基于腸道菌群和代謝組學研究金剛藤膠囊治療非酒精性脂肪肝的作用及機制

摘 要 目的 探究金剛藤膠囊治療非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的作用及機制。方法 將32只SD大鼠隨機分為正常組和造模組，造模組以高脂飼料喂養構建NAFLD大鼠模型。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、阿托伐他汀組[陽性對照， 2mg/（kg?d）_?^- ]和金剛藤膠囊低、高劑量組 [0.63，2.52mg/（kg?d）] ，每組6只。采用蘇木素-伊紅染色、油紅O染色觀察肝臟病理變化；酶聯免疫吸附試驗測定大鼠血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α） ）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-18水平。應用16S rDNA 測序和非靶向代謝組學技術分析金剛藤膠囊對NAFLD大鼠腸道菌群和代謝的調控作用；基于代謝組學結果，采用Western blot法對NAFLD大鼠肝臟中核因子 κB（NF-κB）/NOD 樣受體家族蛋白3（NLRP3）信號通路相關蛋白進行檢測。結果 金剛藤膠囊可以顯著降低NAFLD大鼠TG、TC、LDL-C、AST、ALT、TNF- ??α∝ 、IL-1β、IL-6、IL-18水平，提高HDL-C水平（ ?lt;0.05 或 Plt;0.01 ），減輕肝臟細胞脂肪變性及炎性浸潤；能調節NAFLD大鼠的腸道菌群紊亂，顯著增加Oscillospira、Romboutsia兩種菌屬的相對豐度，顯著降低Blau‐tia 的相對豐度 ?lt;0.05 ）；主要通過影響次級膽汁酸生物合成、脂肪酸降解、O-抗原核苷酸糖生物合成等途徑調節代謝紊亂。Western blot法檢測結果顯示，該藥可以顯著降低 抑制因子 ∝ 的磷酸化水平和NLRP3、胱天蛋白酶1、抗體分泌細胞蛋白表達水平（ Plt;0.05 或 Plt;0.01 ）。結論 金剛藤膠囊可改善NAFLD大鼠的炎癥反應、脂質積累和肝臟損傷，調節腸道微生態及代謝紊亂，通過抑制NF- σ_κB /NLRP3信號通路發揮治療NAFLD的作用。

中圖分類號 R965；R285.5；R575 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）11-1340-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.11.09

ABSTRACT OBJECTIVE To investigate the effect and mechanism of Jingangteng capsules in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）. METHODS Thirty-two SD rats were randomly divided into normal group and modeling group. The modeling group was fed a high-fat diet to establish a NAFLD model. The successfully modeled rats were then randomly divided into model group，atorvastatin group[positive control， 2mg/（kg?d）] ，and Jingangteng capsules low- and high-dose groups [0.63 and 2.52mg/（kg?d）] ，with 6 rats in each group. The pathological changes of the liver were observed by hematoxylin-eosin staining and oil red O staining. Enzyme-linked immunosorbent assay was performed to determine the serum levels of triglycerides（TG）， total cholesterol （TC），high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C），low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C），alanine transaminase（ALT），aspartate transaminase（AST），tumour necrosis factor- α （TNF- ∝ ），interleukin- 1β （IL-1β），IL-6，IL-18. 16SrDNA amplicon sequencing and metabolomics techniques were applied to explore the effects of Jingangteng capsules on gut microbiota and metabolisms in NAFLD rats. Based on the metabolomics results，Western blot analysis was performed to detect proteins related to the nuclear factor kappa-B（NF- κB ）/ NOD-like receptor family protein 3 （NLRP3） signaling pathway in the livers of NAFLD rats. RESULTS The experimental results showed that Jingangteng capsules could significantly reduce the serum levels of TG，TC，LDL-C，AST，ALT，TNF- α ，IL- ?1β ，IL-6，IL-18，while increased the level of HDL-C，and alleviated the hepatic cellular steatosis and inflammatory infiltration in NAFLD rats. They could regulate the gut microbiota disorders in NAFLD rats， significantly increased the relative abundance of Romboutsia and Oscillospira， and significantly decreased the relative abundance of Blautia ?lt;0.05 ）. They also regulated metabolic disorders primarily by affecting secondary bile acid biosynthesis，fatty acid degradation，O-antigen nucleotide sugar biosynthesis，etc. Results of Western blot assay showed that they significantly reduced the phosphorylation levels of NF- κB p65 and NF- κB inhibitor α ，and the protein expression levels of NLRP3，caspase-1 and ASC （ Plt;0.05 or Plt;0.01 ）. CONCLUSIONS Jingangteng capsules could improve inflammation，lipid accumulation and liver injury in NAFLD rats，regulate the disorders of gut microbiota and metabolisms，and inhibit NF- κB/ NLRP3 signaling pathway. Their therapeutic effects against NAFLD are mediated through the inhibition of the NF- κB/NLRP3 signaling pathway.

KEYWORDS Jingangteng capsules；non-alcoholic fatty liver disease；gut microbiota；metabolomics；NF- κB， /NLRP3 signaling pathway

非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病（non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD）已成為世界上大部分地區最常見的慢性肝病[1]，全球患病率較高 （25%～30% ），嚴重危害人類的身體健康，并增加患者的經濟負擔[2]。NAFLD的發病機制復雜，與脂質過度積累、炎癥反應、胰島素抵抗、腸道微生物紊亂等多因素相關，且隨著NAFLD的發展，其也會導致心血管疾病、糖尿病及其他代謝性疾病的病情加重[3―4]。NAFLD發病率高、發病機制復雜，但臨床上用于治療 NAFLD 的藥物有限，因此，迫切需要基于NAFLD治療靶點開發安全、有效的藥物。

中藥菝葜為百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根莖，又名金剛藤，歸肝、腎經，具有利濕去濁、祛風除痹、解毒散瘀的功效[5]。本課題組前期研究表明，菝葜具有良好的抗炎效果[6]。以菝葜為原料的中成藥“金剛藤膠囊”臨床用于婦科炎癥疾病，療效顯著[7]。2017年中華中醫藥學會脾胃病分會發布的《非酒精性脂肪性肝病中醫診療專家共識意見（2017）》將NAFLD分為濕濁內停、肝郁脾虛、濕熱蘊結、痰瘀互結、脾腎兩虛5種證型，其中濕濁內停證的治法是祛濕化濁[8]。基于中醫對NAFLD的認知及菝葜具有的功效，筆者推測金剛藤膠囊可能具有治療NAFLD 的作用。近年來越來越多的研究表明，腸道菌群紊亂與NAFLD的發展密切相關，NAFLD患者的腸道菌群相較于健康個體發生了明顯改變[9―10]。腸道菌群失衡可通過調控能量代謝、干擾膽汁酸代謝、破壞腸道屏障功能以及引發慢性炎癥等多種機制導致NAFLD[11]。因此，本研究從腸道菌群和代謝組學角度，探討金剛藤膠囊改善高脂飲食模型大鼠NAFLD的作用及機制，以期為金剛藤膠囊增加功能主治提供科學依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠32只，6周齡，體重 （180±20）g ，由湖北省疾病預防控制中心提供，生產許可證號：SCXK（鄂）2021-0027，動物質量合格證號：422023100004606。大鼠飼養于湖北中醫藥大學SPF實驗動物中心，飼養條件：溫度 23～25^°C ，濕度 （50±10）% ，光照 12h ，自由飲水。本實驗獲得湖北中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，批準號：HUCMS00303455）。

1.2 主要藥品與試劑

金剛藤膠囊（貨號20221226）購自湖北福人藥業股份有限公司；L-2-氯苯丙氨酸對照品（批號J29IB218395，純度 ?98% ）購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈（貨號分別為67-56-1、75-05-8）均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，均為高效液相色譜級；阿托伐他汀片（貨號 202211229C）購自美國 Pfizer 公司；高脂飼料（配方占比：膽固醇 1.0% 、膽酸鈉 0.5% 、白糖 5.0% 、豬油10.0% 、蛋黃粉 5.0% 、普通飼料 78.5% ）購自武漢春玉紅實驗動物飼料有限公司；大鼠甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度 脂 蛋 白 膽 固 醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、丙氨酸轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate transaminase，AST）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號均為202306）均購自上海撫生實業有限公司；腫瘤壞死因子 ∝ （tumor necrosis factor- α ，TNF- α ）、白細胞介素 1β（interleukin- 1β ，IL- 1β ）、IL-6、IL-18試劑盒（批號分別為FU088RPR0855、FU05XR8N4134、FU064LX27417、FU04N8001009）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；核因子 κBp65 （nuclear factor kappa-B p65，NF- κB p65）、磷酸化（phosphorylation，p）-NF- κB p65、NF- σ_κB 抑制因子 α（NF-κB inhibitor α，IκBα ） ?p-IκBα 抗體（批號分別為 8242P、3033P、4814S、2859P）均購自美國CST公司；NOD樣受體家族蛋白3（NOD-like receptorfamily protein 3，NLRP3）、抗體分泌細胞抗體（antibodysecreting cells，ASC）（批號分別為 A24833、A22046）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；胱天蛋白酶1抗體（caspase-1，批號22915-11AP）購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 主要儀器

5810R型高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；Milli-Q 型純水儀購自德國默克密理博公司；Spark 10M型酶標儀購自瑞士 Tecan 公司；VanquishTM Horizon 型超高效液相色譜系統、Q-Exactive HF-X 型質譜儀、Nano‐Drop 型微量分光光度計、Qubit4.0 熒光計均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；JXDC-20 型氮氣吹掃儀購自上海凈信實業發展有限公司；LNG-T88型臺式快速離心濃縮干燥器購自太倉市華美生化儀器廠；Wonbio-96C型多樣品冷凍研磨儀購自上海萬柏生物科技有限公司；MS105DU型電子天平購自瑞士Mettler Toledo公司。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

所有大鼠適應性喂養7 d后，隨機取7只大鼠為正常組，喂食普通飼料；其余25只大鼠為造模組，喂食高脂飼料構建NAFLD大鼠模型。造模6周后，與正常組比較，造模組大鼠體重顯著升高（ （Plt;0.01 ）；取1 只正常組大鼠肝臟觀察其表面呈紅褐色，同時取1只造模大鼠觀察其肝臟外觀呈彌漫性腫大，表面呈明顯灰黃色色澤，有油膩感，表明NAFLD 大鼠模型構建成功[12]。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、阿托伐他汀組（陽性對照，給藥劑量 2mg/kg） ）、金剛藤膠囊低劑量組（給藥劑量0.63mg/kg ，相當于金剛藤膠囊臨床劑量）、金剛藤膠囊高劑量組（給藥劑量 2.52mg/kg ）組，劑量根據金剛藤膠囊和阿托伐他汀的臨床給藥劑量結合大鼠體表面積折算。每組6只大鼠，采用灌胃給藥的方法給予相應的藥物，每日1 次，正常組和模型組大鼠每日灌胃生理鹽水（10mL/kg ），連續灌胃6周。給藥期間模型組及各給藥組大鼠繼續喂食高脂飼料。

2.2 樣本采集

于末次給藥后1 h，收集正常組、模型組、金剛藤膠囊高劑量組（僅選擇藥效最好的高劑量組）大鼠糞便，置于 2mL 干燥滅菌的離心管中，于－ 80^°C 冰箱中保存，進行 16SrDNA 測序和代謝組學研究。末次給藥后各組大鼠禁食不禁水 12h ，次日腹腔注射 2% 戊巴比妥麻醉后，腹主動脈取血，以 3000r/min 離心 10min ，分離上層血清。取血后于冰盤上取出肝臟組織，將部分左側肝小葉固定于 4% 多聚甲醛溶液中，其余大鼠肝臟組織及血清保存于－ 80^°C 冰箱中，用于后續檢測。

2.3 大鼠肝臟病理組織形態觀察

取“2.2”項下固定的大鼠肝臟組織，采用HE 染色、油紅O染色，置于顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織的病理形態變化，并拍照。

2.4 大鼠血脂、肝功能和炎癥指標檢測

采用ELISA 法檢測大鼠血清中的TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、TNF- α_?α∝ 、IL-1β、IL-6、IL-18水平，所有試劑盒均嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.5 大鼠腸道菌群16S rDNA測序及分析

使用DNA抽提試劑盒從“2.2”項下大鼠糞便樣本中提取腸道微生物DNA，通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 提取質量，并運用微量分光光度計檢測DNA 的濃度與純度。對 基因的 ΔV1～V9 區進行PCR 擴增，使用 2% 瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物，隨后通過磁珠法進行純化處理。純化后的樣品采用Qubit 4.0 熒光計進行濃度測定和定量分析。使用PICRUSt2（2.2.0 版本）軟件進行測序。高通量測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。隨后，利用Majorbio 云平臺（https：//cloud.majorbio.com）進行物種注釋 α 多樣性分析（包括Simpson 指數、Shannon 指數和 Chao1 指數）、β 多樣性分析[主成分分析（principal component analysis，PCA）]、物種組成（門、屬水平）差異分析等生物信息學分析。以相對豐度作為生物多樣性分析的檢測指標。

2.6 大鼠糞便代謝組學分析

2.6.1 糞便樣本處理

取“2.2”項下糞便樣本，將 50mg 糞便樣本置于 2mL 離心管中，加入研磨珠。 400μL 提取液（甲醇、水體積比為4∶1）含 0.02mg/mL 的內標（L-2-氯苯丙氨酸）進行代謝產物提取。樣本溶液于冷凍組織研磨儀研磨 6min （ ），后低溫超聲提取 0kHz ）。將樣品靜置于 -20°C 30min ，以 13000×g 在4^°C 離心 15min ，移取上清液至帶內插管的進樣小瓶中上機分析。

2.6.2 色譜與質譜條件

色譜條件：色譜柱為 ACQUITY UPLC HSS T₃ （100mm×2.1mm，1.8μm） ；流動相A為 95% 水 +5% 乙腈（含0.1% 甲酸），流動相B為 47.5% 乙腈 +47.5% 異丙醇 +5% 水（含 0.1% 甲酸），梯度洗脫（正離子： 0～3min ， 100%A 20%B ； 3～4.5min ， 20%B?35%B ； 4.5～5min ， 100%B ； 5～6.3min ， 100%B;6.3～6.4min ， 100%B?0B ；6.4～8min ， 100%A 。負離子： 0～1.5min ， 100%A?5%B ；1.5～2min ， 5%B10%B ； 2～4.5min ， 10%B?30%B ；4.5～5min ， 30%B?100%B ； 5～6.3min ， 100%B ； 6.3～ 6.4min ， 100%B100%A;6.4～8min，100%A） ）；進樣量為 3μL ；柱溫為 40^°C 。質譜條件：樣品經電噴霧電離，分別采用正、負離子掃描模式采集質譜信號；詳細參數為鞘氣流量 50arb ，輔助氣體流量 13arb ，毛細管溫度325^°C ，一級質譜分辨率 60000Da ，二級質譜分辨率7500Da ，碰撞能量 20/40/60eV ，正離子模式噴霧電壓3500V ，負離子模式噴霧電壓－ 3500V 。

2.6.3 代謝組學分析

“2.6.1”項下糞便樣本上機后，將液相色譜-質譜聯用儀的原始數據導入代謝組學處理軟件Progenesis QI進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊等，最終得到含保留時間、質荷比和峰強度等信息的數據矩陣。再采用該軟件進行特征峰搜庫鑒定，將質譜和串聯質譜信息與代謝數據庫進行匹配，質譜質量誤差設置為 lt;10ppm ，同時根據二級質譜匹配得分鑒定代謝物。利用R 語言環境下的ropls 包（1.6.2 版本）對預處理后的數據集進行多元統計分析。采用PCA 和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimi‐nant analysis，OPLS-DA）進行數據挖掘。為驗證模型可靠性，通過7折交叉驗證法評估模型穩定性。篩選出潛在生物標志物，以變量投影重要性（variable importancein projection， VIP）gt;1 、差異倍數 gt;2.Plt;0.05 篩選差異代謝物，聯合人類代謝組學數據庫（https：//hmdb.ca）和京 都 基 因 與 基 因 組 百 科 全 書（Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes，KEGG）（https：//www.genome.jp）、Python 軟件包 scipy.stats 進行相關代謝通路富集分析。為進一步探討腸道菌群與代謝組學是否有相關關系，本實驗對篩選的腸道菌群中金剛藤膠囊調節的5種主要菌屬與差異代謝物進行Spearman相關性分析。

2.7 大鼠肝臟中NF-κB/NLRP3信號通路相關蛋白檢測

基于16S rDNA 測序和代謝組學研究結果，采用Western blot法對正常組、模型組、金剛藤膠囊低劑量組、金剛藤膠囊高劑量組大鼠肝臟中NF-κB/NLRP3信號通路相關蛋白進行檢測。用蛋白裂解液提取肝臟組織蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒進行定量后加入 5× 上樣緩沖液， 80^°C 水浴 10min 備用。取 30μg 蛋白加到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上，并在PVDF膜上印跡，使用快速封閉液封閉、TBST 漂洗后，孵育不同一抗 稀釋度均為 1∶1 000，NLRP3、ASC、caspase-1 稀釋度均為 1∶2 000，GAPDH稀釋度為1∶10 000）于 4^°C 過夜；再次漂洗后加入二抗（稀釋度為1∶2 000），室溫搖床1 h；TBST洗膜后加入ECL 顯影液，檢測蛋白條帶。使用Image J 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量，以磷酸化蛋白與原型蛋白的灰度值比值表示該蛋白的磷酸化水平。

2.8 統計學方法

使用 SPSS 22.0 和 GraphPad 9.0 軟件對數據進行統計分析并作圖。符合正態分布的計量資料以 表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD- t 檢驗；不符合正態分布者以 M（P_²⁵，P_⁷⁵） 表示，多組間比較采用非參數 Kruskal-Wallis H 檢驗，進一步兩兩比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。腸道菌群相關分析中，采用Wilcoxon 秩和檢驗比較組間 α，β 多樣性指數的統計學差異，并進行Spearman相關性分析。檢驗水準 α=0.05 。

3 結果

3.1 金剛藤膠囊對NAFLD 大鼠肝臟病理組織形態變化的影響

HE染色結果顯示，正常組大鼠肝結構清晰，肝細胞排列整齊，無脂肪空泡；與正常組比較，模型組大鼠肝臟可見單位面積超1/2 的肝細胞發生脂肪變性、肝索排列紊亂、炎癥細胞浸潤等明顯病理損傷；與模型組比較，各給藥組大鼠肝細胞脂肪變性呈不同程度減輕，炎癥細胞減少。結果見圖1。

油紅O染色結果顯示，正常組肝細胞無明顯脂質沉積；與正常組比較，模型組大鼠可見肝細胞內富含脂滴空泡；與模型組比較，各給藥組大鼠肝細胞脂滴均有不同程度的減少，肝臟結構得到一定的修復。結果見圖2。

3.2 金剛藤膠囊對NAFLD 大鼠血脂和肝功能指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ALT、AST 水平均顯著升高 Plt;0.01 ），HDL-C 水平顯著降低（ （Plt;0.01 ）；與模型組比較，阿托伐他汀組、金剛藤膠囊低劑量組和金剛藤膠囊高劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ALT、AST 水平均顯著降低（ Plt;0.01. ），HDL-C水平均顯著升高（ （Plt;0.01 ）。結果見表1。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理HE染色顯微圖（ ×400 ）

圖2 各組大鼠肝臟組織病理油紅O染色顯微圖（ ×400 ）

表1 各組大鼠血脂、肝功能指標水平比較 ）

a：與正常組比較， Plt;0.01 ；b：與模型組比較， Plt;0.01 。

3.3 金剛藤膠囊對NAFLD大鼠炎癥指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠的TNF- α 、IL-1β、IL-6、IL-18 水平均顯著升高（ ?lt;0.05 或 Plt;0.01 ）；與模型組比較，阿托伐他汀組、金剛藤膠囊低劑量組和金剛藤膠囊高劑量組大鼠IL-1β（除外阿托伐他汀組）、TNF- α 、IL-6、IL-18 水平均顯著降低（ ?lt;0.05 或 Plt;0.01 ）。結果見表2。

表2 各組大鼠炎癥指標水平比較 ）

a：與正常組比較， Plt;0.01 ；b：與正常組比較， Plt;0.05 ；c：與模型組比較， Plt;0.01 ；d：與模型組比較， Plt;0.05 。

3.4 金剛藤膠囊對NAFLD大鼠腸道菌群的影響

3.4.1 大鼠腸道菌群差異性分析

在菌群多樣性組間差異性檢驗中，與正常組比較，模型組大鼠Simpson指數顯著降低（ ?Plt;0.05? ），金剛藤膠囊高劑量組則呈上升趨勢，但差異無統計學意義（ Pgt; 0.05）。與正常組比較，模型組大鼠 Shannon 指數和Chao1 指數均顯著升高（ ?Plt;0.01 或 Plt;0.05 ），而金剛藤膠囊高劑量組均呈回調趨勢，但差異無統計學意義（ Pgt; 0.05）。PCA 結果顯示，模型組大鼠離正常組大鼠距離較遠、物種差異較大，而金剛藤膠囊高劑量組大鼠距模型組較遠、物種差異較大，距正常組較近，說明給藥后NAFLD大鼠腸道菌群豐度向正常組回調。結果見圖3。

3.4.2 大鼠腸道菌群門、屬分析

由圖4可知，在門水平上，各組大鼠糞便微生物主要以 Firmicutes、Bacteroidota 為 主 ；模 型 組 的 Firmicutes、Bacteroidota與正常組、金剛藤膠囊高劑量組之間的差異并無統計學意義 （Pgt;0.05） ）。在屬水平上，相對豐度較高 的 5 種 菌 群 Blautia、Lactobacillus、Ligilactobacillus、Oscillospira、Romboutsia 與 NAFLD 的發生密切相關 。

圖3 金剛藤膠囊對大鼠腸道菌群多樣性的影響

Ⅰ：正常組；Ⅱ：模型組；Ⅲ：金剛藤膠囊高劑量組；a：與正常組比 較， Plt;0.05：0 ：與正常組比較， Plt;0.01 。

由表 3 可知，與正常組比較，模型組 Ligilactobacillus、Os‐cillospira、Romboutsia 的相對豐度顯著降低（ ?lt;0.05 或Plt;0.01 ），Blautia 的相對豐度顯著上升 ），Lac‐tobacillus 相對豐度呈下降趨勢；與模型組比較，金剛藤膠囊高劑量組 Oscillospira、Romboutsia 的相對豐度顯著升高（ （Plt;0.05） ），Blautia的相對豐度顯著降低（ ?lt;0.05） ，Lactobacillus、Ligilactobacillus的相對豐度呈上升趨勢。

圖4 金剛藤膠囊對大鼠腸道菌群門、屬水平的影響

Ⅰ：正常組；Ⅱ：模型組；Ⅲ：金剛藤膠囊高劑量組。

3.5 金剛藤膠囊對NAFLD大鼠腸道代謝組學的影響

3.5.1 PCA結果

各組在正、負離子模式下的PCA 得分圖（圖5）顯示，正常組、模型組、金剛藤膠囊高劑量組之間顯著區分，且金剛藤膠囊高劑量組更靠近正常組，表明各組大鼠糞便代謝產物存在顯著性差異。

表3 金剛藤膠囊對大鼠腸道菌群屬水平相對豐度的影響 [M（P_²⁵，P_⁷⁵），n=6]

a：與正常組比較， Plt;0.01 ；b：與正常組比較， Plt;0.05 ；c：與模型組比較， Plt;0.05 。

3.5.2 OPLS-DA結果

OPLS-DA結果顯示，共有57種代謝物發生顯著性改變。與正常組比較，模型組大鼠有41個代謝物被顯著上調（ ?lt;0.05 或 Plt;0.01 ），有 16 種代謝物被顯著下調（ ?lt;0.05 或 Plt;0.01 ）；金剛藤膠囊給藥后有54種代謝物被顯著回調，其中包括脂質和類脂分子、有機酸及其衍生物和有機氧化合物（限于篇幅，57種差異代謝物信息可掃描本文二維碼鏈接頁面中“增強出版”板塊查看附表）。

3.5.3 差異代謝物KEGG通路富集分析結果

KEGG通路富集分析結果顯示，相關代謝通路主要有次級膽汁酸生物合成（secondary bile acid biosynthesis）、脂肪酸降解（fatty acid degradation）、 .O -抗原核苷酸糖生物合成（ O -antigen nucleotide sugar biosynthesis）等（圖 6）。

3.5.4 差異菌屬與差異代謝物的相關性分析

由 圖 7 可 知 ，Romboutsia 與 Gamma-aminobutyricacid、 DG（10：0/8：0/0：0） 等9種代謝物的相對豐度呈顯著負相關關系，與 （Z） -resveratrol 4^′ ′-glucoside、 3^′ ′-adenylicacid等7種代謝物的相對豐度呈顯著正相關關系（ Φ^-（0.01 或 Plt;0.001 ）。 Oscillospira 與 saccharopine、5-hydroxy-L-tryptophan、 DG（8：0/12：0/0：0） ）、DG（ 10：0/8：0/0：0） ）等 20 種代謝物呈顯著負相關關系，與 4-oxododecane‐dioic acid 等4 種代謝物的相對豐度呈顯著正相關關系Plt;0.001 ） 。 Blautia 與 saccharopine、5-hydroxy-L-tryptophan、 .DG（10：0/8：0/0：0） ）、 DG（8：0/12：0/0：0） 等 25種代謝物的相對豐度呈顯著正相關關系，與4-oxodode-canedioic acid等3種代謝物的相對豐度呈顯著負相關關系（ Plt;0.001， ）。5種差異菌屬與差異代謝物的相關性程度與金剛藤膠囊對這些菌屬的調節趨勢相一致，表明金剛藤膠囊可能通過調節NAFLD大鼠腸道菌群改善代謝紊亂。

3.6 金剛藤膠囊對NAFLD大鼠NF-κB/NLRP3信號通路的調節作用

與正常組比較，模型組大鼠的 的磷酸化水平和NLRP3、caspase-1、ASC 蛋白表達水平均顯著升高（ ?lt;0.05 或 Plt;0.01 ）；與模型組比較，金剛藤膠囊低劑量組、金剛藤膠囊高劑量組大鼠以上指標水平均顯著降低（ ?lt;0.05 或 Plt;0.01 ）。結果見圖8、表4。

4 討論

隨著研究的深入，NAFLD發病機制從開始的“二次打擊”學說逐步變成“多重打擊”學說，包括但不限于肝臟的脂質積累、胰島素抵抗、氧化應激、炎癥因子、腸道菌群紊亂等[13―14]。

4.1 金剛藤膠囊可降低NAFLD大鼠肝臟脂肪量

血清中TG、TC、LDL-C 水平過高和HDL-C 水平降低是NAFLD的主要特征之一，并且TC水平升高反映了整體脂質代謝的紊亂。ALT 主要用于衡量肝細胞損傷的嚴重程度，AST 反映肝細胞的壞死程度，兩者在臨床上常被聯合使用，以全面評估肝功能狀態。本研究結果顯示，給予金剛藤膠囊干預可逆轉NAFLD 大鼠的肝臟細胞脂肪變性，減少脂滴面積，顯著降低NAFLD大鼠血清 TC、TG、LDL-C、ALT、AST 水平，提高 HDL-C 水平。本實驗首次探討了治療婦科炎癥療效確切的中成藥金剛藤膠囊在改善脂質積累方面的新用途，顯示金剛藤膠囊對肝功能具有改善作用，并且能夠調節NAFLD 大鼠的脂質代謝紊亂。

4.2 金剛藤膠囊可調控大鼠腸道菌群結構

腸道微生物群在緩解NAFLD上起著至關重要的作用[15]。有研究表明，與對照組比較，NAFLD 患者的Os‐cillospira 減少，而 Blautia 增加[16]。值得注意的是，Oscil‐lospira 的豐度與肝臟脂肪呈負相關，目前 Oscillospira 豐度的減少已被確定為NAFLD 發病的腸道微生物群特征[17]。Romboutsia 也被證實能夠顯著上調 TG 代謝、膽固醇代謝、胰島素抵抗等幾種代謝相關途徑[18]，并且有研究報道，腸道微生物如 Oscillospira、Romboutsia 的豐度增加會下調 NF-κB 信號通路[19―20]。本研究結果顯示，金剛藤膠囊明顯降低了Blautia的相對豐度，同時增加了Oscillospira、Romboutsia 的相對豐度；Spearman 相關性分析結果表明，Oscillospira 與 NF- κB 信號通路有關代謝物DG（10∶0/8∶0/0∶0）、 JG（8：0/12：0/0：0） 呈顯著負相關關系，Romboutsia 與 DG（10：0/8：0/0：0） 呈顯著負相關關系，Blautia 與 DG（ 10：0/8：0/0：0） ）、 DG（8：0/12：0/0：0） 呈顯著正相關關系。

4.3 金剛藤膠囊可調控大鼠糞便代謝物并抑制炎癥因子

DG 和炎癥的積累是導致NAFLD 疾病進展的關鍵因素之一[21]。研究表明，DG 可以通過激活蛋白激酶 Cε 進而激活 NF-κB 信號通路[22]。NF- κB 的激活可以促進炎癥因子的表達[23]，而TNF- α_?αααα_?βαα_?βαα_?ββαα_?βββα 、IL-1β、IL-6、IL-18 等多個細胞因子均可誘導NF- κB 的活化[24]。此前有研究表明，菝葜多酚能夠通過NF- κB 信號通路改善高脂飲食誘導小鼠的胰島素抵抗和肥胖[25]。NLRP3 炎癥小體在NAFLD發生、發展過程中起著非常關鍵的作用，已成為NAFLD的重要治療靶點[26]。NLRP3選擇性地與ASC相互作用形成復合物，當NLRP3 受到上游NF- κB 信號刺激時，可分泌炎癥因子介導炎癥反應[27]；NLRP3 炎癥小體激活，會先誘導caspase-1激活，將IL-1β前體、IL-18前體轉化為IL- 1β 、IL-18活性形式。本實驗代謝組學結果顯示，高脂飼料喂養后 DG（10：0/8：0/0：0） 和DG（ 8：0/ 12：0/0：0） ）水平顯著上升，在給藥后回調；而Western blot法實驗結果顯示，NAFLD 大鼠肝臟的 磷酸化水平和NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達上調，在給藥后其表達重新下調；同時研究結果還顯示，金剛藤膠囊顯著降低了NAFLD 大鼠血清TNF- α 、IL-1β、IL-6、IL-18 水平。以上表明金剛藤膠囊可調節NAFLD 大鼠代謝紊亂，通過抑制NF-κB/NLRP3 信號通路發揮治療作用。

綜上，金剛藤膠囊可改善NAFLD大鼠的炎癥反應、脂質積累和肝臟損傷，調節腸道微生態及代謝紊亂，通過抑制NF-κB/NLRP3 信號通路發揮治療NAFLD 的作用。本研究揭示了“腸道菌群-代謝物-炎癥通路”在NAFLD中的作用。盡管本研究揭示了金剛藤膠囊通過調節腸道菌群改善NAFLD，但還需后續采用糞菌移植技術對其進行驗證并對差異功能菌種進行深入探討。

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