基本培養基，除另有注明外，還添加有3％蔗糖、7g/L瓊脂(固體培養基)，pH5.8。非胚性愈傷組織的保持增殖及體細胞胚的轉株均在16h光周期(30μmol/m²·s)、(27±2)℃條件下培養，胚性愈傷組織的誘導則在暗環境下進行。

1．2．5 實驗數據統計 在培養后30d統計觀察誘導出體細胞胚的外植體數量、生成的體細胞胚數量、培養物質量、體細胞胚的生長狀況及形態，對體細胞胚發生率和發生量用SAS軟件ANOVA過程語句進行差分析，對差異顯著的處理用Student-Newman-Keuls(SNK)法進行多重比較。對培養基添加物的影響則設置不同激素水平的區組進行對照實驗。體細胞胚質量的測定則隨機抽取誘導出的體細胞胚在無激素的MS培養基上觀察萌發或增殖狀況。

2 結果與分析

2．1 植物生長調節物質對體細胞胚誘導的影響

在以菠蘿吸芽葉基愈傷組織為起始材料進行體細胞胚誘導過程中，2，4-D起著極為重要的作用。在MS+1ms/L BA培養基中，通過比較從1mg/L到11mg/L 2，4-D不同濃度梯度對體細胞胚發生率及其質量的影響發現，2，4-D最佳濃度為5mg/L，發生率可達73％，每g愈傷組織可形成約39體細胞胚(表1)。2，4-D濃度低于5mg/L時體細胞胚的發生率和發生量又會顯著降低；2，4-D濃度在7～11mg/L時體細胞胚的發生率和發生量比5 mg/L時不僅無顯著增加，而且隨著2，4-D濃度增加，愈傷組織褐化逐漸加重，畸形胚比率大幅增加，在2，4-D濃度達到或超過11mg/L時產生的體細胞胚已不能萌發。

BA對愈傷組織的體細胞胚發生的影響見表2。MS+5mg/L 2，4-D培養基中不添加BA時，愈傷組織褐化非常嚴重，誘導出的體細胞胚中畸形胚比率增加，此時約有1/3的球形胚是先長出胚根，而這些只有胚根的體細胞胚將不能繼續分化出胚芽。加入BA后，體細胞胚的發生率和發生量會明顯增加，體細胞胚的體積增大也比較明顯，尤以1mg/LBA的效果最佳。但BA的存在也會同時促進愈傷組織分化不定芽，影響體細胞胚發生的專一性。

用低濃度的TDZ代替BA作為細胞分裂素配合高濃度的2，4-D后，其體細胞胚發生率和每g愈傷組織形成的體細胞胚數量與使用BA時無明顯差異，TDZ的最適濃度為0.01mg/L(表3)。但萌發檢測表明，TDZ與2，4-D組合誘導出的體細胞胚在無激素培養基上呈綠色，體積較大，生活力強。

實驗結果還顯示，NAA在低濃度(2～5mg/L)時，利于非胚性愈傷組織的增殖。很少有體細胞胚發生，在MS+Img/L BA+2～5mg/L NAA培養基中的體細胞胚發生率只有3％～10％。但高濃度的NAA能促進體細胞胚發生，當NAA濃度達到10mg/L時，體細胞胚發生率也能達到82.4％。此時用0.1mg/LTDZ代替1mg/L BA，體細胞胚發生率沒有明顯差異，但這種高濃度NAA得到的體細胞胚多為畸形胚，很難繼續增殖，且在萌發時只生根不發芽(表3)。

2．2 體細胞胚的增殖

比較MS+2mg/L 2，4-D+1mg/L BA的固體和液體培養基對體細胞胚增殖的影響時發現，固體培養基的增殖效果明顯不如液體培養基。培養2個月后，固體培養基的平均增殖系數3.59，而液體培養基的平均增殖系數為5.04。在液體增殖培養中，需要及時將萌發的體細胞胚轉移出，否則所有的體細胞胚將快速轉向萌發。

2．3 體細胞胚的萌發

將成熟體細胞胚轉入MS基本培養上，約20d培養開始逐漸萌發成幼小植株，30d時轉株率為8.7％。MS基本培養基中添加0.2％活性炭對體細胞胚增殖及萌發的效果都明顯增加，在30d時轉株率為22.7％，同時也會促進次級胚形成，次級胚形成量為初生胚的2.04倍。椰乳會抑制體細胞胚的萌發而促進其產生次生胚，添加了椰乳(5％，v/v)的培養基平均體細胞胚萌發率僅為MS基本培養基的74％，次級胚形成量為初生胚的2.3倍。

2．4 體細胞胚的形態組織學觀察

體細胞胚發生初期通過胚柄與母體相連，發生后期胚柄細胞死亡，體細胞胚與母體植物間形成明顯的生理隔離(圖版-A、B)。體細胞胚的成熟和萌發與其他單子葉植物合子胚發育類似，都會經過一個較長的球形胚期，然后胚逐漸變橢圓，一側出現缺刻。缺刻把初葉原基與莖尖部分分開(圖版-C)，然-后胚軸延長，胚呈棒狀，胚芽鞘出現并分開，之后初葉展開，莖尖和胚根上下延伸(圖版E)，多葉片輪狀交替發生(圖版-G、H)。在液體懸浮培養中，體細-胞胚萌發的同時，往往會在胚芽鞘附近分化出次生胚(圖版G、H)。過于密集的次生胚阻礙了根的形成，如果不及時分開已經開始萌發的胚，會不利于轉株。在液體懸浮增殖培養基中，由于生長素濃度降低或缺失，體細胞胚會進一步完成發育的全過程直至萌發。體細胞胚萌發大都不均一，而且一個體細胞胚團一旦發生萌發，新生的次生胚一般都會相繼進入成熟和萌發期，而不繼續增殖，經過一段時間后，可以明顯地看到增殖和萌發的區隔化(圖版-F)。

3 討 論

眾所周知，2，4-D是誘導體細胞體發生的重要因素，為香蕉、水稻和香根草等多種單子葉植物體細胞胚誘導所必需的生長調節物質，且使用2，4-D時需要保持較高濃度。本研究表明，一定濃度范圍內的2，4-D和NAA 2種生長素類物質都能誘導菠蘿吸芽葉基愈傷組織產生體細胞胚，但從體細胞胚的發生率和質量比較來看，2，4-D的效果顯著優于NAA。適宜的2，4-D濃度是提高體細胞胚發生率和質量的關鍵因素。尤其是當2，4-D濃度控制在5mg/L左右時，對體細胞胚高頻發生起更加顯著的促進作用。2，4-D作為一種信號物質和脅迫劑。通過多種機制改變植物細胞的發育程序。如通過基因組甲基化改變基因表達，激活控制細胞分裂的細胞周期蛋白基因，改變細胞內源激素代謝和生物合成等。但2，4-D在誘導菠蘿體細胞胚發生機理方面還有待進一步探討。

在本研究中還發現，菠蘿愈傷組織一旦進入分化狀態，即使轉入無生長調節物質的MS基本培養基中，仍會分化出不定芽。在菠蘿及鳳梨科其他種類的組織培養中也發現，細胞分裂素BA是促進不定芽分化的最關鍵的因素。在菠蘿體細胞胚誘導過程中，如果培養基中沒有BA，愈傷組織褐化程度會顯著增加，得到的體細胞胚生活力低；而較低濃度的BA(0.5～1mg/L)與較高濃度2，4-D的組合有利于降低不定芽分化及其對體細胞胚發生的干擾；BA濃度超過1mg/L，則會有大量不定芽產生而使體細胞胚發生率和發生量降低。因此，在誘導菠蘿愈傷組織產生體細胞胚的過程中，如何通過避免不定芽分化保證體細胞胚發生的專一性，仍有待進一步研究。

4 結 論

本研究表明2，4-D是提高體細胞胚發生率的關鍵因素。菠蘿吸芽葉基產生的愈傷組織在MS基本培養基中，添加5mg/L2，4-D和1mg/LBA經60d培養，可誘導出大量體細胞胚，其發生率可穩定在95％以上；體細胞胚在較低濃度2，4-D的液體培養基中能獲得有效增殖，將成熟體細胞胚轉入無生長調節物質的MS基本培養基中會萌發成株。利用2.4-D和BA等常規生長調節物質所建立體細胞胚發生系統為簡單、高效獲得菠蘿體細胞胚提供了一條有效途徑。

作者簡介：何業華，男，教授，主要從事果樹生物技術方面的研究。