柑橘鱗皮病研究進(jìn)展

呂嬋娟　周常勇

摘要柑橘鱗皮病是一種分布在包括南美洲和地中海等廣大地區(qū)的重要病毒性病害，隨著大量國(guó)外優(yōu)良柑橘品種的引進(jìn)，增加了柑橘鱗皮病隨同苗木、接穗傳入我國(guó)的可能性。本文對(duì)柑橘鱗皮病的類型、研究歷史、病原、傳播方式、檢測(cè)技術(shù)以及防治方法作一綜述，為今后我國(guó)對(duì)柑橘鱗皮病的檢疫和防治研究提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞柑橘鱗皮病；鱗皮病A；鱗皮病B；檢測(cè)技術(shù)

中圖分類號(hào)S 435．131．49

柑橘鱗皮病是由柑橘鱗皮病毒(Citrus Psorosis CPV)引起的一種病毒性病害，主要分布在美洲和地中海等地區(qū)的國(guó)家，造成了十分嚴(yán)重的危害。隨著對(duì)該病害研究的深入特別是分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)外對(duì)柑橘鱗皮病有了較為全面的認(rèn)識(shí)，然而我國(guó)在柑橘鱗皮病方面尚缺乏系統(tǒng)研究。鑒于目前我國(guó)大量引進(jìn)國(guó)外優(yōu)良柑橘品種，增大了柑橘鱗皮病傳人我國(guó)的可能，因此對(duì)鱗皮病應(yīng)予以較全面研究。本文就目前國(guó)內(nèi)外柑橘鱗皮病的研究進(jìn)行綜述。

1鱗皮病的類型

一般認(rèn)為鱗皮病有鱗皮病A和B兩種類型。鱗皮病B也被稱為環(huán)斑病(ringspot)。基于具有相同或相似的嫩葉癥狀，囊膠病(concave gum)、雞冠皮病(cristacortis)和石果病(impietratura)被認(rèn)為與鱗皮病屬于同一類群，但它們的病原性質(zhì)還沒(méi)有確定；柑橘皺葉病(citrus crinkly leaf)、柑橘雜色花葉病(citrusvaregation)亦曾和鱗皮病歸于同一類群，但后來(lái)實(shí)驗(yàn)證明，它們是另外的病毒引起的。

2病害的歷史

Swingle和Webber最早于1896年在佛羅里達(dá)觀察到柑橘鱗皮病癥狀，但當(dāng)時(shí)并不了解其病因。Fawcett觀察到柑橘嫩葉出現(xiàn)花葉并伴隨樹(shù)皮鱗片的癥狀是由一種病毒引起的，并將該病毒命名為CPV。Wallace等發(fā)現(xiàn)了另一種鱗皮病癥狀，并將引起這種癥狀的病毒命名為柑橘環(huán)斑病毒(Citrusringspot virus，CRSV)。CPV和CRSV在葉片和樹(shù)皮上表現(xiàn)類似的癥狀，但各自的嚴(yán)重程度不同，過(guò)去常被視為不同的病害，但現(xiàn)在已被視為同一種病害。

Wallace報(bào)道鱗皮病A和鱗皮病B間具有交叉保護(hù)作用，即在感染了鱗皮病A的植株上接種鱗皮病B，癥狀會(huì)明顯減輕。

3病原

CPV屬于新成立的蛇形病毒屬(Ophiovirus)，病毒粒子具有裸露的線形核衣殼，直徑約3 nm，可形成卷曲的環(huán)(內(nèi)部可能有盤(pán)繞)。Derrick等報(bào)道該病毒粒子包含了T、B兩個(gè)組分，其中T組分的長(zhǎng)度為300～500nm，B組分為1 500～2 500nm，它們能在不同的蔗糖濃度梯度下被分離，能編碼包含48kD的衣殼蛋白(CP)，只有這兩部分同時(shí)存在時(shí)病毒才具有侵染性。隨后的研究表明CPV至少包含3個(gè)組分，即T1RNA、T2RNA和BRNA，基因組總長(zhǎng)11～12kb，分別為1．6～1．8kb、1，5kb、7．5—9．0kb。T1RNA包含一個(gè)ORF，編碼由476個(gè)氨基酸組成的分子量約54kD的衣殼蛋白；T2RNA包含一個(gè)ORF，編碼含436個(gè)氨基酸、分子量約49kD的衣殼蛋白；BRNA則包含兩個(gè)ORF，分別編碼280kD和24kD的衣殼蛋白。

4寄主范圍和癥狀

柑橘鱗皮病主要危害甜橙、寬皮柑橘和葡萄柚等。鱗皮病A引起寄主主干和大枝樹(shù)皮呈鱗片狀開(kāi)裂，木質(zhì)部充膠變色，春、秋梢嫩葉呈現(xiàn)橡形葉癥狀以及沿葉脈褪綠斑紋，少數(shù)春梢會(huì)表現(xiàn)較輕的休克癥狀，隨葉片老化后癥狀消失；鱗皮病B引起老葉亦顯環(huán)斑癥狀，果實(shí)呈現(xiàn)環(huán)形凹陷斑，樹(shù)皮癥狀蔓延快，小枝上呈現(xiàn)木栓化，隆起的浸膠斑點(diǎn)。另外有報(bào)道在加利福尼亞和南美洲等一些地方，一些被柑橘鱗皮病侵染后的植株并不表現(xiàn)癥狀。

5病害傳播

鱗皮病除嫁接傳播外，還可通過(guò)機(jī)械方法從柑橘向柑橘或草本植物傳播。Campiglia等報(bào)道，在烏拉圭的250株枳橙上有1％表現(xiàn)了鱗皮病癥狀，從而表明鱗皮病可以通過(guò)種子進(jìn)行傳播。另外，Levy等報(bào)道CPV可通過(guò)微內(nèi)藏菟絲子(Campestrissubinclusa)在柑橘與草本植物間進(jìn)行傳播。柑橘鱗皮病在阿根廷、烏拉圭、印度等國(guó)家的自然傳播仍然未完全得到證實(shí)，但在阿根廷，蚜蟲(chóng)是可能的潛在自然介體。

6防治方法

通過(guò)指示植物鑒定，莖尖嫁接脫毒或熱處理獲得無(wú)鱗皮病母樹(shù)，培育無(wú)病苗木可以有效防治此病。由于囊膠病可以通過(guò)枳和枳橙的種子傳播，砧木種子、母樹(shù)也需要通過(guò)鑒定無(wú)病方可使用。

7檢測(cè)方法和技術(shù)

7．1指示植物鑒定

Wallace首次用柑橘苗作為指示植物鑒定鱗皮病A。常用的木本指示植物有鄧肯葡萄柚、墨西哥來(lái)檬、甜橙和香櫞等。其中，甜橙是最佳的指示植物，癥狀主要表現(xiàn)為新生葉片褪綠斑駁，呈黃色的環(huán)斑和污斑，明脈和葉脈環(huán)阻等；常用的草本指示植物有昆諾藜、美麗菜豆、黑眼豇豆等，癥狀表現(xiàn)為接種葉上產(chǎn)生局部壞死枯斑。研究表明，木本指示植物接種后的前28d對(duì)癥狀的表現(xiàn)至關(guān)重要，低溫更容易促進(jìn)癥狀的表現(xiàn)，如鱗皮病A在白天最高溫度24—27℃，夜間最低溫度18～21℃時(shí)癥狀表現(xiàn)最為明顯。

7．2血清學(xué)鑒定

Clark等利用雙抗體夾心ELISA法(DAS-ELISA)，隨后又運(yùn)用三抗體夾心ELISA(TAS-ELISA)法對(duì)CPV進(jìn)行檢測(cè)。在意大利，人們利用DAS-ELISE和TAS-ELISE對(duì)田間苗圃進(jìn)行CPV的實(shí)測(cè)。Garcia等制備了多種CPV的多克隆和單克隆抗體，并使用來(lái)自佛羅里達(dá)的CtRSV-4的抗血清對(duì)美國(guó)、阿根廷、西班牙、意大利的20個(gè)不同的CPV株系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該方法可以檢測(cè)出大部分株系。但由于該病毒存在多個(gè)株系和血清型，所以血清學(xué)的方法均不能同時(shí)檢測(cè)鱗皮病的所有株系。130nghia等用直接組織點(diǎn)免疫法(DTBIA)對(duì)CPV進(jìn)行了檢測(cè)。

7．3分子雜交

Barthe等發(fā)展了基于CPV衣殼蛋白基因(CPG)的分子雜交檢測(cè)技術(shù)，利用32P-CDN探針檢測(cè)出來(lái)自加利福尼亞的CPV-4和CPV-6等株系。Martin等，在其基礎(chǔ)上利用探針檢測(cè)出柑橘環(huán)斑病株系P-121。

7．4PCR檢測(cè)方法

Garcia等對(duì)CtRSV-4的cDNA片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，并由此設(shè)計(jì)了一對(duì)引物用于檢測(cè)柑橘鱗皮病的CtRSV-4、CpSAV90—1—1和其他4個(gè)來(lái)自美國(guó)和阿根廷的柑橘鱗皮病分離株。Legarreta根據(jù)T1RNA和BRNA的部分序列設(shè)計(jì)出了兩對(duì)引物，結(jié)果TI—引物能檢測(cè)出23個(gè)來(lái)自阿根廷、美國(guó)自西班牙和意大利的分離株。同年，Barthe等克隆了CPV的CPGESJ，并發(fā)展了基于CPG序列的PCR檢測(cè)方法，分別擴(kuò)增出了600 bp的部分CPG序列和1 317bp完整的CPG。隨后Legarreta等又在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展了半巢式RT-PCR，根據(jù)CPV的RNAl設(shè)計(jì)了一對(duì)半引物對(duì)來(lái)自阿根廷的6個(gè)株系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明這6個(gè)株系具有很高的同源性，這種方法與常規(guī)PCR相比具有更高的靈敏度。最近，Martin等根據(jù)CPV的RNA3設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，建立了一步法RT-PCR，大大縮短了PCR的時(shí)間。

綜上所述，國(guó)外對(duì)柑橘鱗皮病的研究起步早，現(xiàn)對(duì)柑橘鱗皮病的發(fā)生和檢測(cè)技術(shù)的研究已比較成熟，而國(guó)內(nèi)除中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所病毒組應(yīng)用指示植物鑒定該病害外，尚未涉及該病害的分子檢測(cè)研究。鑒于該病害的危險(xiǎn)性以及植物檢疫工作快速檢測(cè)的需要，加強(qiáng)對(duì)柑橘鱗皮病的研究，建立一套快速、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，對(duì)我國(guó)柑橘優(yōu)良品種的引進(jìn)和推廣安全，防止柑橘鱗皮病在我國(guó)的進(jìn)一步擴(kuò)散，確保我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和對(duì)外貿(mào)易的順利進(jìn)行等方面具有重要意義。