均勻設計實驗法優選癲癇清顆粒提取工藝

癲癇清顆粒由膽南星、熟地黃、知母、郁金、制何首烏、白芍、石菖蒲、柴胡、紅花、水蛭10味中藥組成，是遼寧省中醫研究院的臨床經驗方[]，具有豁痰熄風、活血化瘀、開竅醒神之功效。越來越多的研究發現，癲癇清顆粒在改善認知功能[2]、保護血腦屏障[3及抗癲癇[4等方面具有多種作用。其原有的水提取工藝為：石菖蒲、郁金片提取揮發油后的殘渣與其他8味藥材加水煎煮2次，每次加水10倍量，各煎煮提取 ^2h ，濾液減壓濃縮至規定的相對密度。王光函等[5在2018年用正交試驗法，以菝葜皂昔元收率、芍藥昔收率及總多糖含量為考察指標，優選出了癲癇清顆粒的水提取工藝，共提取2次，分別為10倍量水提取2h，8倍量水提取 ^1h 。為進一步提升其制劑工藝，提高有效成分的提取率，本研究采用了均勻設計試驗法對其提取工藝進行優化。均勻設計實驗法是一種高效的實驗設計方法，與其他實驗設計方法相比，在實驗點分布、實驗次數、數據處理等方面具有顯著優勢，能在多因素多水平實驗中，以較少實驗次數獲得較優結果，因此被廣泛應用于工藝優化領域。

1儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（安捷倫）；紫外可見分光光度計（上海）。

1.2 試劑及藥品

對照品：菝葜皂苷元；芍藥昔；無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院）。膽南星、熟地黃等10味藥材均來源于亳州市匯聚堂。乙腈、甲醇（色譜純），實驗用水為屈臣氏純凈水。

2 方法與結果

2.1菝葜皂苷元含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODSC18 柱（ 4.6mm×250mm ，5μm ）；流動相：甲醇-水（ 90：10 ）；流速設定為0.8mL/min ;保持柱溫度為 30% 。

2.1.2對照品溶液制備

精確稱取一定量的菝葜皂苷元對照品，用甲醇溶解，配制成質量濃度為 0.5mg/mL 的菝葜皂昔元對照品溶液。

2.1.3供試品溶液制備

精確吸取 50mL 水提取液，加入 5mL 鹽酸，水浴回流水解 1.5h 后放涼。用 CHCl₃ 進行4次萃取，用量分別為 30mL，30mL，20mL 和 20mL 。將 CHCl₃ 萃取液合并后蒸發至干，加適量甲醇，溶解后并定容至10mL 量瓶中，搖勻。經過濾后，取出續濾液即得。

2.1.4線性關系考察

液相色譜儀中分別注入 1μL，3μL，5μL，7μL 和 9μL 的對照品溶液，根據上述色譜條件進行測定。橫坐標 （X） 為濃度，縱坐標（Y）為峰面積，進行線性回歸，得到線性方程 Y=1. 193 8X+1. 921 9，r= 0.9981 。

2.2芍藥苷含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD 柱0 4.6mm×200mm，5μm） ；流動相：乙晴-水（12：88）；檢測波長為 230nm ；柱溫為 28^°C ;流速為 0.9mL/min 。

2.2.2 對照品溶液制備

精確稱取一定量的芍藥昔對照品，加甲醇溶解后，配制成質量濃度為 0.35mg/mL 的芍藥昔對照品溶液。

2.2.3供試品溶液制備

取均勻設計實驗中提取的各水提取液，過濾，取過濾后的液體即可。

2.2.4標準曲線測定

液相色譜儀分別注入 1μL，3μL，5μL，7μL 和9μL 的對照品溶液，根據上述色譜條件進行測定，以橫坐標 （X） 為進樣量，縱坐標 （Y） 為峰面積進行線性回歸，得到線性方程， Y=1 002. 5X+45. 12，r= 0.9995 。

2.3總多糖含量測定

2.3.1葡萄糖標準溶液的配制

精確稱取葡萄糖標準品適量，用蒸餾水溶解配制成質量濃度為 1mg/mL 的葡萄糖標準儲備溶液。分別吸取 0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL 和1.0mL 的葡萄糖標準儲備液放于6個 50mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到質量濃度分別為0mg/mL_?0.004mg/mL_?0.008mg/mL_?0.012mg/mL_? 0.016mg/mL 和 0.02mg/mL 的葡萄糖標準工作液。

2.3.2 顯色反應

取6支潔凈的試管，分別加入上述不同濃度的葡萄糖標準工作液各 1.0mL 。向每支試管中加入5% 的苯酚溶液 1.0mL ，搖勻，再迅速加入濃硫酸5.0mL ，搖勻，室溫下放置 10min ，使溶液充分顯色。

2.3.3波長掃描

以空白溶液為參比，使用紫外可見分光光度計，在 400～600nm 波長區間內，對上述溶液進行光譜掃描。經掃描分析，最終確定最大吸收波長為492 nm。

2.3.4葡萄糖標準曲線制備

將上述不同濃度的溶液，用紫外分光光度計于492nm 波長處測定吸收度，以濃度 （X） 為橫坐標，吸收度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線， Y=0. 015 0X+ 0.0303，r=0.9997 。

2.4均勻設計實驗

考察指標：菝葜皂昔元、芍藥苷收率、總多糖含量；考察因素：加水量、提取時間、提取次數。每個因素選取5個水平指標，采用均勻設計表進行試驗（見表1），應用綜合加權評分法進行分析（見表2）。

表1均勻設計實驗因素水平表

表2均勻設計實驗安排及結果

采用多元線性回歸分析實驗數據，得到回歸方程： Y=0. 035A+0. 085B+0. 05C-0. 25（R²=0. 95）， 。通過軟件分析，最佳提取條件為：提取次數為3次；加水量及提取時間分別為12倍量，提取2.5h；10倍量，提取2h；8倍量，提取 1.5h □

2.5 驗證試驗

按最佳工藝進行驗證試驗，結果見表3。

表3驗證試驗結果

驗證試驗結果表明，優選的工藝穩定可行，綜合評分RSD為 0.61%（n=3） 。

3結語

在癲癇清顆粒提取工藝優選中，選擇菝葜皂昔元收率、芍藥苷收率及總多糖含量作為考察指標。

因其在癲癇治療中各有藥理作用，能協同增效，且含量高、性質穩定、檢測方法成熟，可有效衡量藥物質量與療效。本研究通過均勻設計實驗法，考察了加水量、提取時間和提取次數對癲癇清顆粒中菝葜皂昔元、芍藥苷和總多糖成分提取率的影響，得到了優化后的提取工藝。按照本次優選出的最佳工藝進行提取時，浸膏得率會有所增加，有效成分菝葜皂昔元、芍藥昔和總多糖成分的提取率也會稍有增加，但是提取次數及提取時間明顯多于原實驗工藝。后續將會進一步結合其他先進技術，深人研究癲癇清顆粒的制備工藝，以提升其品質和市場競爭力。

參考文獻：

[1］夏春鵬，齊越，董笑博，等.癲癇清顆粒通過調控NLRP3/

Caspase-1通路對阿爾茨海默病小鼠Tau蛋白的影響[J].中成藥，2024，46（12）：3968-3976

[2］楊彩瑜，李熒，齊越，等.癲癇清顆粒調控Sigma1受體抑制阿爾茨海默病模型小鼠炎癥小體研究[J].中國現代醫生，2022，60（2）：29-33，197.

[3］齊越，李昭，侯俠，等.癲癇清顆粒改善AD模型小鼠血腦屏障損傷的作用研究［J].中國藥房，2022，33（9）：1062-1067.

［4]齊越，賈冬，李紀彤，等.癲癇清顆粒對海人藻酸致癲癇大鼠行為學變化及 NF-κκB 信號通路的影響[J].中成藥，2019，41（4） ：927-929.

[5]王光函，邸子真，齊越，等.正交試驗法優選癲癇清顆粒水提取工藝[J].海峽藥學，2018，30（2）：22-24.