核酸探針技術(shù)

摘 要 著重對(duì)核酸探針的標(biāo)記物、種類、檢測(cè)原理等作出總結(jié)，并對(duì)它的應(yīng)用前景作出展望。

關(guān)鍵詞 RNA探針 單鏈DNA探針 雙鏈DNA探針 核酸探針

中圖分類號(hào) Q-49

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 Ｅ

核酸探針是指一段用放射性同位素或其他標(biāo)記物(如酶與熒光素等)標(biāo)記的DNA片段、單鏈DNA和RNA等。

核酸探針具有特定的序列，能夠與具有相應(yīng)核苷酸堿基互補(bǔ)序列的核酸片段結(jié)合，因此可用于樣品中特定基因片段的檢測(cè)。

1 核酸探針的標(biāo)記物

1．1 放射性標(biāo)記

放射性同位素是最早使用、也是目前應(yīng)用最廣泛的探針標(biāo)記物。常用的同位素有³²p、³H、³⁵S。其中，以³²p應(yīng)用最普遍。

放射性標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，可以檢測(cè)到pg級(jí)；缺點(diǎn)是易造成放射性污染，而且同位素半衰期短、不穩(wěn)定、成本高。因此，放射性標(biāo)記的探針不能實(shí)現(xiàn)商品化；目前，許多實(shí)驗(yàn)室都致力于研究非放射性標(biāo)記的探針。

1．2 非放射性標(biāo)記

目前應(yīng)用較多的非放射性標(biāo)記物是生物素和地高辛，二者都是半抗原。

生物素是一種小分子水溶性維生素，對(duì)親和素有獨(dú)特的親和力，兩者能形成穩(wěn)定復(fù)合物，通過(guò)連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì)(如酶、熒光素等)進(jìn)行檢測(cè)。

地高辛是一種類固醇半抗原分子，可利用其抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)，運(yùn)用原理類似于生物素的檢測(cè)。地高辛標(biāo)記核酸探針的檢測(cè)靈敏度可與放射性同位素標(biāo)記時(shí)相當(dāng)，而特異性優(yōu)于生物素標(biāo)記，其應(yīng)用日趨廣泛。

2核酸探針檢測(cè)的原理

核酸探針檢測(cè)所依據(jù)的是核酸分子雜交，其工作原理是堿基配對(duì)，即2條堿基互補(bǔ)的DNA鏈(或2條堿摹互補(bǔ)的DNA鏈和RNA鏈)在適當(dāng)條件下可以按堿基配對(duì)原則，形成雜交DNA分子。

已知每個(gè)生物體的各種性質(zhì)和特征都是由其所含的遺傳基因所決定的，例如一種微生物的病原性就是由于這種微生物含有并表達(dá)了某個(gè)或某些有害的基因而產(chǎn)生的。從理論上講，任何一個(gè)決定生物體特定生物學(xué)特性的DNA序列都應(yīng)該是獨(dú)特的。如果將某一種微生物的特征基因DNA雙鏈中的一條進(jìn)行標(biāo)記，例如用nP同位素標(biāo)記，即可制成DNA探針。由于DNA分子雜交時(shí)嚴(yán)格遵守堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，通過(guò)考查待測(cè)樣品與標(biāo)記性DNA探針能否形成雜交分子，即可判斷樣品中是否含有此種微生物，并且還可以通過(guò)測(cè)定放射性強(qiáng)度考查樣品中微生物數(shù)量。

3 核酸探針的種類及制備方法

根據(jù)核酸的來(lái)源和性質(zhì)，核酸探針可分為RNA探針、人工合成的寡核苷酸探針、單鏈DNA探針、雙鏈DNA探針等幾類。

3．1 RNA探針

RNA探針一般都是單鏈，它具有單鏈DNA探針的優(yōu)點(diǎn)，又具有許多DNA單鏈探針?biāo)鶝](méi)有的優(yōu)點(diǎn)，主要是：RNA：DNA雜交體比DNA：DNA雜交體有更高的穩(wěn)定性，所以在雜交反應(yīng)中RNA探針比相同活性的DNA探針?biāo)a(chǎn)生信號(hào)要強(qiáng)。RNA：RNA雜交體用RNA酶A(胰RNA酶)切比用S1酶切DNA：RNA雜交體容易控制，所以用RNA探針進(jìn)行RNA結(jié)構(gòu)分析比用DNA探針效果好。

RNA的探針制備過(guò)程是將一段含完整或部分基因的DNA片段插人重組質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，以內(nèi)切酶在插入片段中某一適當(dāng)部位或插入片段下游的某一部位消化重組質(zhì)粒，使之成為線性DNA，然后在相應(yīng)的DNA依賴性RNA聚合酶催化下，以含有目的基因的DNA片段為模板合成RNA探針。

3．2 人工合成的寡核苷酸探針

人工合成的寡核苷酸探針是在已知基因序列的情況下，由核酸合成儀來(lái)完成，可廉價(jià)獲得大量的此類探針，長(zhǎng)度一般長(zhǎng)約10～30bP，甚至可達(dá)50bp。如果已知核酸序列可根據(jù)已知DNA或RNA序列合成精確互補(bǔ)的DNA探針，單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準(zhǔn)確配對(duì)，可以準(zhǔn)確地設(shè)計(jì)雜交條件，以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對(duì)序列雜交，對(duì)于一些未知序列的目的片段則無(wú)效；如果不知道核酸序列，可依據(jù)其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸順序推導(dǎo)出核酸序列從而合成DNA探針。

人工合成的寡核苷酸片段作為核酸雜交探針應(yīng)用十分廣泛，對(duì)于檢測(cè)靶基因上單個(gè)核苷酸的點(diǎn)突變和小段堿基的缺失或插入尤為適用。

3．3 單鏈DNA探針

用雙鏈探針雜交驗(yàn)測(cè)另一個(gè)遠(yuǎn)緣DNA時(shí)，探針序列與被檢測(cè)序列之間有很多錯(cuò)配，但是，2條探針互補(bǔ)鏈之間的配對(duì)卻十分穩(wěn)定，即形成自身的無(wú)效雜交，結(jié)果使檢測(cè)效率下降。科學(xué)上采用單鏈探針則可解決這一問(wèn)題。單鏈DNA探針的合成方法主要有下列2種：

(1)從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針。合成單鏈DNA探針可將模板序列克隆到M13噬菌體載體中，以此為模板，以特定的通用引物或以人工合成的寡核苷酸為引物，在[a-³²p]-dNTP的存在下，由Klenow片段作用合成放射標(biāo)記探針，反應(yīng)完畢后得到的是部分雙鏈分子。在克隆序列內(nèi)或下游用限制性內(nèi)切酶切割這些長(zhǎng)短不一的產(chǎn)物，然后通過(guò)變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)將探針與模板分離開(kāi)。雙鏈RF型M13DNA也可用于單鏈DNA的制備，選用適當(dāng)?shù)囊锛纯芍苽湔溁蜇?fù)鏈單鏈探針。

(2)以RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈eDNA探針。eDNA單鏈探針主要用來(lái)分離cDNA文庫(kù)中相應(yīng)的基因。用RNA為模板合成eDNA探針?biāo)玫囊镉邢铝?種。

①用寡聚(dT)為引物合成eDNA探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA，并且產(chǎn)生的探針極大多數(shù)偏向于mRNA3·末端序列。

②可用隨機(jī)引物合成eDNA探針。該法可避免上述缺點(diǎn)，產(chǎn)生比活性較高的探針。但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子，所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復(fù)雜很多，應(yīng)預(yù)先盡量富集mRNA中的目的序列。

反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物RNA／DNA雜交雙鏈經(jīng)堿變性后，RNA單鏈可被迅速地降解成小片段，經(jīng)SephadexG-50柱層析即可得到單鏈探針。

3．4 雙鏈DNA探針

雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列2種：切口平移法和隨機(jī)引物合成法。

切口平移法是目前實(shí)驗(yàn)室中最常用的一種DNA探針標(biāo)記方法，用此法標(biāo)記的核苷酸的摻入率可達(dá)20％-30％。其原理是利用DNA聚合酶I能修復(fù)DNA鏈的功能。方法是先由DNasel在雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口，這樣E．coli DNA聚合酶I就可將核苷酸連接到切口的3’羥基末端。同時(shí)該酶具有從5＇→3＇的核酸外切酶活性，能從切口的5＇端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時(shí)又在切口的3·端補(bǔ)上核苷酸，從而使切口沿著DNA鏈移動(dòng)，用放射性核苷酸代替原先無(wú)放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺说胶铣尚骆溨小Ｗ詈线m的切口平移片段一般為50～500個(gè)核苷酸。

隨機(jī)引物法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種較理想的標(biāo)記方法，具有操作簡(jiǎn)便、標(biāo)記活性高、適用范圍廣等特點(diǎn)，有取代切口平移法標(biāo)記DNA探針的趨勢(shì)。其原理是隨機(jī)引物(一般指含有各種排列的寡核苷酸片段的混合物，此混合物可人工合成，一般長(zhǎng)度為6個(gè)核苷酸殘基)能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在DNA聚合酶的催化下，遵循堿基互補(bǔ)原理，按5＇→3＇方向合成一條新的DNA鏈，其核苷酸順序與模板DNA完全互補(bǔ)。另一單鏈DNA模板分子，同樣合成一條新的完全互補(bǔ)的DNA鏈。在反應(yīng)體系中加入4種dNTP，其中一種帶放射性核素標(biāo)記的核苷酸，在合成反應(yīng)中摻入到新合成的DNA分子中，使合成的DNA帶有放射性核素。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)純化即可得到標(biāo)記好的DNA探針。該法標(biāo)記化合物摻人率高達(dá)70％～80％。

雙鏈DNA探針在與靶序列雜交前，DNA分子必須變?yōu)閱捂湥@一般是通過(guò)加熱使其變性而達(dá)到解鏈目的。解鏈DNA分子被迅速冷卻到只能緩慢復(fù)性的溫度以下，可使探針保持單鏈狀態(tài)。

4 核酸探針的應(yīng)用前景

在癌基因的檢測(cè)和診斷、致病病原體的檢測(cè)、遺傳病的產(chǎn)前診斷以及親子關(guān)系鑒定等基因診斷方面以及特異性目的基因及外源DNA的檢測(cè)方面，核酸探針技術(shù)將越來(lái)越顯出其巨大的應(yīng)用前景。

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