水晶香柚莖段離體誘導培養條件初探

中圖分類號：S666.3 文獻標識碼：A

Abstract：【Objective】To explore the suitable culture conditions virus-fre tissuecultureseedlings pomelo，inorder toscreenthe method eficientinductionadventitious budspomelo，providereferencefortheutilizationdevelopment pomelo germplasm resources sustainable healthy development in .【Methods】Adult Shui Jing Xiang pomelo branches were disinfected with varying NaClOconcentrations\"Bycomparing thedata，the appropriate explant disinfection methods，coection season，themostappropriatehormoneratiorotstock seed disinfectionmethods fortissueculture wereselected.Micro bud grafting experiments werecarriedouttoanalyze thesurvival status microbud grafting.【Results】 The optimal disinfection method for the explants Shui Jing Xiang pomelo was 75% alcohol +5% NaClO disinfection for 20min twice；The best timeforstem segment colection suitable for in vitro induction culture was in summer;The MS solid medium supplemented with 1mg/L （20 6- Benzylaminopurine （6-BA） ， 0.05mg/L indoleacetic acid（IAA） 0.5mg/L （204號 gibberelin（GA3）was beneficial tothe germination adventitiousbuds.【Conclusion】The most suitablecultureconditions foradventitiousbudinduction grapefruitexplants werepreliminarilyscreenedout，therootstocksedculturemethodwas preliminarilydetermined.Thegrapefruit Seedlings Grafted bymicrobud grafting technologygrew wellInthefuture，the grafting survivalratecould be improvedbyimproving the grafting technology，soasturther enhancetheappicatio value.

Key words： Shui Jing Xiang pomelo； in vitro culture；hormone ratio；micro bud grafting

柑橘是重要的經濟作物之一，國家統計局數據顯示，2022年底我國柑橘種植面積已達2 995.81hm² 、年產量突破6000萬t，占全球總產量的 1/3^[1-2] 。但近年來，隨著柑橘種植規模的不斷擴大，果園管理問題逐漸顯現，尤其是廢棄果園處理不當導致柑橘病害頻發的問題[3]。目前，世界上已報道的柑橘病毒和類似病毒病普遍具有傳播快、危害重、宿主終身帶毒等特點，傳統防治手段收效甚微[4]。在此背景下，微芽嫁接技術因能有效脫除柑橘體內中的多種病毒而備受關注[5]。莖尖組織培養是微芽嫁接的基礎環節，一些研究表明，莖尖組織培養仍面臨污染率高、芽體分化難等問題，這些內外部因素制約微芽嫁接技術在柑橘生產上的推廣應用[6-7]。前人研究顯示，使用 1%00HgCl₂ 雖能顯著降低外植體的污染率[6]，但其高毒性限制了應用，相比之下，NaClO作為替代方案安全性更高，但需進一步優化處理參數。例如，李麗[8]（2014）發現，采用 5% 和 10% NaClO對柑橘外植體進行消毒結合 1.0mg/L6-BA+0.5mg/L 吲哚3一乙酸（IAA） +1.0mg/L 赤霉素（GA3）更有利于柑橘腋芽萌發；周海霞[9]（2010）研究認為，添加 1.0mg/L6-BA+0.5mg/L 吲哚丁酸（IBA） +0.5mg/L GA3更有利于紅江橙腋芽萌發。盡管如此，柑橘嫁接技術仍面臨效率低下的問題，羅君琴等[10]（2011）報道其微芽嫁接萌發率僅為 0～20% ；隆雨薇[11]（2015）進一步指出微芽嫁接成活率不足 5% ，亟需技術突破。當前，柚類相關研究較少，尤其是消毒方法、激素配比與嫁接效率的系統性探索不足。本研究以水晶香柚為對象，篩選適宜的培養條件，旨在為后續微芽嫁接及培育柚類脫毒苗提供參考依據。

1材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為水晶香柚的成年態莖段，采自的柑橘種質資源圃，砧木種子為酸柚種子。

試劑： 75% 酒精、NaClO溶液（ 2.5% 和5.0% 、蔗糖、瓊脂粉、6－芐氨基嘌呤（6一BA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（ GA₃ ）、MS培養基、MT培養基等。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體采集

選擇晴天剪取水晶香柚生長健康的半木質化芽條，剪去葉片和刺裝入潔凈自封袋帶回實驗室，自來水沖洗、洗滌劑浸泡 10min ，再用流水沖洗干凈。將枝條剪成 3cm 的帶單芽莖段。

1.2.2 外植體消毒

根據NaCIO濃度及消毒時間的不同，共設置8種處理方法對水晶香柚莖段進行消毒處理，具體試驗設計見表1。MS固體培養（ ΔMS+40.0g/L 蔗糖 +6.0g/L 瓊脂）基中培養，培養溫度 27± 1^°C ，光/暗周期 16h/8h 。每組30段，3次重復。14d后統計污染率、褐化率和生長良好（未污染、未褐化）的外植體數。

污染率 （%）= 污染數/總數 ×100 褐化率 （%）= 褐化數/總數 ×100

1.2.3外植體采集季節篩選

分春（4月—6月）、夏（7月—8月）、秋（9月—10月）三季采集莖段，按照1.2.2中的消毒方式進行消毒和培養，10d后統計污染率。

1.2.4激素配比篩選

采用1.2.2和1.2.3篩選出的方法處理水晶香柚莖段，接種于下列含不同激素配比的MS固體培養基（見表2）中，每組接種30段，3次重復。培養溫度 27±1^°C ，光/暗周期 16h/8h 。14d后統計外植體的誘導率、平均出芽個數等。

誘導率 （%）= 誘導段數/未污染接種段數 ∵×100 平均出芽個數（個/段） Σ= 出芽總數/誘導段數

1. 2.5 砧木種子消毒

選取充實飽滿的酸柚種子，按照表3的處理方式進行種子消毒。種子剝取外種皮消毒后置于MT固體培養基中培養。培養條件為溫度 27±1^°C 、暗培養。每組50粒種子，3次重復。14d后統計種子的污染率和發芽率。

污染率 （% ） 污染種子數/接種種子總數 ×100

發芽率 （%）= 萌芽且未污染種子數/未污染種子總數 ×100

1. 2.6 微芽嫁接試驗

取培養誘導的外植體不定芽30個，與1.2.5中培養成功的黃化砧木進行微芽嫁接，嫁接后置于MT培養基 （MT+40.0g/L 蔗糖）中，利用濾紙橋法進行液體培養。培養溫度 27±1^°C 、光/暗周期 16h/8h 。觀察嫁接苗生長情況及成活率。

2 結果與分析

2.1外植體不同采集季節、不同消毒方法的消毒效果比較

由表4可知，水晶香柚外植體莖段在不同消毒組合處理下的污染率和褐化率具有較大差異。依據NaClO消毒濃度可將處理分為兩組，分別是組1（A、B、C、D）、組2（E、F、G、H）。將這兩組進行組內比較，單次消毒的污染率都很高，經兩次NaClO消毒（D、H組合）的污染率明顯降低，都在 30% 以下，但是隨著NaClO消毒時間的增加污染率降低，褐化率卻隨之升高；兩組間比較， 5% NaClO處理的試驗組整體污染率低于 2.5% 濃度處理的試驗組，褐化率則相反，組2高于組1。單看污染率和褐化率，兩者呈負相關，無法直接從平均值得出最佳消毒效果值。因此，根據表5統計的未污染、未褐化數據進行排名得出處理組H為最佳的消毒方式，該方式消毒后的正常生長莖段數最多，其次是處理組D，處理組F、G并列第3；從表4的統計數據還可以看出，不同采集季節的污染率和褐化率平均值差距在 10% 以內，相對而言夏季采集的外植體莖段的污染率和褐化率較低，秋梢次之，春梢最高。因此，用于外植體離體誘導培養的莖段最佳采集季節為夏季。

2.2不同激素配比對外植體萌芽效果的影響

由表6可看出，每個試驗組之間的出芽率差距不大；開始萌發的時間參差不齊，相差 3～5d 。最終統計時間為播種后的第 30d ，添加植物激素的試驗組均比對照組（組5）未添加任何激素的誘導率和平均出芽數高，其中，組3（ 1.0mg/L 6- BA+0.05mg/LIAA+0.5mg/LGA₃ ）的誘導率和平均出芽數最高，并且通過誘導培養的不定芽生長良好（見圖1），組2次之。

2.3不同消毒方法對砧木種子萌發的影響

根據表7可知， 2.5% NaClO消毒的砧木種子的污染率和發芽率均高于試驗組Ⅱ，因此黃化苗砧木種子培養的消毒方法可選擇用 2.5% NaClO消毒剝去外種皮的酸柚種子。

2.4微芽嫁接結果

將誘導的不定芽進行微芽嫁接30株，成活2株，成功率為 6.7% ；嫁接成活后1個月，嫁接苗葉片展開，多數葉片展開，生長情況良好（見圖2）。

3討論與結論

本研究通過試驗設計篩選水晶香柚莖段離體誘導培養條件，明確了外植體消毒方法、采集季節、激素配比及砧木種子消毒濃度。結果顯示，單次消毒處理的外植體污染率都較高，可能與柚類的表面具有較多絨毛結構特性有關，單次難以穿透外植體表層絨毛殺滅深層菌群，而采用 5% NaClO間隔^48h 兩次消毒（處理組H）顯著降低了外植體污染率（ 20.0% ，但褐化率提升（ 78.15% 。這一現象與吳思夢[12]（2017）對溫州蜜柑和紐荷爾臍橙的離體培養結果相似，也與前人研究中 HgCl₂ 的消毒效果相似[，但避免了 HgCl₂ 的高毒性風險，兼顧安全性與有效性。此外，夏季采集的外植體污染率和褐化率均低于春、秋梢，可能與夏季高溫高濕環境下植物組織代謝活躍、愈傷能力較強有關，但具體生理機制仍需進一步探究。

在激素配比方面，添加 1.0mg/L6-BA+ 0.05mg/LIAA+0.5mg/LGA₃ （組3）的培養基誘導率（ 65% ）和平均出芽數（1.62個/段）最優，表明適度提高細胞分裂素（6一BA）與低濃度生長素（IAA）協同作用可有效促進不定芽分化，與李麗[8]（2014）的柑橘研究結論一致。然而，赤霉素（ GA₃ ）的增效作用在本研究中更為顯著，可能與水晶香柚品種特異性相關。砧木種子消毒試驗中， 2.5% NaClO處理（組I）的污染率（ 18.67% ）雖略高于 5% 處理（組Ⅱ），但其發芽率（ 60.67% ）更高，提示低濃度NaClO更利于平衡消毒效果與種子活力保存，可能因高濃度消毒劑滲透過深損傷胚芽。

在微芽嫁接方面，成活率僅為 6.7% ，與羅君琴等[10]（2011）、隆雨薇[11]（2015）報道的柑橘嫁接萌發率（ 0～20% ）相符，表明柚類嫁接技術仍存在瓶頸。嫁接苗后續長勢良好，說明成活后的適應性較強，未來可通過優化嫁接操作（如砧木一接穗親和性匹配、嫁接切面的形狀、嫁接后培養條件調控等）進一步提高成功率。本研究雖初步篩選出培養條件，但樣本量較小，且未探究褐化抑制劑的添加效果，后續可進一步擴大試驗規模并引入抗褐化劑（如活性炭）以完善體系。

本研究明確了水晶香柚莖段離體誘導的最適宜條件，包括 5% NaClO兩次消毒、夏季采集外植體、 1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IAA + 0.5mg/LGA₃"的激素配比及 2.5% NaClO砧木消毒方法。盡管微芽嫁接成活率較低，但為柚類莖尖脫毒苗的培養和生產提供了技術基礎，對提升梅州地區柚類產業抗病能力及可持續發展具有重要意義，未來可進一步優化微芽嫁接技術以推動其實際應用。

參考文獻

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