UPLC-MS/MS法測(cè)定莓茶中安賽蜜等3種甜味劑

Determination of Three Sweeteners Including Acesulfame in Ampelopsis grossedentata TeabyUPLC-MS/MS

OUYANG Weiqi， RAO Qingqing， ZHANG Hui （Xiangxi Prefecture Food and Drug Inspection Institute， Jishou 416ooo， China）

Abstract： In this paper， an ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometer was established for the determination of acesulfame potassium，cyclamate and alitame in Ampelopsis grossedentata tea. The Ampelopsis grossedentata tea samples were extracted by pure water vortex ultrasonication，and then centrifuged with precipitant precipitation. With 5 mmol L^-1 ammonium acetate water- 0.1% forme methanol was used as mobile phase，gradient elution was used，Atlantis T3columnseparation，external standard qantification，and multi-reaction monitoring negative ion mode scanning.The results showed thatthe three sweeteners had a good linear relationship within their respective linear ranges （ （R²gt;0.999） ， and the limit of quantification was 0.003mg^.kg^-1 to 0.007mg^.kg^-1 The recovery rate of spike under the three levels was 83.02% to 99.52% ，and the relative standard deviation was less than or equal to 8.02% ，which met the detection requirements. This detection method is simple，reproducible， sensitive，and environmentally friendly，and can be used for the detection and daily monitoring of acesulfame potassium， cyclamate and alitame in Ampelopsis grossedentata tea.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Ampelopsis grossedentata tea; acesulfame potassium; sodium cyclamate; alitame

莓茶，葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄（Ampelopsisgrossedentata）植物，廣泛分布于云南、湖南、湖北、廣東、廣西、貴州等地，全國種植面積超1.3萬 hm² 莓茶史籍記載和食用歷史悠久，富含黃酮和多糖類活性成分，具有降血糖、保肝護(hù)肝等健康功效。隨著健康消費(fèi)理念的普及，代用茶市場(chǎng)呈現(xiàn)快速增長趨勢(shì)，莓茶憑借其差異化競爭優(yōu)勢(shì)，有望成為新興的健康飲品，目前已成為推動(dòng)湖南湘西地區(qū)鄉(xiāng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)[1-3]。不同產(chǎn)地、加工工藝及原料品質(zhì)的莓茶，其口感可能存在顯著差異[4。高品質(zhì)莓茶通常采用嫩芽或嫩葉制作，口感清甜回甘，而低品質(zhì)莓茶可能因原料粗老或加工不當(dāng)導(dǎo)致甜味不足，甚至帶有苦澀味。在這種情況下，部分商業(yè)化生產(chǎn)中可能通過添加甜味劑（如甜蜜素、安賽蜜等）來調(diào)和口感，彌補(bǔ)其天然風(fēng)味不足的問題。

目前市場(chǎng)上常用的人工甜味劑包括甜蜜素、阿力甜等，雖然在一定劑量內(nèi)被認(rèn)為是安全的，但長期過量攝人可能對(duì)人體健康產(chǎn)生不良影響，如影響腸道菌群平衡、增加代謝紊亂風(fēng)險(xiǎn)，甚至可能具有潛在的致癌性[5]。市場(chǎng)上的莓茶主要作為代用茶進(jìn)行銷售，根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760—2024）中對(duì)甜味劑的使用范圍和限量規(guī)定，代用茶中不得添加甜味劑[。目前對(duì)莓茶的研究及監(jiān)管主要集中在功效成分、污染物和農(nóng)藥殘留方面，針對(duì)甜味劑的研究和市場(chǎng)監(jiān)管存在一定的空白。因此，開展莓茶中甜味劑的檢測(cè)研究，對(duì)于保障食品安全和公眾健康重要意義。甜味劑的現(xiàn)行檢測(cè)技術(shù)主要包括離子色譜法（Ion Chromatography，IC）[7-8]、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC、高效液相色譜法（HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC） [10-12]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HighPerformanceLiquidChromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）等[13-15]。由于藤茶基質(zhì)復(fù)雜（富含多酚、黃酮、有機(jī)酸等），傳統(tǒng)的甜味劑檢測(cè)方法（如HPLC和GC）可能面臨干擾問題，容易導(dǎo)致假陽性，而UPLC-MS/MS可同時(shí)篩查多種甜味劑，靈敏度高、特異性好，可大幅提升檢測(cè)效率。因此，本研究進(jìn)行前處理優(yōu)化，并結(jié)合UPLC-MS/MS，建立莓茶中安賽蜜、甜蜜素、阿力甜3種甜味劑的檢測(cè)方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

11批莓茶，均為湘西州市場(chǎng)采購及抽樣所得。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨：色譜純；無水乙醇、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀：分析純；標(biāo)準(zhǔn)品阿力甜（純度為 99.7% ）：壇墨質(zhì)檢；標(biāo)準(zhǔn)溶液安賽蜜和甜蜜素（濃度均為 1mgmL^-1 ）：壇墨質(zhì)檢；超純水：實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2儀器與設(shè)備

TSQQUANTUMACCESSMAX超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，賽默飛；AP324W電子天平，島津;TG16-Ⅱ離心機(jī)，湖南平凡科技；UMV-2多管漩渦混合儀，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技；WP-CS-20S微量有機(jī)除熱源型超純水機(jī)，四川沃特爾水處理設(shè)備；MJ-BL25B3攪拌機(jī)，廣州美的生活電器制造；超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

阿力甜標(biāo)準(zhǔn)溶液（ 1mg^.mL^-1 ）：稱取適量阿力甜標(biāo)準(zhǔn)品 20mg 左右于 20mL 容量瓶中，用水溶解定容。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液（ 10μg?mL^-1 ）：分別吸取 1mg^.mL^-1 阿力甜、安賽蜜、甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.2mL 于 20mL 容量瓶中用水稀釋定容。

空白基質(zhì)制備：稱取陰性莓茶樣品 1g （精確到 0.1mg ），置于 50mL 塑料離心管中，加入純水 15mL ，先渦旋振蕩提取 10min ，再超聲提取20min ，然后加入 0.5mL 亞鐵氰化鉀（ 106g?L^-1 ）和0.5mL 乙酸鋅（ 220g?L^-1 ）這兩種沉淀劑，最后定容至 20mL 后渦旋混勻，以 9000r?min^-1 離心 5min ，吸取上清液過 0.22μm 水系濾膜待用。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液：用上述空白基質(zhì)將 10μg?mL^-1 混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液逐級(jí)稀釋成200、100、50、20、10、 Sng?mL^-1 和 2ng?mL^-1 系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，供UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 樣品前處理

莓茶樣品的前處理方法同1.3.1中空白基質(zhì)制備方式。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。Atlantis T₃ （ 150mm^×2.1mm ，3μm ），柱溫： 40^°C ，流速： 0.25mL?min^-1 ；進(jìn)樣量：5μL ；流動(dòng)相： 5mmoL?L^-1 乙酸銨水（A） -0.1% 甲酸甲醇（B）；梯度洗脫程序： 0～1.0min ， 95%A 保持不變； 1.0～3.5min ， 95%A?40%A ； 3.5～ 5.0min ， 40%A ： 5.0～5.1min ， 5.1～10.0min ， 2%A ; 10.0～10.1min ， 2%A?95%A 10.1～15.0min ， 95%A 。

（2）質(zhì)譜條件。選擇H-ESI源，掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，負(fù)離子掃描；霧化溫度： 350‰ ；毛細(xì)管溫度： 350‰ ；噴霧電壓： 3000V ；鞘氣壓力：40psi ；輔助氣流速： 10arb 。

1.4 數(shù)據(jù)處理

回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差用MicrosoftExcel2010進(jìn)行處理，UPLC-MS/MS相關(guān)數(shù)據(jù)采用其自帶軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取 10μg?mL^-1 混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，通過注射泵自動(dòng)進(jìn)樣方式，在H-ESI源和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，確定3種甜味劑的母離子。通過 MS⁺MS/ MS模式優(yōu)化子離子及相應(yīng)的碰撞能量，找出響應(yīng)值和穩(wěn)定性最好的兩個(gè)子離子，選擇響應(yīng)值高的作為定量離子，另一個(gè)作為定性離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本文比較了GOLD C₁₈ 柱和Atlantis T₃ 柱對(duì)3種甜味劑的分離效果，在同等梯度洗脫條件下，Atlantis T₃ 柱的分離效果和峰型更好，故本實(shí)驗(yàn)選擇Atlantis T₃ 色譜柱。

對(duì)比安賽蜜、甜蜜素和阿力甜在水－甲醇、水-乙腈、5mmol ?L^-1 乙酸銨水－甲醇、 0.1% 甲酸水-甲醇和 5mmol?L^-1 乙酸銨水 -0.1% 甲酸甲醇這5種流動(dòng)相中的分離效果及響應(yīng)值發(fā)現(xiàn)，乙晴對(duì)目標(biāo)物的保留時(shí)間較短且響應(yīng)值低，甲醇作為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物的峰型拖尾且分析時(shí)間長。在流動(dòng)相中加入乙酸銨和甲酸后，可有效改善這3種甜味劑，特別是安賽蜜的峰型、出鋒時(shí)間，響應(yīng)值也得到一定提高。對(duì)比有甲酸和乙酸銨添加的3種流動(dòng)相發(fā)現(xiàn)，5mmolL-1乙酸銨水 -0.1% 甲酸甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，3種甜味劑的峰型、分離效果和響應(yīng)值最為理想，所以本實(shí)驗(yàn)選擇 5mmol?L^-1 乙酸銨水 -0.1% 甲酸甲醇作為流動(dòng)相。優(yōu)化條件下3種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。

2.3樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

安賽蜜和甜蜜素極性高，易溶于水，阿力甜中等極性，水溶性低于安賽蜜和甜蜜素。所以本文采用水、水 + 沉淀劑、 20% 甲醇、 50% 甲醇、 70% 甲醇、20% 乙醇、 50% 乙醇、 70% 乙醇作為提取劑，通過基質(zhì)效應(yīng)和回收率進(jìn)行比較，選出最適合莓茶甜味劑提取的溶劑。

用空白基質(zhì)和水分別配制 100ng?mL^-1 的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液供UPLC-MS/MS分析，通過空白基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積與水配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)比值 gt;1 ，表示基質(zhì)有增強(qiáng)作用；當(dāng)比值 lt;1 時(shí)，表示基質(zhì)呈現(xiàn)抑制作用[]。莓茶基質(zhì)復(fù)雜，富含多酚、黃酮、有機(jī)酸等，基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果顯示（圖2），3種甜味劑在8種提取溶劑中都受到不同程度的基質(zhì)干擾，甜蜜素的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)尤為明顯，安賽蜜呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，阿力甜受基質(zhì)干擾最小。因此，本文采用空白基質(zhì)配標(biāo)來消除基質(zhì)干擾問題。

選取陰性樣品，用8種提取劑提?。ㄌ砑?2mgkg^-1 相同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)），比較不同提取劑的回收率?；厥章式Y(jié)果顯示（圖3）， 50% 甲醇和水 + 沉淀劑這兩種提取劑的整體提取效果最為理想。對(duì)比這兩種提取劑，發(fā)現(xiàn)使用水 + 沉淀劑作為提取劑過膜更容易，且基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果顯示安賽蜜的響應(yīng)值在水 + 沉淀劑中較 50% 甲醇中更高。綜合成本、操作簡便程度、基質(zhì)效應(yīng)和回收率結(jié)果，本文采用水 + 沉淀劑作為提取溶劑，空白基質(zhì)配標(biāo)，外標(biāo)法定量。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

按1.3.1項(xiàng)方法配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供UPLC-MS/MS分析，以安賽蜜、甜蜜素和阿力甜各自相應(yīng)定量子離子的峰面積為縱坐標(biāo)，以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，安賽蜜、甜蜜素和阿力甜在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù) R²gt;0.999 。分別以3倍和10倍的信噪比計(jì)算檢測(cè)限和定量限，檢出限在 0.001～0.002mg?kg^-1 ，定量限在 0.003～0.007mg?kg^-1 。相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果詳見表2。

2.5 回收率和精密度

取陰性莓茶樣品，分別添加0.2、 0.4mg^.kg^-1 和1.0mg?kg^-1 3 個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照1.3.2項(xiàng)方法處理，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算回收率和精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RelativeStandardDeviation，RSD）。由表3可知，安賽蜜回收率為 94.08%～ 98.20% ，RSD為3.74%～8.02% ；甜蜜素回收率為 94.36%～99.52% RSD為 4.04%～4.94% ；阿力甜回收率為 83.02% ＼～91.82% ，RSD為 1.01%～3.53% 。表明該方法能滿足檢測(cè)需求，可用于莓茶中3種甜味劑的檢測(cè)。

2.6 樣品測(cè)定

選取11批次莓茶，按本方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均未檢出安賽蜜、甜蜜素和阿力甜，未發(fā)現(xiàn)添加情況。

表明正規(guī)生產(chǎn)廠家的莓茶產(chǎn)品符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)，甜味劑濫用風(fēng)險(xiǎn)較低。這一結(jié)果同時(shí)反映出湘西莓茶行業(yè)在食品添加劑的使用較為謹(jǐn)慎，未出現(xiàn)為改善口感而違規(guī)添加甜味劑的現(xiàn)象。但本次檢測(cè)僅覆蓋正規(guī)廠家，未涉及小作坊或非正規(guī)渠道產(chǎn)品，可能存在盲區(qū)，基于市場(chǎng)多樣性及潛在違規(guī)動(dòng)機(jī)，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)范圍，并加強(qiáng)持續(xù)性監(jiān)督檢測(cè)，以評(píng)估莓茶市場(chǎng)甜味劑添加情況。

3結(jié)論

本文建立了UPLC-MS/MS測(cè)定莓茶中安賽蜜、甜蜜素和阿力甜3種甜味劑的測(cè)定方法，該方法前處理簡單，成本低，綠色環(huán)保，方法的回收率和精密度均能滿足檢測(cè)需求。同時(shí)，結(jié)合實(shí)際樣品分析，評(píng)估市場(chǎng)上莓茶產(chǎn)品的甜味劑使用狀況，旨在為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定和監(jiān)管政策的完善提供科學(xué)依據(jù)。通過本研究，期望能夠?yàn)檩璁a(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持，同時(shí)為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估貢獻(xiàn)力量。

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