微型磁筆快速提取動植物ＤＮＡ

摘 要 目的：探索用微型磁筆進行動植物DNA快速提取與電泳鑒定的實驗研究。方法：取菜葉OAR或人類全血0．1mL、磁珠懸液0．25mL，選擇性結合DNA、洗滌、洗脫、電泳即得。本法不需離心，不用大量檢材，用微型磁筆在離心管中微量操作，分離純化DNA只需30mln，電泳只需50nlln。結果：可以觀察到清楚明亮的DNA條帶，使學生同時掌握了正規DNA提取和瓊脂糖電泳二項技能。結論：本方法是對分子生物學、醫學遺傳學實驗的一大改進，它操作簡捷直觀、降低了實驗成本，提升了實驗水平，使得高純度DNA的提取實驗今后可以在大學、中學的生物學、遺傳學實驗室進行，給更多的學生和教師、科研人員參與生傘科學的研究提供了機會。

關鍵詞 微型磁筆 磁珠 DNA鑒定 瓊脂糖電泳

中圖分類號 Q-337

文獻標識碼E

生命物質的提取是研究生物體內大分子及其運動規律的首要前提，用微型磁筆和磁珠進行DNA的分離純化屬第三代生命物質的先進的提取方法。

磁珠是一種包被有生物活性基團的功能化載體，它兼有液體的流動性和固體磁性顆粒材料的雙重特點，從而使固—液相的分離變得十分方便快捷。

微型磁筆的出現和應用，給生命科學的研究提供了一種新的手段和武器，也給大、中學生對DNA的直觀認識提供丁一個簡捷、客觀的實驗途徑。

1 材料和設備

1．1 檢材

香菜葉、芹菜葉、洋蔥、花菜、白色花瓣、各種花蕊、干燥野菊花、玉米、大豆胚胎、人類EDTA抗凝全血，可任選一種，優選使用花蕊和菜葉。注：不推薦使用雞血，因禽流感等動物病毒較多，所以在一般情況下學生實驗盡量不使用血液制品，若必須實驗，建議到醫院化驗室或血站聯系無傳染病毒的人類血液。

1．2 試劑

A磁珠懸液，B洗滌液1，C洗滌液2，D洗脫液(該4種試劑已事先封裝在1．5mL的離心管EP中)，電泳緩沖液母液，電泳指示液，電泳級瓊脂糖，細胞裂解液。

1．3 設備

微型磁筆，微量移液器，吸頭，多用架，1．5mL離心管(EP管)，電泳槽，凝膠盒，6齒梳，60V直流電源，紫外線燈箱，水浴箱，6孔塑料點滴板，微型渦流振蕩混勻器。

2 實驗原理

細胞裂解液是一種蛋白變性劑，可使動植物的細胞膜裂解，并使與DNA結合的蛋白質變性，DNA游離釋放，磁珠可以特異性地吸附DINA，通過洗滌，去除DNA以外的RNA、蛋白質、多糖、脂質、色素等雜質，再用洗脫液解離吸附在磁珠上的DNA，得到純度很高的DNA，可用于PGR模板、基因工程等。

瓊脂糖是一種鏈狀多糖，它的載樣凝膠在緩沖液中接通直流電源的情況下，帶負電荷的DNA分子可通過瓊脂糖凝膠中的網孔從負極向正極泳動，由于凝膠中的熒光染料分子可插入DNA分子的2個堿基之間，在紫外線的照射下，可呈現出桔紅色的熒光。

3 磁筆提取DNA方框圖(以植物為例)

吸取香萊葉濾液0．2mL放入A管中，混勻5min→插入磁筆吸附磁珠→磁珠在B管、C管中各洗滌15min→再吸附磁珠到D管中溫育10min→吸棄磁珠，DNA保留→進行電泳鑒定。

4 電泳方框圖

5uL電泳指示液與50uLDNA洗脫液混合→加樣→把凝膠轉人電泳槽中→開啟電源，電泳→取出凝膠沖洗→放人紫外線燈箱中→觀察鑒定結果。

5 實驗前準備

5．1 分組設計

若全班50個學生，2人為一實驗小組，共25小組，2人中1人主管操作，1人監督提示。每5小組編為一個電泳大組。

5．2 檢材準備

提前1h準備。取香菜葉3-5g，在研缽內研磨成粗絲狀，加入裂解液15mL，用研磨棒攪磨均勻，然后放入水浴箱中的隔板上，恒溫60t，水浴30min。期間每隔10min攪勻一次。30min后用2層紗布把液體過濾到一個小燒杯內，得濾液約7mL，可供全班使用。

5．3水浴箱準備

實驗前1h開啟，恒溫60~65℃，放人多孔或網狀隔板(供插入1．5mL離心管用)，加水量與隔板面相平。

5．4 電泳緩沖液準備

取電泳緩沖液母液40mL，加蒸餾水至400mL，即成電泳緩沖液使用液，供全班使用。

5．5 提取用具準備

實驗前10min，把移液器、微型磁筆及A、B、C₁、C₁、D5個離心管擺放在多用架上，并把直流電源、電泳槽、紫外線燈箱放在有電源插頭的地方。

5．6 制電泳凝膠塊

提前30min準備，供全班使用。取1包電泳級瓊脂糖(已放在盒中，每包1．35g)，放人250mL的三角燒瓶中，加蒸餾水150mL，水浴98℃，時間約30min，使瓊脂糖徹底溶解成無色透明的黏稠溶液，取出后，加入有機熒光染料液搖勻，緩緩傾人到5個插有6齒梳子的制膠板盒中，膠液面與盒上緣相平。約1h后膠液完全凝固，再慢慢撥出梳子，可看到清晰完整的6個上樣膠孔，在凝膠前端切個小角作標記，依次為1、2、3、4、5、6泳道，每小組占用一個泳道，第6泳道作為空白陰性對照。5塊凝膠板可供全班5個電泳大組使用。

6 DNA提取操作步驟

現以香菜葉提取為例，其他檢材仿此操作。

6．1 磁珠結合

用移液器吸取香菜葉濾液0．2mL，加入到離心管A中(1．5mLEP管)，振蕩混勻15秒鐘，室溫下放置6min，其間每隔3min輕輕搖晃EP管數下混勻內容物。

6．2 磁分離

從多用架上取下磁筆，下撥磁筆滑桿，緩緩插入到EP管中，使磁珠全部吸附到磁筆頭部。

6．3 洗滌

慢慢從A管中取出磁筆，緩緩插入到B管中，上撥磁筆滑桿，并輕輕晃動筆頭，使磁珠釋放到洗滌液中，用磁筆頭部輕輕攪勻15s，再下撥磁筆滑桿吸附磁珠后取出，插入到C管中，重復洗滌一次。

6．4 洗脫

從C管中取出吸附有磁珠的磁筆，放在多用架上(保持下撥磁筆滑桿狀態)，使磁珠在筆頭上干燥3min。再把磁筆插入到D管中，上撥滑桿，使磁珠釋放，用筆頭混勻磁珠15 9，取出磁筆，閉合EP管上蓋，插入到水浴箱隔板上，65℃溫育10min，其間每隔3min搖晃EP管數下混勻內容物。

10min后取出EP管，立即插入磁筆，下撥滑桿，吸凈磁珠后取出，純化后的DNA存留在D管上清液中供作電泳鑒定用。

7 電泳鑒定操作步驟

7．1 指示液點樣

把瓊脂糖凝膠(連同膠框)水平放置在桌面上，吸取藍色的電泳指示液51xL，在點滴板孔中各點成一個小圓點，共6個圓點。

7．2 DNA上樣

仔細吸取D管中的洗脫液50gL，小心加到藍色圓點上，慢慢抽吸2次混勻，準確地注入到膠塊上的小孔內，每個小孔代表一個泳道，第6泳道為空白陰性對照(請換用新吸頭吸取50蒸餾水代替DNA)。泳道排列順序從膠塊切角端算起，分別作為1、2、3、4、5、6泳道，各小組要記清楚自己的泳道。

7．3 電泳

把膠塊(連同膠框)放到電泳槽中間的托板上，上樣孔一端朝向電源的負極端(一定要放準，因DNA帶負電，向正極泳動)，再向電泳槽中慢慢傾入電泳緩沖液使用液，使液面剛好浸沒膠塊為準。開啟直流電源開關，電壓50-60V，電流15-20mA，電泳時間40min，電泳儀有5路輸出，可供全班5個電泳組同時使用。

7．4 鑒定

電泳40min后，關斷電源，戴上一次性手套取出膠塊，慢慢把凝膠塊推出到手掌中，在自來水下輕輕沖洗5s，再把凝膠塊放到紫外線燈箱中的玻璃板上，關閉箱門，打開電源開關，從箱體上方的窗口上即可看到膠塊泳道上的桔紅色DNA條帶。用瓊脂糖電泳鑒定DNA，是目前國內外通用的科學鑒定方法。

8 結果

8．1 微型磁筆提取植物DNA電泳圖及紫外分光光度計檢測結果(圖1、表1)