領鞭毛蟲Salpingoecarosetta的纖毛組裝研究

中圖分類號：Q28 文獻標志碼：A 文章編號：1002-4026（2025）04-0039-07

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）

Abstract ：To investigate the mechanismofteciliaassembly inchoanoflagellates，thisstudyfocusedonacolony-forming choanoflagellte，Salpingoecarosetta.Forthefirsttime，theciiaofSalpingoecarosettaweredisassembledviamechanical shearing，anda LiCl（lithiumchloride）-inducedciliaelongationexperimentwasconductedtoinvestigatemechanisms underlyingthedisassembly，regeneration，andassemblyoftheciliaofSalpingoecarosett.IntheLiCl-induced cilielongationexperiment，afinalmolarityof250mmol/Lwasused.Intheciliadisassemblyandregenerationexperiments， the mecanical shearingconditions were determined.Experimentalresults showthattheciliaof Salpingoecarosetta were restored to their original lengths after a mechanical force was applied on them for 120min ；moreover，LiCl-induceda ciliaelongation by more than 60% after 180min of LiCl treatment.Compared with the cold-stress-induced disassembly of the cilia of Salpingoeca roseta，the mechanical shearing methodwasfaster，moreeficient，andsimplerwith higher repeatability.Thisstudyprovidesafundamentalmethodforinvestigatingthemolecular mechanismof theciliaassemblyin Salpingoecarosetta.

Keywords：Salpingoecarosett;LiCl-inducedciliaelongation；ciliaregeneration；ciliaassembly；mechanical shearing

領鞭毛蟲是現存與動物最接近的單細胞姐妹群[1-3]，而群體形成性領鞭毛蟲（Salpingoeca rosetta）是一種生活在海洋里的領鞭毛蟲，文獻報道它的多細胞生活史可能揭示了動物多細胞的起源[47]。領鞭毛蟲在頂端具有單根纖毛，周圍環繞著一圈由肌動蛋白構成的微絨毛領圈，它的纖毛被用來感知環境、運動和捕食細菌[8-9]。群體形成性領鞭毛蟲的生活史有5種不同的形態;慢泳者、快泳者和具鞘殼細胞（thecate）、聚集成鏈的細胞和聚集成玫瑰花座形的細胞，其中前三者是單細胞類型，后兩者是多細胞類型[2.10]。不同細胞類型的群體形成性領鞭毛蟲具有不同長度的纖毛，調節纖毛發生的轉錄因子的表達水平也有所差異[8]。關于領鞭毛蟲纖毛發生調控的研究僅報道過RFX和FoxJ1對群體形成性領鞭毛蟲的影響[8」，而纖毛發生的調控機制是復雜的，其他纖毛調控機制在領鞭毛蟲中如何影響纖毛尚不清楚。纖毛延伸和纖毛脫落再生實驗是研究纖毛發生和組裝調控的重要方法，關于群體形成性領鞭毛蟲纖毛延伸的方法未見報道，脫纖毛再生僅有冷脅迫的方法。氯化鋰（LiCl）誘導細胞纖毛延伸在萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardti）中已有報道[-4]，用濃度為 25mmol/L 的LiCl處理萊茵衣藻會引起鞭毛伸長和運動能力喪失，而LiCI對領鞭毛蟲的影響未見報道。纖毛縮短受多種蛋白激酶調節[15-17]，而糖原合酶激酶 3β （ ）或腺苷酸環化酶ⅢI（AC I）的抑制被認為是LiCI作用的基礎[8-9]，鋰充當鎂的非競爭性抑制劑來抑制GSK3 的激酶活性，對 AC II-cAMP 信號通路的抑制也部分幫助了纖毛延伸。本研究嘗試用LiCI誘導群體形成性領鞭毛蟲纖毛延伸，將對LiCI處理的工作濃度、纖毛長度變化等進行初步探索，此外還將機械力切割纖毛的方法應用在領鞭毛蟲的纖毛脫落再生實驗中。對于研究各種纖毛調控機制在動物祖先中如何進化具有幫助意義。

1 材料與儀器

1.1 實驗試劑與耗材

TM 海鹽（Art.Nr.10581，TropicMarin）、胰蛋白陳（ LP0042B-500g ，OXOIDTRYPTONE）、酵母提取物（ LP0021B-500g ，OXOID YEAST EXTRACT）、甘油（ V900122?500mL ，SIGMA）、氯化鋰（LiCl，62476-100G-F，SIGMA）、一次性 0.22μm 抽濾膜（PSE75-500，Bioland） 、0.22μm 過濾頭（LOT000155704，Milipore）。

1.2 實驗儀器

小型分散機（T10 basic ULTRA-TURRAX？，德國艾卡）、小型桌面真空抽濾泵（GL-802B，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、臺式冷凍離心機（AllegraX-30R，美國貝克曼庫爾特）、全自動活細胞顯微成像系統（Nikon Ti2-E，日本尼康公司）。

1.3 實驗材料

群體形成性領鞭毛蟲（Salpingoeca rosetta，產品編碼 PRA-366，PX1，購自 ATCC），是一種海水領鞭毛蟲、太平洋居海膽桿菌（Echinicola pacifica，產品編碼CCTCC AB 209206T，購自中國典型培養物保藏中心），作為領鞭毛蟲的食物細菌共培養。

2 實驗方法

2.1 配制培養基

本實驗使用兩種基礎培養基：人工海水（artificial seawater，ASW）和完全海水培養基（seawater completemedia，SWC）。ASW可用于領鞭毛蟲饑餓處理，SWC可用于食物細菌的培養基，領鞭毛蟲的維持和傳代用質量分數 5% 的SWC補充到ASW中作為混合培養基，后續以 5% SWC表示。

ASW是將 65.8g 的TM海鹽溶解在 1600mL 超純水中，調至 pH 為7.9～8.1，定容到2L，高溫高壓滅菌30min ， 4^°C 或常溫保存。

SWC是將 24gTM 海鹽， 胰蛋白脈， 酵母提取物和 6mL50% 甘油溶解在 1600mL 超純水中，混勻后定容至 2L 。高溫高壓滅菌 30min ，冷卻后使用一次性 0.22μm 濾膜真空抽濾除菌， 4^°C 或者常溫保存[20]。

2.2 食物細菌的培養

太平洋居海膽桿菌（Echinicola pacifica）作為領鞭毛蟲的食物與領鞭毛蟲共培養，Echinicola pacifica 培養 活化是將來自 -80°C 冷凍保存的 10μL Echinicola pacifica 接入 10mL swc，以 28^°C 和 200r/min 的條件培養 30～48h 。

2.3 領鞭毛蟲的培養

群體形成性領鞭毛蟲（Salpingoecarosetta）細胞與 Echinicola pacifica共培養，在補充 5%SWC 到ASW的混合培養基中生長，每 10mL 細胞培養物加入 10μL 新活化的Echinicolapacifica，在 22^°C 和 60% 的濕度下培養 3～4d 。為了保證實驗一致性，我們采用生長對數期的細胞，細胞數量為 （5～30）×10⁵ 個 ΔmL ，每 3d 以1：9的比例轉接到新鮮培養基中以保持細胞活力。每次纖毛脫落或纖毛延伸實驗需用 100mL 對數期細胞培養物。提前將新轉接的細胞培養3d至生長對數期[21]。

2.4 清洗和收集細胞

將生長到對數期的細胞以 3400r/min 離心 5min ，除去上清液，用ASW重懸細胞;再以 3600r/min 離心 5min ，除去上清液，用 ASW 重懸細胞到所需體積[20-21]。離心前顛倒搖晃離心管 30s ，有助于將食物細菌從領鞭毛蟲上清洗下來。

2.5 機械力切割纖毛

離心后將收集的細胞重懸至 5～6mL ，轉移到 10mL 小燒杯，用分散機機械力切割纖毛，工作檔位6檔，工作時間 1min 。使用前和使用后用超純水清洗 0.5min ，切割時分散刀頭應位于液體中心[1]。以切割纖毛前的細胞作為對照，根據施加機械力處理后不同時間取 200μL 細胞用 100μL5% 戊二醛固定，具體收取的時間點分別為：處理前 、1、15、30、60、90、120min ，共收取機械力處理后 120min 為止的細胞樣本，并測量纖毛長度。

2.6 纖毛延伸

用ASW配制 1mol/L 的LiCl工作液，用 0.22μm 濾頭過濾除菌， 4^°C 保存。收集并重懸細胞后先取 200μL 細胞用 100μL 5% 戊二醛固定作為誘導前（即 0min 樣本），然后添加LiCl工作液，邊添加邊混勻，LiCl終濃度為 250mmol/L 。最后以定量體積的細胞和LiCl工作液混合誘導纖毛延伸[1，5]。纖毛延伸收取用LiCl 處理后不同時間點細胞并固定，具體收取的時間點分別為：處理前、15、30、60、90、120、150、180 min，對照組未施加處理，共收取處理后 180min 為止的細胞樣本，并測量纖毛長度。

2.7 纖毛長度的統計

細胞固定后，在配備 sCMOS相機的NikonTi2-E 顯微鏡上成像，找到視野后用40倍LWD（光源工作距離）鏡頭拍攝。拍攝圖片后，使用軟件 image J（NIH）處理，進行測量。應隨機選取50個細胞測量，并盡量選取平直、清晰的纖毛測量和統計。纖毛長度使用GraphPadPrism8軟件進行統計，統計數據采用（平均值 ± 標準差）的方式表示，統計學差異通過單因素方差分析， plt;0.05 表示有顯著統計學差異， plt;0.01 表示有極顯著統計學差異。

3 結果與分析

3.1 機械力切割使領鞭毛蟲纖毛脫落

在纖毛脫落實驗中，為了確定分散機適合的工作參數，分別收取6檔功率下機械力處理0.5、1.0和 1.5min 的細胞在24孔板觀察，處理 1min 的細胞與處理前的正常游動細胞對比，觀察到絕大部分細胞處理后不游動，并且3種處理時長的細胞均能恢復游動能力，即纖毛經機械力脫落后重新生長到原長。后續機械力誘導領鞭毛蟲纖毛脫落使用6檔作為工作檔位，處理時間為 1min 。

處理前，絕大多數細胞正常游動，處理 1min 后立即取 1mL 細胞在24孔板下觀察，可見細胞基本停止游動， 30～60min 細胞開始恢復游動狀態。處理后至 ^2h ，細胞基本恢復到初始游泳狀態。根據處理前后的時間點分別收樣固定細胞：處理前、 ，1，15，30，60，90，120min 。每個時間點測量50根纖毛長度，得到其平均值導入軟件得到纖毛再生曲線（圖1（a））。根據拍攝的圖片和纖毛長度數據，纖毛切割后 120min 恢復到處理前水平。拍攝各時間的細胞照片（圖1（b））也可見纖毛再生過程中，纖毛長度逐漸恢復。

圖1機械力切割領鞭毛蟲纖毛再生曲線及各時間細胞形態

Fig.1 Curve of cilia regeneration and cell morphology by time in Salpingoeca rosetta via mechanical shearin;

3.2 LiCl處理濃度梯度驗證

纖毛延伸實驗中，以25、100、250、500mmol/L的LiCl終濃度處理細胞 60min 測試延伸效果。在25、100，250，500mmol/L 濃度處理下，纖毛均有延伸，說明LiCI處理對領鞭毛蟲纖毛延伸是有效的。其中 25、100.500mmol/L 的濃度處理 60min 后，纖毛延長幅度 10%～15% ;250mmol/L的濃度處理，纖毛延長幅度達到 30% ，延伸更明顯，差異更顯著（圖2），故后續實驗以 250mmol/L 終濃度的LiCl誘導纖毛延伸。

圖2不同濃度LiCl處理領鞭毛蟲誘導纖毛延伸散點圖

Fig.2Acomparisonof thescatterplotsofciliaelongationinSalpingoecarosettainducedbyLiClatdiffrentmolarities

3.3 LiCl誘導纖毛延伸

收集細胞后，用 4～5mL ASW重懸混勻，收取對照組樣品后，轉移 3mL 細胞到新離心管，將 1mL 的1 mol/LLiCI加到細胞中，邊加邊混勻避免局部濃度過高，加完立即計時，收取各時間點樣本并固定細胞：處理前 ?15.30.60.90.120.150.180min 。同時收取相同時間不加LiCl處理的細胞作為對照。在24孔板下能觀察到，隨著處理時間增加，群體形成性領鞭毛蟲纖毛延伸并出現運動異常。固定細胞后每個時間點測量50 根纖毛的長度，統計纖毛延伸曲線（圖3）。

圖3LiCl誘導纖毛延伸曲線

慢泳者、快泳者和玫瑰花結的圖片。相較于慢泳者，快泳者的纖毛更長且微絨毛領圈更短或者沒有領圈，群體形成性領鞭毛蟲的多細胞形態由單細胞發育而來，細胞外基質的一種特定蛋白將各個細胞相連，玫瑰花結的細胞連接有一個缺口（圖4），也表明群體形成性領鞭毛蟲多細胞形態是由單細胞連續不完全分裂的結果[3]。

圖4群體形成性領鞭毛蟲不同細胞形態結構圖

Fig.4Different cell morphologies of Salpingoeca rosetta

4 討論與結論

領鞭毛蟲是與多細胞動物親緣關系最近的單細胞類群[3.22]，隨著領鞭毛蟲的兩個物種：Monosiga brevicolis和 Salpingoeca rosetta 的全基因組測序完成[1，23-24]，以及穩定的轉基因手段[25]，領鞭毛蟲開始作為一種新的模式生物活躍在各個實驗室中[3，26]。在 Salpingoeca rosetta 的生活史中，有 5種不同的細胞形態，其中慢泳者可以分化成其他4種，并且纖毛長度和領圈微絨毛長度有一定差異[8]。細胞不完全分裂形成多細胞形態的玫瑰花結類型（圖4），細胞之間由細胞外基質和絲狀偽足相連。領鞭毛蟲與環境細菌有豐富的相互作用，它可以誘導細菌在自身周圍聚集便于捕食[27];費氏弧菌（Vibrio fischeri）分泌的一種軟骨素酶可以誘導領鞭毛蟲有性生殖[26];Salpingoeca roseta 形成玫瑰花結也依靠馬島噬冷菌（Algoriphagus machipongonensis ）分泌的一種脂質[20]。

纖毛作為領鞭毛蟲重要的細胞器，發揮了運動、感知和捕食的功能[9。纖毛發生可能對于早期動物進化有至關重要的作用[8]，對于現代動物而言，纖毛缺陷會導致發育障礙和各種纖毛病[28-29]。 或腺苷酸環化酶的抑制被認為是LiCl作用的基礎，Li充當 Mg 的非競爭性抑制劑來抑制 的激酶活性，對AC I-cAMP信號通路的抑制也部分幫助了纖毛延伸[18-1]。

本研究以領鞭毛蟲 Salpingoeca roseta作為實驗材料，驗證了機械力切割纖毛和LiCl誘導纖毛延伸在領鞭毛蟲中是成功有效的，并且根據纖毛長度變化繪制了纖毛脫落再生曲線和纖毛延伸曲線。Coyle等[8的報道指出，冷脅迫可以使領鞭毛蟲纖毛脫落，但長時間冷凍可能會影響細胞活性，而本文首次將機械力切割脫纖毛應用到領鞭毛蟲研究中。機械力處理 1min 后，Salpingoeca rosetta的纖毛脫落，經 120min 的纖毛再生，恢復到最大纖毛長度，游動狀態也與對照組一致。相較于冷脅迫脫纖毛，機械力切割的方式更迅速便捷高效，并且操作簡單，實驗可重復性好。因此機械力切割纖毛可作為一種新方法應用到領鞭毛蟲纖毛研究中。另外本研究還利用LiCl誘導領鞭毛蟲纖毛延伸，以濃度 250mmol/L 的LiCl處理細胞 180min ，期間Salpingoecarosetta的纖毛逐漸延長，最終纖毛長度增加 60% 以上，24孔板下可見細胞游泳狀態異常，未見類似萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardti）LiCl處理后鞭毛軸絲卷曲形成的“鞭毛球”。由于 Salpingoeca rosetta基因組編碼GSK3同源物（Gene ID：16071553），LiCI誘導領鞭毛蟲纖毛延伸的機制可能與萊茵衣藻類似，通過抑制GSK3 的激酶活性影響下游信號通路導致纖毛延長[18-9]。

隨著細胞器生物學的發展，領鞭毛蟲因其培養方式簡單和進化上的地位（和動物有共同祖先），有望成為新的纖毛研究模式生物。比較領鞭毛蟲和動物纖毛調控基因的異同，對于研究纖毛調控機制對動物細胞的進化有重要意義。本實驗為研究領鞭毛蟲的纖毛發生和纖毛組裝提供了方法，對后續研究領鞭毛蟲纖毛調控機制及相關疾病的治療具有一定的借鑒意義。

參考文獻：

[1]ALEGADORA，KINGN.Bacterial influencesonanimal origins[J].ColdSpringHarborPerspectivesin Biology，2O14，6（11）： a016162.DOI： 10.1101/cshperspect.a016162.

[2]DAYEL MJ，ALEGADORA，FAIRCLOUGH SR，et al.Celldiferentiationand morphogenesis in thecolony-forming choanoflagelate SalpingoecarosetaJ].Developmental Biology，2011，357（1）：73-82.DOI：10.1016/j.ydbo.2011.06.003.

[3]LEVINTC，GREANEYAJ，WETZELL，etal.TheRosetelessgenecontrols developmentinthechoanoflagelate Salpingoeca rosetta[J]. eLife， 2014，3：e04070.DOI：10.7554/eLife.04070.

[4]BRUNETT，KING N.Thesingle-celled ancestorsofanimals[M]//The Evolutionof MulticelularityBocaRaton：CRCPress， 2022：251-278. D01： 10.1201/9780429351907-17.

[5]DOLANJR.Onsavile-kent's“amanualof theinfusoria”[J].Protist，2024，175（1）：126008.DOI：10.1016/j.protis.2023. 126008.

[6]RICHTERDJ，KINGN.Thegenomicandcelllar foundationsofanimal origins[J].Annual Reviewof Genetics，2013，47（1）： 509-537. DOI： 10.1146/annurev-genet-111212-133456.

[7]RAGUZ L，PENG CC，RUTAGANIRAFUN，et al.Total synthesisand functional evaluation ofIORs，sulfonolipid-based inhibitorsofcelldiferentiationinSalpigoecarosettJ]AngewandteChmie（InternatialEdinEnglish），22，6（4）： e202209105.DOI：10.1002/anie.202209105.

[8]COYLE MC，TAJIMA A M，LEONF，etal.AnRFXtranscriptionfactorregulates ciliogenesis intheclosest livingrelativesof animals[J]. Current Biology：CB，2023，33（17） ： 3747-3758.DOI：10.1016/j.cub.2023.07.022.

[9]PINSKEYJM，LAGSETYA，GUL，etal.Thre-dimensionalflagellstructuresfromanimalscosestunicelularrelatives，the Choanoflagellates[J]. eLife，2022，11：e78133.DOI：10.7554/eLife.78133.

[10]HOFFMEYERT，BURKHADP.Choanoflagelltemodels-MonosigbrevicollsandSlpingoecrosettaJ].CurrntOiion

第4期 in Genetics amp; Development，2016，39：42-47. DOI：10.1016/j.gde.2016.05.016.

[11]LIANGYW，PANJM.Regulationofflagelarbiogenesisbyacalciumdependentprotein kinaseinChlamydomonaseinhadti [J]. PLoS One，2013，8（7）： e69902. DOI： 10.1371/journal.pone.0069902.

[12]BROWNJM，COCHRANDA，CRAIGE B，et al.Assembly of IFTtrains atthe ciliary base depends on IFT74[J].Current Biology ： CB，2015，25（12）： 1583-1593.D0I： 10.1016/j.cub.2015.04.060.

[13]LILL，ANGM，ENGH，etal.NewclassoftrascriptionfctorscontrolsfagelarassemblybyrecruitigRNApolase in Chlamydomonas[J].Procedingsof the National Academyof Sciencesofthe United Statesof America，2018，15（17）： 4435-4440. DOI： 10.1073/pnas.1719206115.

[14]LUO MN，CAOMQ，KANYN，etal.ThephosphorylationstateofanAurora-likekinase marksthelengthof growingflagell in Chlamydomonas[J]. Current Biology ： CB，2011，21（7） ： 586-591. DO1： 10.1016/j.cub.2011.02.046.

[15]CAO MQ，LIGH，PANJM.Regulationofciliaaemblydisassembly，ndlengthbyproteinphosphorylation[J].Methodsin Cell Biology，2009， 94： 333-346. D0I： 10.1016/S0091-679X（08）94017-6.

[16]PLOTNIKOVAOV，PUGACHEVAEN，DUNBRACK RL，et al.Rapid calcium-dependent activationof Aurora-a kinase[J]. Nature Communications， 2010，1（6） ： 64.DO1： 10.1038/ncomms1061.

[17]PANJM，SNELL WJ.Chlamydomonasshortensitsflagellbyactivating axonemaldisassmbly，stimulating IFTparticle traficking，and blocking anterogradecargo loading[J].Developmental Cell，2005，9（3）： 431-438.DO1：10.1016/j.devcel. 2005.07.010.

[18]OUY，RUANYB，CHENG M，etal.Adenylatecyclaseregulates elongationof mammalianprimaryciliaJ].ExperimntalCll Research，2009，315（16） ： 2802-2817. D01： 10.1016/j.yexcr.2009.06.028.

[19]WLSONNF，LEFEBVREPA.Regulationoflagelarassmblybyglycogensythase kinase3inChlamydomonasreihardtJ]. Eukaryotic Cell， 2004，3（5）： 1307-1319.DOI： 10.1128/EC.3.5.1307-1319.2004.

[20]ALEGADOR A，BROWNLW，CAOSG，etal.Abacterial sulfonolipid trigers multicelulardevelopment intheclosestliving relatives of animals[J]. eLife，2012，1： e00013.DOI： 10.7554/eLife.00013.

[21]SIGG MA，MENCHEN，LEEC，etal.Evolutionaryproteomicsuncoversancientasociationsofilia withsignalingpathwaysJ]. Developmental Cell，2017，43（6） ： 744-762.e11. DOI：10.1016/j.devcel.2017.11.014.

[22]BRUNETT，ALBERTM，ROMANW，etal.Aflagellte-to-amoeboid switchinthclosestliving relativesofnimals［J].Life， 2021，10： e61037. DOI： 10.7554/eLife.61037.

[23]BOOTHDS，ZM-DLETONH，KIG.ransfectionofhoanoflagelltesillumiatesthrcellbiologandtheacesty of animal septins[J].Molecular Biology of the Cell，2018，29（25）： 3026-3038.DOI：10.1091/mbc.E18-08-0514.

[24]MATRIANODM，ALEGADO R A，CONACO C.Detectionof horizontal gene transfer in the genomeof thechoanflagellate Salpingoeca rosetta[J]. Scientific Reports，2021，11（1） ： 5993.DOI： 10.1038/s41598-021-85259-6.

[25]BOOTHDS，KINGN.GenomeeditingenablesreversegeneticsofmulticellarevelopmentinthchoanoflagelateSalpingoec rosetta[J]. eLife，2020，9：e56193.DOI：10.7554/eLife.56193.

[26]WOZNICA A，GERDTJP，HULETTRE，etal.Mating intheclosest living relativesofanimalsis inducedbyabacterial chondroitinase[J]. Cell， 2017，170（6） ： 1175-1183.e11. DO1： 10.1016/j.cell.2017.08.005.

[27]DAYELMJ，KINGN.Preycapture and phagocytosisinthechoanoflagelate SalpingoecarosetaJ].PLoSOne，014，9（5）： e95577. DOI： 10.1371/journal.pone.0095577.

[28］曹木青，潘俊敏.纖毛及纖毛相關疾病研究進展[J]．中國細胞生物學學報，2012，34（9）：849-856.

[29]TAKEUCHI K，ABOM，DATEH，etal.Practical guide forthediagnosisandmanagementof primaryciliarydysinesia[J]. Auris Nasus Larynx，2024， 51（3） ： 553-568. DOI： 10.1016/j.anl.2024.02.001.