補腎寧神膏的指紋圖譜建立、含量測定及體外抗氧化作用的譜效關系研究

中圖分類號 R84.1;R917 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（05）14-1749-06

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.05.14.10

ABSTRACTOBJECTIVEToestablish thefingerprint of Bushenningshenointment，determinethecontentsof its major constituents，andinvestigateitsinvitroantioxidantactivity.METHODsHighperformanceliquidchromatography（HPLC） fingerprintsof1batchesofBushen nngshen ointment were established.Similarityevaluationand identificationofcommonpeaks weresubsequently performed.Thecontentsof1Ocomponentssuchassalidrosidewere determinedusing thesame HPLCmethod. Using the scavenging rates against 2， 2^′ -azino bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS）and1，1-diphenyl-2- picrylhydrazyl（DPH）adicals，aswellasfericionreducingantioxidantpower（FRAP）asindcators，theanti-oxidantactivityof theointment was evaluated；greyrelationalanalysisandpartialleastsquaresregresion wereconductedusingSMCA14.1software toestablishthespectrum-efectrelationship.RESULTSThefingerprintchromatogramof10batchesof Bushenningshenointment contained 24 common peaks， with similarity valuesallexceeding O.96.Eleven peaks were identified as adenosine（peak1），salidroside（peak4），morroniside（peak6），catechin（peak7），paeoniflorin（peak 1O），spinosin（peak11），ferulic acid （peak 12），isoquercitrin （peak 13），verbascoside（peak 14），paeonol （peak 23），and emodin（peak 24）.Content determination results showed that theaverage contentsof salidroside，morroniside，catechin，paeoniflorin，spinosin，ferulicacid，isoquercitrin，verbascoside，paeonol，andemodinwere0.725，1.962，0.214，3.395，0.124，0107，0.286， 0.019，0.034 and 0.067mg/g ，respectively.The antioxidant potency composite index（APC）for the 10 batches ranged from 85.08% to 96.35% .Spectrum-effect relationshipanalysis indicated that all 24common peaks were positively correlated with the antioxidant capacity. Seventeen peaks had variable importance in projection values gt;1 ，specitically peaks 2，5，6，7，9，10，13- 21，23，and24.CONCLUSIONSThis studysucesfullyestablishedthe HPLC fingerprintandcontentdetermination method for Bushenningshenointment.Thecompoundsrepresented bythe17commonpeakssuch as moronisidemaybetheactivecomponents contributing to its antioxidant effects.

KEYWORDsBushenningshenointment；fingerprint；spectrum-efectrelationship；antioxidantactivity；contentdetermination

補腎寧神膏根據深圳市中西醫結合醫院治未病科徐文華主任醫師的臨床經驗方制備而成，該方由熟地黃、山茱萸、酒川芎、鹽女貞子、炒酸棗仁、牡丹皮、首烏藤、茯神、龍齒等16味藥材組成，具有滋陰補腎、養心安神的功效，臨床主要用于治療腎血不足、虛火內擾所致的失眠、多夢等癥，療效顯著。

補腎寧神膏的現行質量標準僅為薄層鑒別、性狀及常規檢查。由于復方制劑主要通過多組分、多靶點的特性來協同實現整體療效，因此現行質量標準難以全面反映補腎寧神膏的整體質量。該方中酒川芎中的阿魏酸、兒茶素，牡丹皮中的芍藥苷、丹皮酚、異槲皮苷，鹽女貞子中的毛蕊花糖苷、紅景天苷，炒酸棗仁中的斯皮諾素，以及山茱萸與鹽女貞子共有的腺苷等成分，均具有抗氧化、保護神經及調節心血管功能等活性-3]。有研究發現，氧化應激是失眠的重要病理生理機制之一，長期失眠會導致大腦產生過量的活性氧自由基，而安神助眠的作用機制常被認為與減輕氧化應激和炎癥反應有關[4-5]。然而，現有的研究多聚焦于單一成分的體外抗氧化活性，缺乏對復方制劑整體抗氧化效應及其物質基礎的系統性分析。這可能導致不同批次樣品的質量波動，從而影響療效的穩定性，甚至存在中藥質量控制中“成分與藥效割裂”的關鍵問題。

指紋圖譜能在保證質量穩定性與一致性的同時，既彌補單一成分的局限性，又能為藥效物質的篩選提供數據支持。中藥譜效學能夠系統地分析中藥中多成分、多靶點的協同作用，符合中醫藥“整體觀\"理論。灰色關聯度分析和偏最小二乘回歸分析可識別中藥化學成分與藥效的相關性，分析成分對藥效的綜合貢獻。基于此，本研究建立了補腎寧神膏的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并同法測定了補腎寧神膏中紅景天苷等10個成分的含量；采用 ^2，2′ -聯氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、鐵離子還原能力（FRAP）法測定其體外抗氧化活性；通過灰色關聯度分析與偏最小二乘回歸分析篩選其抗氧化活性成分，旨在為其質量標準提升提供參考。

1材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有e2695型HPLC儀（美國Waters公司），BioTekSynergyHTX型多功能酶標儀（美國Agilent公司），MS105型十萬分之一電子分析天平、

JS703C型萬分之一電子分析天平（美國MettlerToledo公司），DA型數控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

對照品腺苷（批號J08HB173656）、莫諾苷（批號M14IB209606）、紅景天昔（批號PO1A9L67130）、兒茶素（批號O13IY228437）、阿魏酸（批號G13S11L124423）、芍藥昔（批號M22HB179898）、大黃素（批號YY90044）、斯皮諾素（批號A31IB224722）、異槲皮昔（批號Y24J11H119521）、毛蕊花糖苷（批號Z28S11X125952）、丹皮酚（批號N22H8201956）及維生素E（批號S13016）、2，4，6-三吡啶基三嗪溶液（TPTZ）（批號S30632）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于 98% ; ABTS（批號C15283881）、DPPH（批號C15568523）過氧化物酶（批號C15283881）FeSO4·7HO（批號MFCD00149719）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（批號P787575）、FeCl3溶液（批號MFCD00011005）均購自上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

補腎寧神膏（批號20240124、20230912、20240116、20240515、20240229、20231113、20240416、20231221、20231227、20240923，編號 S1～S10;1g 相當于飲片6.6g）由深圳市中西醫結合醫院中藥房自制。

2 方法與結果

2.1補腎寧神膏指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

以xBridge 為色譜柱，以乙腈（A）- .0.2% 磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（ 0～5min ， 5%A?10%A 5～10min ， 10%A?13%A 10～15min ， 13%A?15%A 15～20min ， 15%A 20～25 min， 15%A20%A;25～40min，20%A28%A;40～45 min 28%A30%A;45～50min，30%A50%A;50～55 min， 50%A?65%A ; 55～60min 65%A?95%A;60～70 min 95%A ）；流速為 0.6mL/min ;柱溫為 30^°C ;檢測波長為 230nm ;進樣量為 10μL 。

2.1.2 供試品溶液的制備

取補腎寧神膏樣品 0.5g ，置于干燥錐形瓶中，加入甲醇 20mL ，超聲 30min ，冷卻，用甲醇補足失重，經0.22μm 濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 混合對照品溶液的制備

精密稱定紅景天昔、莫諾苷、兒茶素、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、異槲皮苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚、大黃素、腺昔對照品適量，分別置于 10mL 容量瓶中，加甲醇定容，制得各單一對照品貯備液。取上述各單一對照品貯備液適量，置于 5mL 容量瓶中，加甲醇定容，得上述各成分質量濃度分別為73.080、164.552、40.868、97.120、21.456、16.856、31.616、24.160、8.442、16.884、27.456μg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗

取\"2.1.2\"項下供試品溶液（編號S1），按\"2.1.1\"項下色譜條件連續進樣測定6次。以紅景天昔為參照峰，得到各共有峰相對保留時間的RSD均小于 0.34%（n=6） ，相對峰面積的RSD均小于 2.56%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗

取“2.1.2\"項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置 0.2、4、8、12、24h 時按“2.1.1\"項下色譜條件進樣測定。以紅景天昔為參照峰，得到各共有峰相對保留時間的RSD均小于 0.40%（n=6） ，相對峰面積的RSD均小于2.92%（n=6） ，表明樣品溶液在室溫下放置 24h 內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗

取樣品（編號S1）適量，按\"2.1.2\"項下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.1.1\"項下色譜條件進樣測定。以紅景天昔為參照峰，得到各共有峰相對保留時間的RSD均小于 0.18%（n=6） ，相對峰面積的RSD均小于 2.62% L n=6 ），表明方法重復性良好。

2.1.7 HPLC指紋圖譜的生成

取“2.1.2”項下供試品溶液（編號 ，按“2.1.1\"項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對10批樣品的指紋圖譜進行分析。以S1為參照圖譜（相似度最高），設置時間窗寬度為 0.1min ，采用均值法，經多點校正后，得到HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜R。結果顯示，10批樣品共有24個共有峰。結果見圖1。

2.1.8 相似度評價

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對10批樣品的指紋圖譜進行相似度評價。結果顯示，10批樣品與對照指紋圖譜R的相似度為 0.961～ 0.995，表明樣品的整體質量差異較小。

2.1.9 共有峰的指認

取“2.1.3\"項下混合對照品溶液，按\"2.1.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，經與對照指紋圖譜R比對，共指認出11個成分，分別為腺苷（峰1）紅景天苷（峰4）、莫諾苷（峰6）、兒茶素（峰7）芍藥苷（峰10）斯皮諾素（峰11）阿魏酸（峰12）異槲皮苷（峰13）、毛蕊花糖苷（峰14）、丹皮酚（峰23）及大黃素（峰24）。結果見圖2。

圖2混合對照品溶液和對照指紋圖譜R的HPLC圖

1：腺苷；4：紅景天苷;6：莫諾苷；7：兒茶素；10：芍藥苷；11：斯皮諾素；12：阿魏酸；13：異槲皮苷；14：毛蕊花糖苷；23：丹皮酚；24：大黃素。

2.2補腎寧神膏中多指標成分的含量測定

2.2.1 色譜條件色譜條件同\"2.1.1\"項。

2.2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱定紅景天苷、莫諾苷、兒茶素、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、異槲皮苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚、大黃素對照品適量，按\"2.1.3\"項下方法制備各單一對照品貯備液。取上述各單一對照品貯備液適量，置于 5mL 容量瓶中，加甲醇定容，得上述各成分質量濃度分別為73.080、164.552、40.868、194.240、21.456、16.856、31.616、3.624，8.442，16.884μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備制備方法同\"2.1.2\"項。

2.2.4線性關系考察

取“2.2.2\"項下混合對照品溶液，用甲醇逐級稀釋，得到各成分的系列標準溶液。取上述各成分的系列標準溶液及“2.2.2\"項下混合對照品溶液，按“2.2.1\"項下色譜條件進樣測定，以各成分質量濃度 （x） 為橫坐標、峰面積 （y） 為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1紅景天苷等10個成分的回歸方程與線性范圍

2.2.5 精密度試驗

取“2.2.3\"項下供試品溶液（編號S1），按“2.2.1\"項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，紅景天苷等10個成分峰面積的RSD均小于 1.93%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗

取“2.2.3\"項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24h時按“2.2.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，紅景天苷等10個成分峰面積的RSD均小于 2.72%（n=6） ，表明樣品溶液在室溫下放置24h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗

取樣品（編號S1）適量，按\"2.2.3\"項下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線計算含量。結果顯示，紅景天昔等10個成分含量的RSD均小于 2.44%（n=6） ，表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（編號S1）約 1.00g ，共6份，分別加入與各成分含量相當的單一對照品溶液（芍藥苷、莫諾苷、紅景天苷、異槲皮苷、兒茶素、斯皮諾素、阿魏酸、丹皮酚、毛蕊花糖昔、大黃素質量濃度分別為3.198、1.863，0.704，0.270，0.204，0.120，0.103，0.032，0.019， （200.060mg/mL ），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，紅景天昔等10個成分的平均加樣回收率為 98.57%～101.50% ，RSD均小于 1.98%（n=6） ，表明方法準確度良好。

2.2.9 含量測定

取10批樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并根據標準曲線計算樣品含量，每批樣品測定2次，取平均值。結果見表2。

表210批樣品中紅景天苷等10個成分的含量測定結果 （n=2，mg/g）

2.3補腎寧神膏的體外抗氧化活性測定

2.3.1ABTS自由基清除率測定

精密稱取維生素 E12.50mg ，加 60% 乙醇超聲溶解并定容至 10mL （濃度為 5.0mmol/L ），再用 60% 乙醇稀釋，得到濃度分別為 0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0，mmol/L 的維生素E標準溶液。取過氧化氫和雙蒸水 （1：39 ，V/V混勻，得溶液A。取PBS、ABTS和溶液A （152：10：8 ，V/V/V混勻，得溶液B。取過氧化物酶和PBS （1：9，V/V） 混勻，得溶液C。取\"2.2.3\"項下供試品溶液[用 60% 甲醇稀釋至質量濃度為 （25±0.5）mg/mL]10μL 溶液B170μL 和溶液 C20μL ，混勻，移至96微孔板中，作為實驗組。取不同濃度的維生素E標準溶液 10μL 至96微孔板中，加入溶液 B170μL 和溶液 C20μL ，混勻，作為標準曲線組。上述溶液均室溫避光靜置 6min 后，采用酶標儀于 414nm 波長處檢測吸光度值。每組設置3個平行孔。以維生素E標準溶液濃度為橫坐標 （x） 、吸光度為縱坐標 （y） 得到回歸方程為 y=-1.692 3x+1.902 8（r= 0.9996）。按公式計算ABTS自由基清除率：ABTS自由基清除率 ：樣本的平均吸光度值；b：標準曲線的截距； a ：標準曲線的斜率 ;f; 樣本加入檢測體系之前的稀釋倍數； m ：質量； V; 樣本加入體積）。結果顯示，10批樣品均具有清除ABTS自由基的能力，其中S2樣品清除能力最強。結果見表3。

表310批樣品的抗氧化測定結果 τ（n=3，mmol/g）

2.3.2 DPPH自由基清除率測定

精密稱取維生素 E31.29mg ，加 60% 乙醇超聲溶解并定容至 10mL （濃度為 12.5mmol/L ），再用無水乙醇稀釋，得到濃度分別為 0.025，0.050，0.0625，0.075，0.0875. 0.100mmol/L 的維生素E標準溶液。稱取DPPH0.10mg，置于棕色瓶中，加無水乙醇 1mL ，超聲溶解，再加無水乙醇 11mL ，超聲，得DPPH工作液。取“2.2.3\"項下供試品溶液，用 80% 甲醇稀釋，得到質量濃度為 25mg/mL 的待測液。取待測液 80μL 、無水乙醇 100μL ，混合，作為對照組。取待測液 80μL 、DPPH工作液 100μL ，混勻，作為樣品組。取不同濃度的維生素E標準溶液80μL DPPH工作液 100μL ，混合，作為標準曲線組。上述溶液均室溫避光靜置 10min 后，采用酶標儀于 525nm 波長處檢測吸光度值。每組設置3個平行孔。以維生素E標準溶液濃度為橫坐標 （x） 、吸光度為縱坐標 （y） 得到回歸方程為 y=0.0046x-0.0124（r=0.9942） 。按公式計算 DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=1×（204號 樣本的平均吸光度值;b：標準曲線的截距； a ：標準曲線的斜率； m ：質量；V：樣本加人體積）。結果顯示，10批樣品均具有清除DPPH自由基的能力，其中S9樣品清除能力最強。結果見表3。

2.3.3 FRAP的測定

精密稱取 FeSO₄?7H₂O27.80mg ，加雙蒸水溶解并定容至 10mL （濃度為 100mmol/L ），再用雙蒸水稀釋，得到濃度分別為 0.3、0.6、0.9、1.2、1.8、2.1、2.5mmol/L 的FeSO₄ ·7HO標準溶液。取PBS、TPTZ溶液和FeCl溶液（10：1：1，V/V/V），混勻，得FRAP工作液。取“2.2.3\"項下供試品溶液，加 0.01mmol/L PBS稀釋，得質量濃度為25mg/mL 的待測液。取待測液 5μL 、FRAP工作液180μL ，混合，作為樣品組。取不同濃度的 FeSO₄?7H₂O 標準溶液 5μL FRAP工作液 180μL ，混合，作為標準曲線組。各組溶液分別加入96微孔板中，于 37^°C 孵育5min，采用酶標儀于 593nm 波長處檢測吸光度值。每組設置3個平行孔。以 FeSO₄?7H₂O 標準溶液濃度為橫坐標 （x） 、吸光度為縱坐標 （y） 得到回歸方程為 y=0.30304x+ 0.001（ r=0.999 3， ）。按公式計算FRAP：FRAP 0 ΔA₅₉₃- b）÷a×f÷c_pr（ΔA₅₉₃ ：樣本的平均吸光度值;b：標準曲線的截距； a ：標準曲線的斜率；f：樣本加入檢測體系之前的稀釋倍數； c_pr ：待測樣本蛋白濃度）。結果顯示，10批樣品均具有FRAP，其中S8樣品的抗氧化能力最強。結果見表3。

2.3.4抗氧化活性綜合指數分析

因不同體外抗氧化模型體系反映不同的抗氧化機制，單一的指標難以綜合評價樣品的抗氧化能力，故本研究參考文獻[9]，根據表3中的測定結果，以抗氧化活性綜合指數（antioxidant potency composite index，APC）評估補腎寧神膏的抗氧化能力，計算公式為： APC= 該方法測定值/該方法測定最大值 ×100% ，平均綜合指數 （ABTS-APC+DPPH-APC+FRAP-APC）/3，以平均綜合指數 gt;70% 表示抗氧化能力較強[]。結果（表4）顯示，10批樣品的平均綜合指數為 85.08%～96.35% ，表明10批樣品均具有較強的抗氧化能力。

2.4 譜效關系研究

2.4.1 灰色關聯度分析

將10批補腎寧神膏的APC作為母序列，24個共有峰峰面積作為子序列，采用初值化變換法對數據進行標準化處理，采用SPSSpro軟件進行灰色關聯度分析。結果（表5）顯示，24個共有峰與APC的關聯度均不小于0.661，表明共有峰與APC存在關聯性，補腎寧神膏通過多成分共同發揮抗氧化作用。

2.4.2 偏最小二乘回歸分析

以10批補腎寧神膏的APC為因變量，24個共有峰峰面積為自變量，采用SIMCA14.1軟件進行偏最小二乘回歸分析。標準化回歸系數的正負分別表示各共有峰與抗氧化活性呈正相關或負相關。以變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值 gt;1 表明該共有峰對補腎寧神膏抗氧化活性有顯著貢獻[。圖3A結果顯示，10批補腎寧神膏的24個共有峰與APC的標準化回歸系數均大于0，均呈正相關。圖3B結果顯示，17個共有峰（峰 2，5～7，9，10，13～21，23，24） 的VIP值 gt;1 ，通過與對照品比對，指認出其中7個，分別為莫諾苷（峰6）、兒茶素（峰7）、芍藥苷（峰10）、異槲皮苷（峰13）、毛蕊花糖苷（峰14）、丹皮酚（峰23）及大黃素（峰24）。

圖3共有峰與APC的標準化回歸系數及VIP值

3討論

3.1 指標成分的選擇

酒川芎中的阿魏酸和兒茶素具有抗氧化、改善心腦血管功能等作用；牡丹皮中的芍藥苷、丹皮酚和異槲皮昔具有較強的清除自由基活性，可調節心血管功能[；毛蕊花糖苷是鹽女貞子的活性成分之一，具有神經保護作用[14]；炒酸棗仁中的斯皮諾素具有安神作用[];腺苷是山茱萸及鹽女貞子的共有成分，具有抗氧化、安神的作用；鹽女貞子、山茱萸、首烏藤分別含有的紅景天苷、莫諾苷和大黃素成分，均具有抗氧化功效[3.15-16]。因熟地黃中的主要成分易受炮制影響，茯神及龍齒的分析難度大[8]，故未對熟地黃、茯神和龍齒的有效成分進行分析。此外，由于腺昔在色譜圖中的峰形相對較差，故也未對其進行定量分析。綜上，本研究選擇紅景天苷、莫諾苷、兒茶素、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、異槲皮昔、毛蕊花糖昔、丹皮酚及大黃素作為含量測定的指標成分。

3.2樣品前處理及色譜條件的選擇

本研究分別對不同提取溶劑（甲醇、 85% 甲醇、 50% 甲醇）不同提取時間 （20，45，60min 進行了考察。結果發現，以甲醇為提取溶劑時，各色譜峰的峰面積大、峰形好。對補腎寧神膏進行 200～400nm 全波長掃描的結果顯示，當檢測波長為 230nm 時，色譜峰數目最多，能夠全面反映該制劑的指紋圖譜特征。對不同流動相體系（乙腈-水、乙腈 .0.1% 磷酸溶液、乙腈 .0.2% 磷酸溶液、甲醇-水、甲醇 .0.2% 磷酸溶液）的考察結果顯示，以乙腈 .0.2% 磷酸溶液為流動相時的分離效果最佳，色譜峰峰形良好。

3.3指紋圖譜、含量測定及譜效關系分析

本研究共有24個共有峰，指認出11個共有峰，且相似度 gt;0.96 。結合含量測定結果可知，10批樣品中的紅景天昔、異槲皮昔、丹皮酚含量差異顯著，其原因可能為藥材原料存在差異（如產地、采收季節等）。已有研究表明，不同產地女貞子可能存在品質差異，其質量標志物紅景天苷的含量亦呈明顯的地域性波動[9；異槲皮昔易光解，在貯存過程中易發生降解[20；丹皮酚在干燥及貯存過程中易揮發[21]。譜效關系研究結果顯示，24個共有峰與APC均呈正相關，有17個共有峰（峰 2.5～7.9.10 13～21、23、24）的VIP值 gt;1 ，表明這17個共有峰代表的化合物可能是補腎寧神膏發揮抗氧化作用的藥效成分。

綜上所述，本研究成功建立了補腎寧神膏的HPLC指紋圖譜及含量測定方法；莫諾昔等17個共有峰代表的化合物可能是其發揮抗氧化作用的藥效成分。

參考文獻

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