混合培養(yǎng)對破囊壺菌中Aurantiochytrium sp.生物量的影響

中圖分類號：Q939.97 文獻標志碼：A 文章編號：1004—6755（2025）08—0028-04

Abstract：This study investigated co- culture strategies for enhancing biomass production in the oleaginous marine protist Aurantiochytrium sp. S3D， comparing algal- protist （Chlorella sp.）and protist一protist （Talaromyces sp. and A . sp. S3E） systems under varying light conditions and nutrient sources. While light significantly stimulated S3D growth （ ΔPlt;0.01 ），algal co-culture showed no synergistic effects. Optimal biomass yields were achieved in glycerol/YE medium with S3D一 T_δ sp （11.41±0.25） 1 g/L ，and S3D-S3E coculture at 1：4 ratio in glucose/YE medium （12.62±0.67）g/L .These findings demonstrate that conspecific co一 culture with organic nitrogen maximizes S3D productivity.

Key words： Thraustochytrid;microalgae;mixed culture; heterotrophic protists

破囊壺菌（Thraustochytrid）是一類異養(yǎng)原生生物[1]，主要包含Thraustochytrium、Schizochytri-um、Aurantiochytrium、Botryochytrium、Japonochytrium、Monorhizochytrium、Parietichytrium、Sicyoi-dochytrium等[2]。破囊壺菌的生物質(zhì)可用作飼料添加劑，顯著提高海水魚和家禽產(chǎn)品的品質(zhì)3；破囊壺菌油脂還可用于生物柴油的生產(chǎn)，這一應用有助于緩解能源短缺的問題[4]

破囊壺菌能夠廣泛利用葡萄糖、甘油等多種碳源進行高效的脂質(zhì)合成5，混合培養(yǎng)能夠優(yōu)化微生物的代謝途徑，實現(xiàn)微生物油脂的高效生產(chǎn)，為解決當前面臨的能源短缺和環(huán)境污染問題提供了可行方案[。本研究以產(chǎn)油微生物A．sp.S3D為研究對象，考察了光照、碳源（葡萄糖/甘油）、氮源（酵母提取物/氯化銨）及藻—菌共培養(yǎng)和菌一菌共培養(yǎng)對破囊壺菌生長的影響，以期為產(chǎn)油微生物混合培養(yǎng)提供科學指導。

1材料與方法

1.1 藻種與菌種來源

菌株S3D與S3E分離自溫州近海紅樹林落葉，經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定為 A .sp.S3D和A.sp.S3E。Talaromyces sp.Y1o1A分離自秦皇島市近海水體，Chlorellasp.購買自中科院海洋所。所有菌種均保存于科研中心。

1.2 培養(yǎng)基的制備

試驗采用以下培養(yǎng)基：MMV培養(yǎng)基含 5g/L 谷氨酸鈉和 10g/L 葡萄糖， f/2 培養(yǎng)基含 75g/L 硝酸鈉、 5g/L （204號 KH₂PO₄ 、維生素溶液7、微量元素溶液。菌—菌混合培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分見表1。

表1菌一菌混合培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分

單位：g/L

1.3種子液的制備與發(fā)酵培養(yǎng)

藻—菌混合培養(yǎng)采用MMV與 f/2（1：1） 混合培養(yǎng)基，初始接種密度為 5×10⁴ cells/mL，接種量為 10%（V/V），25°C 培養(yǎng) _9d 。光照組光強為 60μmol/（m²?s） ，光照周期為 ^14h 光照/ ^10h 黑暗 （14L/10D 。菌—菌混合培養(yǎng)中， A .sp.S3D與酵母菌混合培養(yǎng)采用表1中 A-D 四種培養(yǎng)基，與同屬菌株混合培養(yǎng)采用A、C兩種培養(yǎng)基， 25°C.180rpm 振蕩培養(yǎng) 6d 。

1.5 生物量測定

采用恒重法測定生物量。將離心管使用105^°C 烘箱烘干至恒重；取 10mL 菌液，經(jīng)5 000rpm 離心 5min 去除上清，用滅菌超純水洗滌菌體3次；將菌體于 -20^°C 預凍 ^12h 后，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機中凍干 ^48h ；將樣品轉(zhuǎn)至干燥器平衡 30min 后稱量凍干總質(zhì)量，并計算生物量。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用IBMSPSSStatistics26軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（平均值 ± 標準差）的形式表示。

2結(jié)果

2.1光照對菌株生長的影響

試驗結(jié)果表明，光照顯著促進 A .sp.S3D生長 ∵0.01 。在單獨培養(yǎng)時，光照組生物量達到 （0.98±0.02）g/L ，較暗培養(yǎng)組提高 9.00% ：見圖1。雖然藻一菌混合培養(yǎng)組在光照條件下的生物量顯著高于無光照組（ Plt;0. 01 ，但A．sp.S3D單獨培養(yǎng)時表現(xiàn)出最優(yōu)生長性能，其生物量積累極顯著高于共培養(yǎng)組 （Plt;0.01） 。

圖1不同光照條件下菌體的生物量變化

2.2破囊壺菌與酵母菌混合培養(yǎng)對生物量積累的影響

試驗采用葡萄糖、甘油作為碳源，酵母提前物、氯化銨作為氮源，比較了單獨培養(yǎng)和酵母菌—破囊壺菌共培養(yǎng)體系下的生物量差異，見圖2。結(jié)果表明，碳源影響 A .sp.S3D的生長周期和生物量積累（ Plt;0. 05） 。當葡萄糖為碳源時，A ：sp.S3D生物量在第6天達到峰值，在添加酵母提取物的培養(yǎng)組中， A ．sp．S3D生物量達到（9.94±0.80）g/L ，見圖 2a 。甘油作為碳源時，A．sp.S3D生物量在第4天達到峰值，在添加了酵母提取物的培養(yǎng)組中， A .sp.S3D生物量達到0 11.33±0.31）g/L ，見圖 2b 。在兩種氮源條件下，酵母提取物作為氮源時 A ．sp.S3D生物量均顯著高于氯化銨培養(yǎng)組 （Plt;0.05） 。

破囊壺菌與酵母菌的共培養(yǎng)時，葡萄糖一酵母提取物培養(yǎng)條件下，各組間生物量無顯著差異中 ?Pgt;0.05） ，見圖 2a 。甘油一酵母提取物培養(yǎng)組中，共培養(yǎng)的生物量達到最高值（ ∥11.41±0.25）g/L ，但各組間生物量無顯著差異1 Pgt;0.05） ，見圖 2b 。

在氯化銨為氮源的培養(yǎng)組中，各組菌體生物量較酵母提取物組明顯降低。葡萄糖一氯化銨培養(yǎng)組中，培養(yǎng)至第6天時， A .sp．S3D生物量達到 （5.01±0.26）g/L ，共培養(yǎng)組生物量為 （6，27± 0.26）g/L ，極顯著高于 A .sp.S3D單獨培養(yǎng)組（ Plt;0.01 ，見圖 2a 。甘油一氯化銨培養(yǎng)組中，各組生物量在第4天達到峰值， A .sp.S3D單獨培養(yǎng)生物量達到 （5.42±0.03）g/L ，共培養(yǎng)組生物量達到 （6.43±0.06）g/L ，極顯著高于 A .sp.S3D單獨培養(yǎng)（ Plt;0.01? ，見圖 2b 。

2.3破囊壺菌與破囊壺菌混合培養(yǎng)對生物量的影響

破囊壺菌 A ，sp.S3D與 A 、sp.S3E在不同碳源條件下的生長特性及其混合培養(yǎng)效果如圖3所示。在葡萄糖—酵母提取物培養(yǎng)條件下（圖3a），A ：sp.S3D單獨培養(yǎng)的生物量達到 （9.94±0.82） g/L ，顯著高于 A .sp.S3E單獨培養(yǎng)的生物量（2號 （7.94±0.78）g/L （ Plt;0. 05） ，表明 A .sp. S3D對葡萄糖具有更優(yōu)的轉(zhuǎn)化率。 A sp.S3D與A．sp.S3E接種比例為 1：1 和 1：4 的共培養(yǎng)組生物量分別達到： （11.52±0.57）g/L 和（12.62±0.67）g/L ，兩組間生物量無顯著性差異（ ，其中 1：4 比例共培養(yǎng)組相較于A .sp.S3D單獨培養(yǎng)生物量顯著提升 27%L ?Plt;0.05） ，表明該混合培養(yǎng)比例有助于A．sp.S3D生物量積累。

在甘油一酵母提取物培養(yǎng)條件下， A. sp.S3D的生物量在第4天達到峰值，與第6天無顯著差異（Pgt;0.05） ，見圖 3b 而 A. sp.S3E和混合培養(yǎng)組生物量則在第6天達到峰值。在第6天時， A. sp. S3D單獨培養(yǎng)的生物量達到（ 11.29±0.11）g/L ，極顯著高于 A_? ：sp.S3E單獨培養(yǎng)的生物量 （8.01±0.58）g/L （Plt;0.01） 。結(jié)果顯示 A_? ：sp.S3D對甘油具有更高的轉(zhuǎn)化能力。 A .sp.S3D與 A .sp.S3E接種比例為 1：1 和 1：4 的共培養(yǎng)組生物量分別達到（ 和 （10.40±0.60）g/L ，與A．sp.S3D單獨培養(yǎng)相當 （Pgt;0.05）

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，光照顯著促進 A .sp.S3D的生長 Plt;0.01） ，這一結(jié)果與Kubo等[8的研究形成對比，表明不同破囊壺菌菌株對光照的響應存在差異。同時發(fā)現(xiàn)，采用 1：1 接種比例的藻一菌共培養(yǎng)未顯現(xiàn)協(xié)同效應。破囊壺菌 A ．sp.菌株最適生長pH值為 6～8^[9] 。而小球藻光合作用會使培養(yǎng)環(huán)境呈堿性（pH值 gt;8 ）[7]，堿性環(huán)境會顯著抑制破囊壺菌生長[10]，這可能是導致共培養(yǎng)效果不佳的關(guān)鍵環(huán)境因素。

在碳源利用方面，A．sp.S3D單獨培養(yǎng)時，S3D在甘油一酵母提取物培養(yǎng)條件下生物量達到（11. 33±0.31）g/L 極顯著優(yōu)于葡萄糖碳源1 .Plt;0.01 ，甘油展示出比葡萄糖更優(yōu)的培養(yǎng)效果，這一現(xiàn)象與文獻報道一致[11]。而A．sp.S3E在兩種碳源中的生長表現(xiàn)無顯著差異，這一結(jié)果不僅驗證了Bagul等[12]關(guān)于營養(yǎng)環(huán)境影響菌株特性的結(jié)論，更凸顯了破囊壺菌科的代謝多樣性。雖然A.sp. S3D與 A ：sp.S3E都能利用甘油和葡萄糖，但在不同碳源中生長性能和產(chǎn)物積累方面存在差異，這與吳克剛等13人的結(jié)論一致。氮源試驗證明，有機氮源較無機氮源能極顯著促進菌體生長（ Plt;0.01） 。這一結(jié)論與Chen等[14-的結(jié)論相符。

本研究進一步揭示了破囊壺菌混合培養(yǎng)的協(xié)同效應具有明顯的營養(yǎng)依賴性。不同于傳統(tǒng)的藻—菌混合培養(yǎng)體系[15]， A ．sp.S3D與酵母菌混合培養(yǎng)時，在無機氮源條件下，共培養(yǎng)顯著提升破囊壺菌生物量（ Plt;0. 01 ），這種營養(yǎng)條件依賴性的協(xié)同效應，可能源于共培養(yǎng)過程中，酵母菌代謝產(chǎn)生的酶類、維生素和糖肽類等物質(zhì)，為破囊壺菌提供了關(guān)鍵的促生長因子。

4總結(jié)

本研究探索了藻—菌和菌—菌混合培養(yǎng)體系，以為產(chǎn)油微生物 A .sp.S3D的高效培養(yǎng)提供新的方案。研究結(jié)果表明，光照對破囊壺菌單獨培養(yǎng)具有顯著促進作用（ ΔPlt;0. 05Δ 。結(jié)合碳氮源單因素影響試驗進行菌一菌混合培養(yǎng)研究，結(jié)果表明，破囊壺菌的生長具有顯著的營養(yǎng)條件依賴性。甘油作為碳源時， A .sp.S3D單獨培養(yǎng)的生長性能顯著優(yōu)于葡萄糖（ Plt;0. 05） ，且有機氮源酵母提取物極顯著提升 A ：sp.S3D生物量0 （Plt;0.01） 。混合培養(yǎng)效果具有顯著氮源依賴性，無機氮條件中 A ．sp.S3D與酵母菌共培養(yǎng)時，破囊壺菌生物量極顯著提高（ Plt;0. 01） 。而有機氮條件下， A sp.S3D與 A .sp. S3E以 1：4 的比例混合培養(yǎng)對生物量的積累效果更優(yōu)。

參考文獻：

[1]LYU L，WANG QZ，WANG G Y. Cultivation and diversity analysisofnovelmarineThraustochytrids[J].MarineLife Scienceamp;Technology，2021，3（5）：263-275.

L」孤夫玉，趙玉斌，工火△，守，似深吸裴亞困廠功能住脂肋取DHA研究進展[J].生物技術(shù)通報， 2024，40（6）：81-94

[3]謝曦，陳碧翰，羅俊鍇，等.破囊壺菌屬微生物中超長鏈多不飽和脂肪酸的生物合成及其代謝工程應用[J].現(xiàn)代食品科技，2022，38（6）：327-342.

[4]CHENCY，LEEMH，LEONGYK，etal.Biodiesel pro-duction from heterotrophic oleaginous microalga Thraus-tochytrium sp. BM2 with enhanced lipid accumulation usingcrude glycerol as alternative carbon source[J]. BioresourceTechnology，2020，306：123113.

[5]寧耀東，王秋珍，何藝科，等.破囊壺菌利用工農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)脂肪酸的研究進展［J].微生物學通報，2020，47（1） ：234-243.

[6]張勇，陳燕，李欣陽，等.微生物混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的研究進展[J].中國油脂，2022，47（4）：133-137，152.

[7]KUBO Y，MORIMOTO D，SHIROI M，et al. Transcrip-tional responses of Aurantiochytrium limacinum under lightconditions[J].Journal of Applied Microbiology，2022，132（6）：4330-4337.

[8]王陽陽，李佳倩，朱星宇，等.利用環(huán)境脅迫提高破囊壺菌二十二碳六烯酸生產(chǎn)的研究進展[J].微生物學通報，2023，50（11）：5150—5171.

[9］劉方舟，任洪艷，陳紅芬，等.不同碳源對普通小球藻和粘紅酵母共培養(yǎng)產(chǎn)油脂的影響［J]．基因組學與應用生物學，2020，39（8）：3612-3619.

[10] WANG SK，WANG X，TIANY T，et al. Nutrient recov-ery from tofu whey wastewater for the economical produc-tion of docosahexaenoic acid by Schizoch ytrium sp. S31[J].Science of the Total Environment，2020，710（25）：136448.

[11] GUPTA A， SINGH D， BARROW C ，et al. Exploring po-tential use of Australian Thraustoch ytrids for the bioconve-rsion of glycerol toomega ^-3 and carotenoids production[J].Biochemical Engineering Journal，2013，78（6）：11 ^-17 ：

[12]BAGUL VP，ANNAPUREU S. Isolation of fast一grow-ing Thraustochytrids and seasonal variation on the fatyacid composition of Thraustoch ytrids from mangrove re-gions of Navi Mumbai， India[J]. Journal of EnvironmentalManagement，2021，290（15）：112597.

[13]吳克剛，柴向華.破囊壺菌Thraustochytriumroseum產(chǎn)DHA的營養(yǎng)條件研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（2）：42-48.

[14] CHEN G，F(xiàn)AN K，LUFP，et al. Optimization of nitrogensource for enhanced production of squalene from Thraus-tochytrid Aurantiochytrium sp.[J]. New Biotechnology，2010，27（4）：382-389.

[15]CHEIRSILP B， SUWANNARAT W，NIYOMDECHA R.Mixed culture of oleaginous yeastRhodotorula glutinisandmicroalga Chlorella vulgaris for lipid production from in-dustrial wastesand its use as biodiesel feedstock[J].NewBiotechnol，2011，28（4）：362-368.（收稿日期：2025－06-18）