瓊枝白化病病原菌分離與鑒定

中圖分類號：R372 文獻標志碼：A 文章編號：1004—6755（2025）10—0005—03

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2025.10.001

Abstract：Betaphycus gelatinus ice-ice disease often occurs in the Betaphycus gelatinus cultivation area of Haiwei Town， Changjiang Li Autonomous County，Hainan Province，which seriously affects its yield. To investigate the etiology of Betaph ycus gelatinus ice-ice disease，pathogenic studies were conducted on the disease B. gelatinus. From a dominant strain EB24O3，which underwent 16S rRNA gene phylogenetic tree analysis and physiological and biochemical analysis，it was identified as Catenovum algicola. Further artificial infection confirmed that the bacterium is the ice一ice disease pathogen. For the first time，it has been discovered that there is a direct relationship between seaweds and ice-ice disease. The research results will help to further understand the pathogenic mechanism of ice-icedisease，which is of great significance for the study of ice-ice disease and willfurther promote the prevention and control of ice—ice disease.

Key words：Betaphycus gelatinus ; ice-ice disease; pathogen identification;catenouulum algicola

瓊枝（Betaphycusgelatinus）是一種熱帶、亞熱帶大型經(jīng)濟海藻屬于麒麟菜家族中瓊枝屬的代表物種。該種分布在中國、日本琉球群島等地區(qū)，在我國僅分布于南海部分海域[2]。瓊枝營養(yǎng)成分豐富且富含多糖類物質(zhì)[3]

冰樣白化病（ice一icedisease），是麒麟菜族主要病害[4]。2008年我國海南省陵水黎安港的異枝麒麟菜發(fā)現(xiàn)冰樣白化癥狀，種苗死亡率達到90% 以上。研究表明，引發(fā)麒麟菜冰樣白化病的因素較多，如環(huán)境、生物等[4-5]，其中病原微生物[也與其白化現(xiàn)象有關[7-8]。

近年來，在海南瓊枝養(yǎng)殖區(qū)時常發(fā)生瓊枝白化病，對瓊枝產(chǎn)量造成嚴重影響。本研究通過對瓊枝病灶組織的微生物分離、鑒定及致病性驗證試驗，明確其病原學特征。

1材料與方法

1.1 試驗材料

2024年2月在海南省昌江縣海尾鎮(zhèn)的瓊枝栽培區(qū)（ 19^°59^′N ， 108^°47^′E） ，采集發(fā)生白化的瓊枝。

1.2 病原菌的分離與純化

取病樣藻體白化部位，研磨，吸取上清進行濃度梯度稀釋，吸取 10^-3～10^-7 5 梯度各 100μL 涂布于 2216E 固體平板上，置于 28°C 下培養(yǎng)3～5d ，挑選不同菌落形態(tài)菌株用 2216E 平板劃線純化至菌落形態(tài)完全一致。

1.3 菌株致病性測定

將分離得到菌株分別培養(yǎng)至 ，離心，收集菌體，備用。取健康瓊枝WT的分枝 2g ，每個試驗組3株，置于500mL 無菌海水中，分別加入不同菌株重懸液，7d更換一次無菌海水，在溫度 24^°C 、光照強度110μmol/（m²?s）^-1 、光周期 12L：12D 下培養(yǎng)，以不添加菌懸液為對照，觀察瓊枝白化狀況。

1.4 病原菌回歸感染測定

選取預試驗致病性最強的菌株，采用方法

1.3感染瓊枝。觀察記錄瓊枝的藻體顏色、瓊枝發(fā)病程度及產(chǎn)生時間，并取白化部位進行病原菌的重分離與鑒定。

1.5病原菌表型與生化特征鑒定

觀察菌株在平板上的菌落形態(tài)等特征，對細菌進行革蘭氏染色，觀察染色結(jié)果，同時參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第8版）進行生理生化特性測定。

1.6 病原菌16SrRNA基因序列的擴增與測序

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組，使用16SrRNA的通用引物（27F和1492R），進行PCR擴增，其產(chǎn)物送至生物工程（上海）股份有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與致病性測試

從瓊枝白化樣本中篩選不同菌落形態(tài)的菌株，共獲得20種細菌，其中菌株EB2403的致病性最強。

2.2 菌株EB2403回歸感染測定

菌株EB2403感染瓊枝結(jié)果如表1所示。第4天， 1.8×10⁵ CFU/mL組瓊枝的枝條開始白化，第6天半數(shù)瓊枝白化，第12天該組全部白化，6. 9×10⁴ CFU/mL組第6天開始白化，第12天全部瓊枝白化，但出現(xiàn)白化的面積低于1.8×10⁵ CFU/mL組。對照組的瓊枝未出現(xiàn)白化癥狀。

根據(jù)柯赫氏法則，從白化瓊枝再分離的菌株通過菌落形態(tài)特征和 基因序列比對分析，確認該菌株為菌株EB2403。

表1菌株EB2403回歸感染瓊枝白化情況統(tǒng)計

2.3菌株EB2403菌落特征與形態(tài)特征

菌株EB2403在2216E平板上菌落呈現(xiàn)不透明乳白色，邊緣不平整圓形，表面光滑濕潤，革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陰性菌，菌株呈桿狀。

2.4 菌株EB2403生理生化特征

菌株EB2403對硝酸鹽還原呈陽性反應，精氨酸雙水解酶反應為陽性，脲酶反應陽性，產(chǎn)生b一半乳糖糖甙酶、堿性磷酸鹽酶反應為陽性，酯酶C4酶反應陽性、酸性磷酸酶反應呈陽性、萘酚一AS一BI一磷酸水解酶反應陽性、N一乙酰一葡萄糖胺酶反應陽性、丙三醇、七葉靈檸檬酸鐵、 D- 巖藻糖和L一巖藻糖、同化葡萄糖和葡萄糖酸化、同化甘露醇、同化蘋果酸和同化檸檬酸呈現(xiàn)反應陽性。

2.516SrRNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株EB2403的16SrRNA基因序列長度為1359bp，通過EzBioCloud網(wǎng)站進行對比分析，菌株EB2403與Catenovulumalgicola（GenBank登錄號OP493183.1）同源性最高 99.6% ，且聚為一支，如圖1所示。綜合上述結(jié)果，可以認定菌株EB2403為海藻鏈卵菌（Catenovulumalgicola）。

3 結(jié)果與討論

影響麒麟菜白化現(xiàn)象的原因有很多，環(huán)境因子[7、人為因素、海洋生物[8等都可以造成藻體患病白化。微生物也是引起藻體白化的重要因素。

在白化的紅藻（Deliseapulchra）中Thalas-somonas屬、Aquimarina屬的桿菌和Marinomonas屬的細菌豐度高于健康藻體[9。研究發(fā)現(xiàn)白化的長心卡帕藻中存在海洋芽孢桿菌和弧菌以及假單胞菌[10]。另外，在藻體中還發(fā)現(xiàn)海洋螺菌目、桿菌目、假單胞菌目的嗜冷桿菌屬、交替單胞菌等，其分泌卡拉膠降解酶，可導致藻體產(chǎn)生白化[11]。本研究首次發(fā)現(xiàn)海藻鏈卵菌EB2403可感染瓊枝，使其白化，最終腐爛死亡。綜上所述，對海藻鏈卵菌深人研究對完善瓊枝白化病的病原菌和闡明其致病機制具有重要意義。

參考文獻：

[1」匡梅，曾呈奎，夏邦美.中國麒麟菜族的分類研究[J」.海洋科學集刊，1999（0）：168—189，235—236，243—248.

[2]何翠翠，張文，魏志遠，等.海南省海藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展形勢與對策[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學，2019，39（9）：107-113.

[3]李繼偉，楊賢慶，潘創(chuàng)，等.瓊枝麒麟菜的營養(yǎng)成分分析與評價[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（15）：265-269.

[4」馬藝丹，唐磊，王一帆，等.瓊枝白化特征及其附生菌群多樣性分析[J].中國海洋大學學報（自然科學版），2024，54（5）：52-62.

[5]LIJ，MAJZOUBME，MARZINELLIEM，etal.Bacterialcontrolled mitigation of dysbiosis in a seaweed disease[J].TheInternational Society of Microbiological Ecology Journal，2022，16（2）：378-387.

[6]ACHMADM，ALIMUDDINA，WIDYASTUTIU，etal.Mo-lecular identification of new bacterial causative agent of ice-icedisease onseaweed Kappa phycus aluarezii[J].PeerJPreprints，DOI：10.7287/peerj. preprints.2016vl.

[7]張劍，徐步欣，郎尚昆，等.海南文昌沿岸大型海藻資源變化及其影響因素分析[J].海洋湖沼通報，2022，44（3）：129-138.

[8]吳鐘解，陳石泉，張光星，等.海南省麒麟菜自然保護區(qū)麒麟菜資源研究[J].海洋環(huán)境科學，2016，35（2）：221—225，242.

[9]THOMAST，EVANSF，SCHLEHECKD，etal.Commu-nity structure and functional gene profile of bacteria onhealthyanddiseasedthalliofthered seaweed Deliseapul-chra[J].FrontiersinMicrobiology，2o15，6：469.

[10]RIYAZSUMOHAMMED，NALINIS，KAVITHAG，etal.Characterization and Identification of Isolated Bacteria FromIce-iceDiseaseInfected Seaweed（KappaphycusAlvarezii）[J].Chemicalsamp;.Chemistry，2019，48（8）：1286-1290.

[11]SURM，DI，DM，etal.Microbiomeintheice-icedis-ease of the farmed red algae Kappaphycusaluarezii anddegradation of extracted food carrageenan[J].Food Biosci-ence，2021，42：101138.

（收稿日期：2025-07-07）