基于差異代謝物篩選茶芎片的初加工方式

中圖分類號 R93.4；R97 文獻標志碼 A 文章編號 00-0408（05）-37-06

DOI 0.6039/j.issn.00-0408.05..05

ABSTRACT OBJECTIVE To screen the primary processing methods of Ligusticum sinense slice based on differential metabolites，and provide theoretical basis for the scientific processing of L . sinense. METHODS Using 13 groups of L . sinense slice processed by fresh-cutting or traditional methods as samples，UHPLC-QE-MS was employed for metabolite identification. Multivariate statistical analysis was applied to screen differential metabolites among the 13 sample groups，analyzing the effects of washing，soaking，drying methods，and drying cycles on both the relative expressions of differential metabolites and the contents of carboxylic acids and their derivatives in the samples（to reflect the total amino acid content）. RESULTS Principal component analysis and partial least squares-discriminant analysis both showed significant intergroup differences among the 13 sample groups. A total of 688 differential metabolites were screened from the 13 sample groups，with carboxylic acids and their derivatives showing the highest proportion. The relative expression levels of phosphatidylcholine significantly increased after washing treatment， while tryptophan expression significantly decreased after soaking treatment. Samples dried at showed significantly increased expression of psoralen，whereas those dried at 40^°C showed significantly decreased expression of methyl-pmethoxycinnamate. Both washing and soaking treatments significantly reduced the total amino acid content in samples，while secondary drying significantly increased it. The three controlled-temperature drying methods maintained relatively stable total content of amino acids in samples. CONCLUSIONS The optimal processing protocol for L . sinense slice is as follows： fresh L .sinense slice should be freshly cut at the production site， undergo quick washing after soil removal，and be dried twice at 40^°C （before and after slicing）.

KEYWORDS Ligusticum sinense；untargeted metabolomics； fresh processing； traditional processing； differential metabolites；processing methods

茶芎古稱撫芎，為傘形科植物茶芎Ligusticum. si‐nense Oliv. cv. Chaxiong 的干燥根莖，具有活血行氣、祛風止痛的功效[1]。茶芎傳統(tǒng)加工要求的浸潤操作可能存在局限性，且加工過程中水洗、干燥次數(shù)、干燥方式等工藝也無定則，不能穩(wěn)定地控制成品質量。趁鮮切制是指中藥材不經浸潤等二次處理，采收完直接在產地切制并干燥成飲片[2]。趁鮮切制不改變藥材性質，卻能減少加工工序和成本，提高飲片生產效率，該切制方式已被證實在細辛、人參等根及根莖類藥材中有一定適用性[3―4]。由此可見，研究茶芎產地趁鮮切制工藝并與傳統(tǒng)加工模式進行對比，證實其生產適用性，對茶芎的質量控制具有重要意義。

非靶向代謝組學通過在特定條件下定量篩選代謝物的種類與含量，能夠大范圍地捕捉、鑒定樣品中的小分子物質，已被廣泛運用于中藥材品質評價等領域[5—6]。2008年版《省中藥飲片炮制規(guī)范》只將總灰分、酸不溶性灰分、阿魏酸含量等作為茶芎質控指標，不能較好地反映茶芎飲片質量[7]。而非靶向代謝組學則可以更加全面、動態(tài)地反映茶芎在初加工過程中的生理變化。基于此，本研究擬通過超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜聯(lián)用（UHPLC-QE-MS）技術，對采用傳統(tǒng)及趁鮮切制工藝制備的茶芎片進行代謝組學分析，通過解析其代謝差異物篩選出最佳的工藝流程，為特色藥材茶芎的科學加工提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括：Q-ExactivePlus 型質譜儀 、SuperModulyo 型 冷 凍 干 燥 機（美 國 Thermo FisherScientific 公司），NexeraX2LC-30AD 型超高壓液相色譜儀（日本Shimadzu公司），GZX-9076MBE 型電熱鼓風干燥機（上海博迅實業(yè)有限公司），LT-DHC160型高速冷凍離心機[立德泰勀（上海）科學儀器有限公司]，350-8519型萬分之一分析天平（長沙湘平科技發(fā)展有限公司），KQ-200KDB 型高功率數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

新鮮茶芎植株于2023年7月6日采自省武寧縣魯溪鎮(zhèn)北屏村（東經 115^°11^′35.246^′′ ″，北緯 29^°28^′43.957\". ），本研究所用樣品經慕澤涇副研究員鑒定為真品。乙腈、甲醇、甲酸均為質譜純，水為超純水。

2 方法

2.1 不同方式加工樣品制備

選取長勢相近的健康茶芎植株，除去地上部分作為待處理樣品。將待處理樣品分為“趁鮮切制”和“傳統(tǒng)加工”2類，去泥后，以水洗、浸潤、干燥次數(shù)、干燥方式等處理差異細分為13組樣品（ [c1-C13] ），每組6個重復。切片時茶芎厚片的厚度均為 3～4mm ，均晾至表面無水汽（約3 h）[8]后再干燥。加工后飲片打粉過4 號篩，備用。茶芎樣品的加工方式詳見表1。

表1 茶芎樣品的加工方式

2.2 供試品溶液及質控樣品溶液的制備

精密稱取樣品 0.050g ，投入 5mm 鎢珠，加 200μL 預冷的甲醇-水 溶液并混勻，在研磨機中（頻率 65Hz ）研磨 1min ；再加 800μL 預冷的甲醇-水（4∶1，V/V） 溶液并混勻，冰浴中超聲（頻率 40kHz ，功率 480W）1h，-20^°C 靜置1 h，然后在 4^°C 下以 14000×g 離心20min ，回收上清液并濃縮至干燥。質譜測定時加入200μL 預冷的甲醇-水 （1：1，V/V） 溶液復溶， 4°C 下以20000×g 離心 15min ，取上清液得質量濃度為 250mg/mL 的供試品溶液。每份供試品溶液移取 50μL 并混勻，作為質控（quality control，QC）樣品溶液。

2.3 色譜條件

采用 ACQUITYUPLC^?HSST3（2.1mm×100mm_? ，1.8μm ）色譜柱，以 0.1% 甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（ 0～2min ， 100%A ； 2～6min ，100%A?52%A ； 6～10min ， 52%A ； 10～12min ， 100%B ；12～12.1min，100%B100%A;12.1～15min，100%A） ；柱溫為 40^°C ；流速為 0.3mL/min ；進樣量為 2μL 。

2.4 質譜條件

采 用 加 熱 電 噴 霧 電 離（heated electrospray ionization，HESI）離子源，在正、負離子模式下檢測，噴霧電壓為正離子 3.8kV 、負離子 3.2kV ；毛細管溫度為 320^°C ；鞘氣流速為 30arb ，輔助氣流速為5 arb；探針加熱器溫度為 350^°C ；S-Lens 射頻水平為50；檢測范圍為質荷比（m/z）70～1 050;M S 分辨率為 70000（m/z200） ）， MS² 分辨率為 17500（m/z200）， ）；MS的最大注入時間為 100ms ，MS² 的最大注入時間為 50ms 。

2.5 樣品測定

將13 組樣品按“2.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.3”“2.4”項下色譜、質譜條件進樣測定，每進樣6個待測樣品后注入1次空白樣品溶液（ 75% 乙腈水溶液）和QC樣品溶液。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用MS-DIAL 軟件對原始數(shù)據(jù)進行峰對齊、峰面積提取和保留時間校正后，將數(shù)據(jù)導入Markerview 1.2.1軟件進行去噪、峰提取、峰對齊、峰識別和歸一化等數(shù)據(jù)預處理。通過二級譜圖匹配（質量偏差 lt;0.01Da ）和精確質量數(shù)匹配（質量偏差 lt;10ppm ）初步鑒定代謝物結構，通過檢索質譜數(shù)據(jù)庫（https：//massbank.eu/）、人類代謝組數(shù)據(jù)庫（http：//www.hmdb.ca）等公共數(shù)據(jù)庫進一步確認代謝物準確信息。以SIMCA 13.0軟件進行多元統(tǒng)計分析，包括偏最小二乘法- 判別分析（partial leastsquares discriminant analysis，PLS-DA）和 主 成 分 分 析（principal component analysis，PCA）。基于 PLS-DA 模型獲得變量重要性投影（variable importance in projec‐tion，VIP）值，基于t檢驗分析各代謝物在13組樣品中的差異并得到 P 值，然后以 VIPgt;1、Plt;0.05 為標準篩選差異代謝物。采用聚類分析識別相似的初加工模式，通過分析VIP 值排前50 名的差異代謝物的相對表達量來解析代謝譜的顯著性差異特征。兩組間比較時，基于組間差異變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）和相應代謝集的PLS-DA模型得到VIP 值，篩選符合 FClt;1/1.5 或 FCgt;1.5/1 ，且VIPgt;1，Plt;0.05 的兩組間差異代謝物，分別從水洗（C1vs. C5）、浸潤（C11 vs. C10）、干燥方式（C5 vs. C6、C5 vs.C7、C5 vs. C8、C5 vs. C9、C5 vs. C13）、干燥次數(shù)（C5 vs.C10）角度進行兩組樣品間的單變量統(tǒng)計分析。由于羧酸及其衍生物含量決定了總氨基酸含量，而氨基酸可作為茶芎代謝組的主要活性物質[9]，因此，本研究以羧酸及其衍生物在兩組間代謝集的上調差異代謝物中的比例變化反映樣品中總氨基酸含量，分別考察水洗、浸潤、干燥次數(shù)、干燥方式等處理對茶芎片綜合質量的影響。

3 結果

3.1 代謝物檢測結果

在正、負離子模式下與數(shù)據(jù)庫匹配的代謝物分別有1 256、528個。由于在正離子模式下匹配到的代謝物完全覆蓋了在負離子模式下得到的代謝物，且在多元統(tǒng)計分析中正離子模式下檢測到的參數(shù)預測性和可信度較負離子模式下更高，故本研究在后續(xù)的統(tǒng)計分析中均采用正離子模式下獲得的數(shù)據(jù)。各樣品在正離子模式下的總離子流圖見圖1。

3.2 PCA結果

PCA結果（圖2）顯示，同組樣品基本相互聚集，不同組樣品呈現(xiàn)明顯分離趨勢。這說明同組樣品的代謝成分均一性控制良好，不同組樣品的代謝成分存在較大差異。QC樣品成分相近，在PCA得分圖中心處匯聚，表明測定過程中無明顯誤差，方法穩(wěn)定性及樣品代謝組數(shù)據(jù)穩(wěn)定性均良好。

3.3 不同樣品間差異性比較

PLS-DA得分圖（圖3）顯示，因變量可解釋率 （R²Y） 、模型預測能力 （Q²） 分別為0.987 和0.95，均接近1，說明模型穩(wěn)定性和預測性良好。結果顯示，13組樣品間分離較明顯。

圖2 不同初加工方式茶芎片的代謝物PCA得分圖

為避免建模時過擬合，本研究通過置換檢驗對PLS-DA模型進行驗證，結果（圖4）顯示， R² 始終大于 Q² 且 Q² 回歸線截距為 -0.56lt;0.5 ，左端任一 R²?Q² 值均小于右端原始值，說明模型未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，保證了模型的有效性。

圖3 不同初加工方式茶芎片的代謝物PLS-DA得分圖

圖4 不同初加工方式茶芎片的代謝物PLS-DA置換檢驗圖

3.4 差異代謝物的篩選

結合總離子流圖中各成分的出峰時間， m/z 及一、二級離子碎片等信息，比對對照品、數(shù)據(jù)庫和參考文獻[10]，根據(jù)篩選標準，在13組茶芎片中共篩選得到688種差異代謝物。其中，羧酸及其衍生物類差異代謝物的占比最高 （86/688，12.50% ），該類成分也是茶芎提供營養(yǎng)、發(fā)揮療效的關鍵成分[9]。VIP值排前20名的差異代謝物信息見表2。

表2 不同加工方式茶芎片中VIP 值排前20 名的差異代謝物信息

3.5 聚類分析及差異代謝物相對表達量分析結果

選取VIP 值排前50 名的差異代謝物繪制層次聚類熱圖（圖5）。結果顯示，13 組樣品被劃分為2 類：C2、C6、C9、C12聚為較為緊湊的一類，其余組樣品聚為較為分散的另一類。該結果說明，C2、C6、C9、C12 這4 組樣品具有高度同質的生物學特性。

13 組樣品間VIP 值排前50 名的差異代謝物的相對表達量差異顯著。水洗組（C1）樣品中磷脂酰膽堿的相對表達量顯著高于不清洗組（C5），其中以磷脂酰膽堿（ （16：0/16：0） 的相對表達量差異最顯著。不浸潤組（C10）樣品中色氨酸、吲哚-3-甲醛的相對表達量顯著高于浸潤組（C11）樣品。 50～60^°C 烘干（C7、C8）組樣品中補骨脂素的相對表達量顯著高于曬干（C5）、真空干燥（C9）、冷凍干燥（C13）組樣品，其中以補骨脂素的相對表達量差異最顯著； 40^°C 烘干（C2）組樣品中反式對甲氧基肉桂酸甲酯的相對表達量顯著低于 50～60^°C 烘干（C3、C4）組樣品， γ? -谷氨酰苯丙氨酸的相對表達量則顯著高于后者。傳統(tǒng)炕干（C12）組樣品中3-甲氧基酪氨酸的相對表達量顯著低于趁鮮切制組樣品，灰霉菌素的相對表達量顯著高于趁鮮切制組樣品。

3.6 不同處理對兩組樣品間總氨基酸含量影響的分析

3.6.1 水洗處理對茶芎片中總氨基酸含量的影響

與不清洗組樣品（C5）比較，水洗組樣品（C1）中下調的差異代謝物有148 個，其中羧酸及其衍生物類代謝物占比最高（ 33/148，22.30% ）；水洗組樣品中上調的差異代謝物有155 個，其中羧酸及其衍生物類代謝物僅占7.10% （11/155），相較其在下調差異代謝物中的比例降低了15.20 百分點，表明水洗后樣品中總氨基酸含量下降。

3.6.2 浸潤處理對茶芎片中總氨基酸含量的影響

與不浸潤組樣品（C10）比較，浸潤組樣品（C11）中下調的差異代謝物有417 個，其中羧酸及其衍生物類代謝物的占比最高 （122/417，29.26% ）；浸潤組樣品中上調的差異代謝物有294 個，其中羧酸及其衍生物類代謝物的占比為 9.18%（27/294） ），相較其在下調差異代謝物中的比例驟降了20.08 百分點，表明浸潤處理后樣品中總氨基酸含量下降較多。

3.6.3 干燥次數(shù)對茶芎片中總氨基酸含量的影響

與一次干燥組樣品（C5）比較，二次干燥組樣品（C10）中下調的差異代謝物有278 個，其中羧酸及其衍生物類代謝物的占比為 ；二次干燥組樣品中上調的差異代謝物有420 個，其中羧酸及其衍生物類代謝物的占比最高（ 25.95% ，109/420），相較其下調差異代謝物中的比例提升了14.44 百分點，表明樣品中總氨基酸含量隨著干燥次數(shù)的增加而升高。

3.6.4 干燥方式對茶芎片中總氨基酸含量的影響

與曬干組（C5）比較，其他干燥方式組樣品（ C6～ C9、C13）中羧酸及其衍生物類代謝物在差異代謝物中的上、下調比例依次為： 40^°C 烘干組樣品（C6）上調17.33%（61/352） ）、下調 17.89%（34/190）;50^°C 烘干組樣品（C7）上調 17.65% （60/340）、下 調 17.07% （35/205）；60^°C 烘干組樣品（C8）上調 17.83% （51/286）、下 調14.47% （23/159）；真空干燥組樣品（C9）上調 27.06% （141/521）、下調 8.38%（29/346） ；冷凍干燥組樣品（C13）上調 9.64%（35/363） ）、下調 25.48%（92/361） 。結果表明，3種烘干模式樣品中總氨基酸含量均維持在較為穩(wěn)定的水平，其中真空干燥可使樣品中總氨基酸含量明顯升高，冷凍干燥可使樣品中總氨基酸含量明顯降低。

4 討論

本研究在進行聚類分析時發(fā)現(xiàn)，C2、C6、C9、C12 組樣品聚為相似度較高的一類。其中，C2、C6 為 40^°C 烘干組樣品，加工時的溫度略高于常溫；C9為真空干燥組樣品，其在室溫下干燥；C12為傳統(tǒng)炕干組樣品，其加工溫度在 30～45^°C 。歸納上述4組樣品共性，其干燥溫度都控制在近似于常溫的有限范圍內。

通過分析差異代謝物的相對表達量在13 組樣品中的變化可知：（1）水洗處理（代表樣品C1）可能因樣品中磷脂酰膽堿類成分酶解反應的減少而使其相對表達量顯著上調——該類成分具有疏水性[11]，水洗時其相應磷脂酶容易被沖掉；而磷脂酰膽堿有一定抗氧化作用，可以清除自由基以保護細胞[12]。這說明水洗增強了茶芎片的抗氧化潛力。（2）浸潤處理（代表樣品C10）可能因色氨酸合成相關酶的溶出而使樣品中色氨酸的相對表達量顯著下調，而色氨酸是茶芎有機酸的重要組分，屬于人體必需氨基酸，可加快機體新陳代謝、增強免疫力[9]。這說明浸潤處理減弱了茶芎片的保健功效。（3） 50～ 60^°C. 烘干處理（代表樣品 C7～C8） ）可能因高溫烘干抑制了樣品的氧化潮解進程，且補骨脂素的熱穩(wěn)定性較強[13]，故該類成分在 50～60^°C 烘干處理樣品中的相對表達量顯著上調。據(jù)報道，補骨脂素能抑制惡性腫瘤細胞增殖[14]，這說明 50～60^°C 烘干使茶芎片保留了一定的防癌生物活性。 （4）40^°C 烘干處理（代表樣品C2）使樣品中反式對甲氧基肉桂酸甲酯的相對表達量顯著下調。查閱 PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/PubChem）發(fā)現(xiàn)，反式對甲氧基肉桂酸甲酯屬于刺激性有害成分，易造成皮膚、呼吸道過敏。這說明 40^°C 烘干處理增進了茶芎片的炮制減毒效果，而相比之下， 50～ 60^°C 高溫烘干所得飲片安全性低于 40^°C 烘干樣品。（5）傳統(tǒng)炕干茶芎片（代表樣品C12）中灰霉菌素的相對表達量顯著上調，而灰霉菌素對霉菌等多種真菌起生長抑制作用[15]。這說明傳統(tǒng)炕干茶芎片更不易發(fā)霉，有利于在濕度較大環(huán)境下的長期保存。但是傳統(tǒng)加工模式所得樣品與趁鮮切制所得樣品相比，其總氨基酸含量顯著降低，其中以色氨酸尤為突出

單變量統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥所得樣品與其他干燥模式所得樣品相比，其總氨基酸含量顯著降低，推測原因如下：一是冷凍干燥過程中，冰晶升華時產生的大量微觀孔隙會破壞細胞結構，可能導致部分胞內代謝物隨升華而析出[16]；二是冷凍可能會抑制部分關鍵酶活性，使結合型成分（如苷類）無法通過酶促反應轉化為更多游離型成分（如苷元）[17]。真空干燥雖可使茶芎片中總氨基酸含量達到最高，但其高昂的處理成本不利于大規(guī)模推廣，僅適用于實驗室加工。茶芎初加工時，水洗處理是必要步驟，浸潤處理則屬于非必要步驟，但二者均可使茶芎片中總氨基酸含量顯著下降，故應縮短水洗時間且盡量避免浸潤；二次干燥樣品中總氨基酸含量明顯高于一次干燥樣品，故應盡可能選擇二次干燥處理。

綜上，本研究篩選出的茶芎片加工條件為不浸潤、少水洗、二次干燥、 40^°C 烘干，對應的最佳工藝流程如下：新鮮茶芎應在產地趁鮮切制，去泥后短時間內搶水洗，分別在切片前后進行2次 40^°C， 低溫烘干。

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（編輯：林 靜）