肝癌細胞下調IGF-1活性因子對Ras癌基因誘導小鼠肝腫瘤影響分析

劉洪琪，李憲忠

(濰坊學院醫院醫務部,山東濰坊 261061)

肝癌是一種極為嚴重的惡性腫瘤，其發病率在同類疾病中高居第5位，病死率極高，據統計其死亡人數年均高達百萬，對人們的生命造成了極大威脅，基于此探究肝癌發病機制已經成為醫學研究者普遍關注的問題[1-3]。機體免疫系統的破壞是惡性腫瘤產生的直接原因，免疫系統所產生的淋巴細胞能夠對腫瘤細胞起到破壞作用，進而抑制其生長擴散，最終發揮免疫作用。胰島素生長因子(insulin-like growth factors，IGF-1)是一種與腫瘤有緊密聯系的具備較多生理功能的細胞因子，它來源于機體較多器官和組織細胞，其中肝臟所分泌的IGF-1占絕大部分[4-7]。有研究證實，IGF-1能夠對B淋巴細胞的增殖和抗體的產生起到促進作用，但機制尚不明確； 在肝癌患者發病過程中，臨床表現的淋巴細胞水平降低及功能減弱等情況表明，IGF-1的分泌與肝癌的發生也有一定聯系[8]。本實驗通過研究肝癌細胞下調活性因子對Ras癌基因誘導小鼠肝腫瘤的影響，檢測小鼠IGF-1、外周血B淋巴細胞、活性B淋巴細胞及其他因子的水平，分析對腫瘤發生、發展的影響及機制，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取本院實驗中心3、5、9月齡Ras癌基因誘導雄性小鼠各10只，同時選取非轉基因3、5、9月齡雄性小鼠各10只，所選小鼠體質量平均(28.52±3.61)g，飼養環境：室溫21～27 ℃；溫差低于4 ℃；空氣濕度35%～65%；每12小時變更晝夜狀態，每小時空氣更換不低于10次；保持空氣流通，環境干凈，氨濃度不高于14 mg/m3；噪聲不高于60分貝。實驗動物許可證SYXK(京)2015-0012。

1.2藥物及儀器 FIVP3000型流式細胞儀，杭州思創醫療器械公司；SVP生物化學分析儀，廣州博泰醫療器械公司；E-5200電泳儀，石家莊華康醫療器械公司；5%胎牛血清(批號:12091621)，上海恒瑞醫藥股份有限公司；免疫發光試劑，批號:12090151，西安立邦制藥有限公司；蛋白測定試劑盒(批號:20040772)，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

1.3方法

1.3.1樣本采集 解剖Ras轉基因鼠取其肝腫瘤組織及周圍組織，解剖非轉基因鼠，取其肝組織作為對照組，將所取組織制作成1 cm3組織塊，置于低溫、液氮環境下封存，提取兩組樣品總RNA和蛋白質，以便后期測量不同因子所用。

1.3.2方法及指標 蛋白質印跡法對其細胞外信號調節激酶(ERK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)蛋白表達進行檢測；檢測時針對不同組織采用多樣本、多時間段測量，計算其平均水平。蛋白質印跡法：選取制作好的樣品置于冰盒上，并調整不同樣品盒濃度至相同，沸水處理4～6 min，對樣品加孔處理并注入所用試劑，置于電泳槽中，通電電泳2～3 min，等待蛋白轉膜完成后，抽取聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，蛋白一面朝上置于5%脫脂奶粉中，浸潤均勻后取出，從一側邊緣添加入緩沖液3 mL，勻速搖動至均勻，再使用辣根過氧化物(HRP)標記山羊抗兔二抗，室溫培養，沖洗后使用發光試劑盒顯影，在圖像處理軟件輔助下，對顯影條帶光密度進行分析，統計蛋白表達數據。

PCR對IGF-1、GHR、IGFBP3的mRNA表達水平進行檢測；檢測時針對不同組織采用多樣本、多時間段測量，計算其平均水平。引物序列IGFBP3(F:CGA GTG ACC GAT TCC AAG TT)；GHR(F:ATC CCA CAT CAC TGG CAA AC)；IGF-1(F:TGC CCA AGA CTC AGA AGT CC)；PCR反應條件：94 ℃，5 min，循環1次；94～72 ℃，1 min，循環40次。酶聯免疫法對小鼠血清IGF-1水平進行檢測。酶聯免疫法：在酶標板上加入樣品提取液，密封后常溫培養0.5 h，稀釋、洗滌后進行加酶處理，再加入顯色劑避光顯色8～10 min。加入終止液15 min后進行測定，空白處為0，在450 nm波長下依次依序測量吸光度值(A值)。以橫坐標：標準物濃度，縱坐標：A值繪制標準曲線，結合樣品濃度及稀釋倍數，通過計算得出樣品實際濃度。

檢測Ras癌基因誘導小鼠及非轉基因小鼠外周血中B淋巴細胞、活性B淋巴細胞水平。流式檢測：選取小鼠白細胞懸液平均置于4支離心管做離心處理，時間3～4 min，倒出上清渾濁液體，在離心管中加入B淋巴細胞、活化B淋巴細胞檢測試劑，混合均勻后4 ℃下避光培育0.5 h，用緩沖液洗滌細胞，滴入5%胎牛血清磷酸鹽緩沖液重懸細胞，過濾處理后置于流式細胞儀檢測分析。

2 結 果

2.1不同組織及對照組ERK、PI3K、AKT蛋白平均表達水平比較 Ras癌基因誘導小鼠腫瘤組織ERK、PI3K、AKT蛋白平均表達水平與腫瘤周圍組織比較，差異有統計學意義(P<0.05)；Ras癌基因誘導小鼠腫瘤組織ERK、PI3K、AKT蛋白表達水平與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ERK、PI3K、AKT蛋白平均表達水平比較

a:P<0.05,與腫瘤組織比較

2.2不同組織及對照組IGF-1、GHR、IGFBP3的mRNA平均表達水平比較 Ras癌基因誘導小鼠腫瘤組織IGF-1、GHR、IGFBP3的mRNA表達水平與腫瘤周圍組織比較，差異有統計學意義(P<0.05)；Ras癌基因誘導小鼠腫瘤組織IGF-1、GHR、IGFBP3的mRNA表達水平與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 IGF-1、GHR、IGFBP3的mRNA平均表達水平比較

a:P<0.05,與腫瘤組織比較

2.3不同月齡小鼠血清IGF-1水平比較 3月齡Ras癌基因誘導小鼠血清IGF-1水平與非轉基因小鼠比較無明顯差異(P>0.05)；5、9月齡Ras癌基因誘導小鼠血清IGF-1水平均低于非轉基因小鼠，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3不同月齡小鼠血清IGF-1水平比較

表4 小鼠B淋巴細胞、活性B淋巴細胞占淋巴細胞比例比較

2.4不同月齡小鼠B淋巴細胞、活性B淋巴細胞占淋巴細胞比例比較 3、5、9月齡Ras癌基因誘導小鼠B淋巴細胞比例均低于非轉基因小鼠，差異有統計學意義(P<0.05)；3、5月齡Ras癌基因誘導小鼠活性B淋巴細胞比例與非轉基因小鼠比較無明顯差異(P>0.05)；9月齡Ras癌基因誘導小鼠活性B淋巴細胞比例低于非轉基因小鼠，差異有統計學意義(P<0.05),見表4。

3 討 論

IGF-1是機體內生長激素刺激所產生的一種激素，它不僅在細胞分化與增殖、機體生長發育中有著重要作用，與腫瘤的發生也存在著緊密聯系，其基因所包含的外顯子能夠轉錄、翻譯相應產物[9-11]。人體腎臟、腦、脾胃等組織都能夠產生并分泌IGF-1因子，但85%以上的因子由肝臟合成分泌。

本研究表明，肝癌組織中GHR mRNA、IGF-1 mRNA平均表達水平較肝癌周圍組織明顯降低，表明GHR、IGF-1水平下降。由于IGF-1是GHR表達的靶基因，加上機體IGF1是肝臟細胞在生長激素刺激下表達分泌的，可以推斷Ras癌基因誘導肝腫瘤發生是GHR、IGF-1水平下降所導致，這與文獻[12-13]的研究結果一致。肝癌組織中IGFBP3 mRNA平均表達水平升高，說明IGF-1在受到GHR調控的同時也受到IGFBP3的調節，IGFBP3在機體蛋白類物質中占85%左右，它能夠抑制IGF-1與相應受體的結合，因此IGFBP3能夠抑制IGF-1的產生。Ras癌基因誘導小鼠腫瘤組織ERK、PI3K、AKT蛋白平均表達水平較其他組織明顯升高，這就表明在肝腫瘤細胞中Ras的活化刺激了ERK通路，由于ERK對IGFBP3的表達有抑制作用，而IGFBP3能夠抑制IGF-1的產生，因此ERK通路的活化最終對IGF-1的表達起到抑制作用[14]。IGF-1在機體造血過程中發揮著重要作用，它通過對骨骼生長及骨密度的調控作用，最終調節造血細胞量，并直接影響多種造血細胞的發育。本研究結果顯示，3、5、9月齡Ras癌基因小鼠B淋巴細胞比例均低于非轉基因小鼠，可能是因為IGF-1能夠促進原B淋巴細胞分化最終成為前B淋巴細胞；同時IGF-1也是B淋巴細胞增殖的促進劑，IGF-1能夠促進骨髓、脾臟B淋巴細胞的增殖。有研究發現IGF-1對骨髓中B淋巴細胞發展有重要作用，且IGFBP3能夠抑制B淋巴細胞的增殖。體液中，IGF-1能夠增強B淋巴細胞產生抗體，由此可見，IGF-1在機體免疫原力形成方面有著重要作用，IGF-1 表達的降低致使其分泌量減少，同時也減弱了對B淋巴細胞的增殖及活性的促進，進而導致了腫瘤的發生、發展[15]。

綜上所述，IGF-1的表達的抑制，降低了PI3K、AKT、GHR的表達，提高了ERK、IGFBP3的表達，進而導致Ras癌基因通路的活化。