水氮互作對(duì)陜南烤煙煙堿合成及代謝的影響

Effects of Water and Nitrogen Interaction on Nicotine Synthesis and Metabolism of Flue-Cured Tobacco in Southern Shaanxi

HAO Sujuan'，ZHANG Aojie2， WANG Pingping^，ZHANG Mingcheng2，AI Suilong2，ZHANG Lixin2 （'Lianhu DistrictMeteorologicalServiceCenter，Xi'an7o;CollegeofLifeScience，NorhwestAamp;FUniversity， Xianyang712ioo，Shaanxi;YantaDistrict InstituteofTobaccoScience，Xi'an710000）

煙草是我國(guó)的主要葉用經(jīng)濟(jì)作物之一，是卷煙生產(chǎn)的主要原料，還可用于提取尼古丁、木質(zhì)素等，具有較高的商業(yè)價(jià)值[1]。此外，煙草在國(guó)家稅收中有著舉足輕重的地位，同時(shí)在精準(zhǔn)扶貧方面發(fā)揮著重要作用。烤煙生產(chǎn)對(duì)提高農(nóng)民收人、推動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展有重要意義。

水分和肥料是影響煙草生長(zhǎng)的最為重要的兩大栽培因素。水分是肥料發(fā)揮效用、被作物利用的基礎(chǔ)，肥料是水土系統(tǒng)中影響作物生產(chǎn)效率的關(guān)鍵[3]。氮是作物生產(chǎn)的主要驅(qū)動(dòng)因素之一，與土壤水分條件有明顯互作[4-5]。施氮和灌水在提高烤煙水分利用率上存在顯著的互作效應(yīng)，在土壤水分不足時(shí)，施加氮肥能夠促進(jìn)烤煙對(duì)水分的利用，而在施氮量較多時(shí)，灌水又能促進(jìn)烤煙對(duì)肥料的吸收利用。水氮之間的互作效應(yīng)顯著促進(jìn)了烤煙干物質(zhì)的積累，影響烤煙株高、莖圍、葉面積等農(nóng)藝性狀，從而提高煙葉產(chǎn)量。 ¹⁵N 穩(wěn)定同位素試驗(yàn)表明，水氮互作可以顯著提高烤煙的氮肥利用率[。合理的水氮組合能協(xié)調(diào)烤煙各種化學(xué)成分含量，提高煙葉品質(zhì)。此外，施氮量增加可以提升烤煙的氧化防御系統(tǒng)，減輕水分脅迫下烤煙的氧化損傷[7]。

代謝物是細(xì)胞調(diào)控終產(chǎn)物，參與多種生化反應(yīng)及生理調(diào)控[，最接近生物的表型或者生理狀態(tài)，其種類、含量變化可以看作是生物體對(duì)表型或基因變化響應(yīng)的結(jié)果，更能反映生物的基因、環(huán)境與表型三者之間的關(guān)系。代謝組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，主要通過(guò)高通量檢測(cè)對(duì)生物體在限定條件下的代謝物進(jìn)行定性、定量分析，探究其代謝產(chǎn)物差異及代謝途徑的變化規(guī)律來(lái)揭示內(nèi)在機(jī)制[9-10]。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)新的分支，目前已經(jīng)成為繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新的研究熱點(diǎn)。Zhao等[運(yùn)用代謝組學(xué)方法分析不同產(chǎn)地來(lái)源的烤煙代謝物差異，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的烤煙代謝物呈現(xiàn)明顯的分離，不同生態(tài)區(qū)域可影響烤煙氮代謝等多種代謝途徑，進(jìn)一步篩選出多種與不同產(chǎn)地?zé)熑~香味特征有關(guān)的差異代謝產(chǎn)物，為煙葉香型的研究提供了理論依據(jù)。隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，在玉米、水稻等作物上通過(guò)代謝組學(xué)方法進(jìn)行機(jī)理探索的研究逐步深入。代謝組學(xué)技術(shù)在煙草研究中的應(yīng)用也逐步展開(kāi)[12-15]，成為全面、系統(tǒng)研究煙草對(duì)環(huán)境或外界刺激響應(yīng)機(jī)理的重要手段[12]。

本研究針對(duì)陜南煙區(qū)烤煙生產(chǎn)中的水氮供應(yīng)匹配性，以云煙99為材料，探究水氮互作對(duì)烤煙煙堿含量、煙堿合成過(guò)程中關(guān)鍵酶活性的影響，同時(shí)采用代謝組學(xué)方法探究不同水氮處理影響煙堿合成的內(nèi)在機(jī)制，旨在為烤煙產(chǎn)質(zhì)量調(diào)控提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況試驗(yàn)于2021年4-8月在西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)曹新莊試驗(yàn)站（ 34^°17^′23^′′N 108^°4^′12^′′E ，海拔 520m ）日光大棚內(nèi)完成。種植土壤為陜西省商洛市洛南縣植煙黃棕壤土，基本理化性質(zhì)： pH 值7.22，有機(jī)質(zhì)含量 10.25g/kg ，速效氮含量 30.25mg/kg ，速效磷含量 34.25mg/kg ，速效鉀含量 127.48mg/kg 。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)烤煙品種為云煙99，由陜西省煙草科學(xué)研究所提供。本試驗(yàn)涉及水、氮2個(gè)因素，其中土壤水分條件3個(gè)水平：W1（土壤相對(duì)含水量75%～85% ）W2（土壤相對(duì)含水量 55%～65% ）、W3（土壤相對(duì)含水量 35%～45% ），施氮量3個(gè)水平：N1（ 4g/ 株）N2（ 5g/ 株）N3（ 6g/ 株），雙因素完全組合設(shè)計(jì)共計(jì)9個(gè)處理（表1。煙苗成苗后移入桶中，每桶定植1株，移栽前保持桶中土壤相對(duì)含水量60% ，移栽后36d進(jìn)人旺長(zhǎng)期，開(kāi)始進(jìn)行水分處理。采用稱重法補(bǔ)水，控制土壤相對(duì)含水量，控水處理進(jìn)行 30d 。按照試驗(yàn)處理，稱取相應(yīng)克數(shù)的氮肥給每株煙苗進(jìn)行基施。

1.3樣品采集于移栽后36d（旺長(zhǎng)初期）51d（旺長(zhǎng)中期）66d（旺長(zhǎng)末期）85d（成熟期）分別對(duì)根部及葉片進(jìn)行取樣。葉片于 105% 殺青 30min 65°C 烘干至恒重，研磨并過(guò)100目篩，用于煙堿含量測(cè)定。取根尖3cm迅速放入液氮，后保存于 -80% 冰箱，用于測(cè)定煙堿合成途徑中關(guān)鍵酶的活性、代謝產(chǎn)物含量。取樣方式為各處理隨機(jī)3株樣品混合，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4測(cè)定項(xiàng)目與方法煙堿含量測(cè)定參考鄭璞帆[的方法并稍作改動(dòng)，采用HCI浸提法。稱取粉碎過(guò)篩烘干的煙葉樣品 0.03g ，加人 0.5mol/L 鹽酸溶液 25mL ，活性炭1/3角匙，震蕩 10min 后過(guò)濾，定容至 100mL ，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 236nm 、259nm 和 282nm 波長(zhǎng)的吸光度。

煙堿合成途徑中關(guān)鍵酶活性測(cè)定煙草根樣添加液氮后進(jìn)行粉碎，取 0.1g 加人 0.05mol/L 磷酸緩沖液（pH值7.4） 1.5mL ，充分混勻后 4^°C 下8000r/min 離心 20min ，上清液用于精氨酸脫羧酶（ADC）鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ODC）腐胺 N_- 甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）的測(cè)定，其測(cè)定步驟按照上海通蔚生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

代謝產(chǎn)物含量測(cè)定樣品前處理：煙草根樣添加液氮后進(jìn)行粉碎，取根樣 0.2g ，加入 75% 甲醇溶液 400μL ，充分混勻后超聲提取 30min，4^°C 下 14000r/min 離心 20min ，上清液用 0.22μm 有機(jī)相過(guò)濾器過(guò)濾后加入 2mL 進(jìn)樣瓶中，用于高分辨離子淌度液質(zhì)聯(lián)用儀HRLCMS（ LC-30A+ TripleTOF5 5600+ ）上機(jī)進(jìn)行正、負(fù)離子模式分析。

數(shù)據(jù)庫(kù)匹配將提取的峰信息在MassBank、Respect、GNPS這3個(gè)庫(kù)進(jìn)行全庫(kù)檢索與比對(duì)。數(shù)據(jù)庫(kù)匹配參數(shù)見(jiàn)表2。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用Excel2013、IBMSPSSStatistics26和RStudio1.3.1093.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)分析和做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1水氮互作對(duì)烤煙煙堿含量的影響由表3可以看出，不同水氮處理的烤煙中部葉煙堿含量在不同時(shí)間段均逐漸上升。移栽后36d，各處理的中部葉煙堿含量差異不大，此后水分控制開(kāi)始，各處理的中部葉煙堿含量差異逐漸增大，在移栽后66d各處理中部葉煙堿含量差異最為顯著。整體來(lái)看，同一時(shí)期相同氮肥處理下，中部葉煙堿含量隨著土壤相對(duì)含水量的增加而降低；W1N1和W1N2處理在整個(gè)過(guò)程中保持相對(duì)平穩(wěn)的增長(zhǎng)，在移栽后85d煙堿含量均較低；W3水分條件下，各時(shí)期中部葉煙堿含量均較高。同一時(shí)期相同水分處理下，中部葉煙堿含量隨著氮肥的增加而增加。

2.2水氮互作對(duì)煙堿合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響

由圖1可知，移栽后36d即控水之前各處理的精氨酸脫羧酶（ADC）活性無(wú)顯著差異。移栽后51d，相同氮肥處理下ADC活性呈現(xiàn)隨土壤相對(duì)含水量降低而升高的趨勢(shì)，且W3處理下ADC活性達(dá)到W1條件下的 1.64～1.81 倍；W1水分條件下，W1N2處理的ADC活性略低于其余處理，但無(wú)顯著差異；W2、W3水分條件下，ADC活性隨施氮量增加而增加，W2N2、W2N3處理的ADC活性較W2N1處理分別提高 10.7%.21.1% ;W3N2、W3N3處理的ADC活性較W3N1處理分別提高 0.5%.0.8% ；因此，隨土壤相對(duì)含水量降低施氮量對(duì)ADC活性的提升效果減弱。移栽后66d，W2水分條件下ADC活性最高，且隨施氮量增長(zhǎng)ADC活性提高；W3水分條件下，ADC活性較移栽后51d下降，且隨施氮量增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。移栽后85d，所有處理的ADC活性均處于較高水平，施氮量對(duì)ADC活性影響效果減弱。

由圖2可知，W1、W2水分條件下，各處理的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ODC）活性隨移栽后時(shí)間增加而增加，W3水分條件下，各處理ODC活性呈現(xiàn)隨移栽后時(shí)間增加先增加后降低再增加的趨勢(shì)。移栽后36d，各處理的ODC活性無(wú)顯著差異；移栽后51d，W2、W3條件下ODC活性隨施氮量增加而升高，其中W2條件下增幅較高，W2N2、W2N3較W2N1分別提高了 17.6%.28.6% ;移栽后66d，W3水分條件下，各處理較移栽后51d分別降低了 2.1%.6.9%.2.5% 移栽后85d，W1水分條件下ODC活性仍隨施氮量增加而提高，W2、W3水分條件下則隨施氮量增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

由圖3可知，所有處理的腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）活性均隨著移栽時(shí)間的增加而增加，移栽后36d各處理之間的PMT活性無(wú)顯著差異；進(jìn)行水分控制后，各處理PMT活性出現(xiàn)差異，整體表現(xiàn)為隨土壤相對(duì)含水量的降低PMT活性升高。移栽后36＼～66d，均以W3N3處理的PMT活性最高；移栽后85d，W1、W3水分條件下不同施氮量處理的PMT活性相近；W2水分條件下，W2N3處理的PMT活性最高，比W2N1提高了 17.6% 。

2.3水氮互作下烤煙代謝組學(xué)分析

2.3.1總體代謝物層次聚類分析對(duì)煙堿含量差距較大的W3N3和W1N1兩組處理進(jìn)行代謝組學(xué)分析，由PCA主成分分析結(jié)果可知進(jìn)樣過(guò)程中儀器運(yùn)行較為穩(wěn)定，可以用于后續(xù)的分析。對(duì)鑒定出的全部代謝物的相對(duì)定量值歸一轉(zhuǎn)化后進(jìn)行層次聚類得到圖4，列為所有樣本，行為全部代謝物，紅色代表高表達(dá)代謝物，藍(lán)色代表低表達(dá)代謝物。由圖4可以看出，有部分代謝物高、低表達(dá)交互在一起，但高、低表達(dá)區(qū)域較明確。同一組別樣品的高、低表達(dá)區(qū)域較為相近，不同組別樣品間高、低表達(dá)區(qū)域差異明確。

產(chǎn)物中包括10種有機(jī)酸，7種胺類，5種醇類，3種酚類，2種酮類，2種酯類，1種氨基酸類，1種堿類，其他類8種。

2.3.3代謝通路富集分析如圖6所示，差異代謝產(chǎn)物主要富集的代謝通路為：氨酰tRNA生物合成，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器，氨基酸生物合成，嘌呤代謝，代謝途徑，咖啡因代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，單酰胺類生物合成代射通路。氣泡圖中，氣泡顏色越深代表該通路差異顯著性越高，直徑越大代表富集到的代謝物越多。因此，在富集到的通路中，氨酰tRNA生物合成途徑富集的代謝物較少，但差異顯著性較高；代謝途徑富集的代謝物最多。

2.3.4煙堿代謝相關(guān)產(chǎn)物將已識(shí)別的代謝產(chǎn)物中與煙堿合成相關(guān)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖7，有部分代謝物高、低表達(dá)交互在一起，但有相對(duì)明確的高、低表達(dá)區(qū)域。

a為柱狀圖，b為氣泡圖；Valine，leucineandisoleucinebiosynthesis為氨酸亮氨酸和異亮氨酸生物合成，Purinemetabolism為嘌呤代謝，Monobactam biosynthesis 為單酰胺類生物合成代謝通路，Metabolic pathways為代謝途徑，Glutathione metabolism為谷胱甘肽代謝，

Cafeine metabolism為咖啡因代謝，Biosynthesis ofaminoacids為氨基酸生物合成，Aminoacy1-tRNAbiosynthesis為氨酰tRNA生物合成，Alanine，aspartate and glutamate metabolism為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，ABC transporter為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器

對(duì)煙堿合成相關(guān)代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖8。有9對(duì)代謝產(chǎn)物呈顯著正相關(guān)，有9對(duì)代謝產(chǎn)物呈顯著負(fù)相關(guān)。天冬氨酸、精氨酸含量與煙堿含量呈顯著正相關(guān)。初步判斷水氮處理對(duì)烤煙煙堿含量造成的影響可能是由于天冬氨酸、精氨酸含量的變化。

3討論

常規(guī)化學(xué)成分是判斷煙葉品質(zhì)好壞的關(guān)鍵因素[17]，煙堿是煙葉最重要的化學(xué)成分之一，煙堿是煙草特有的生物堿，影響烤煙的勁頭和刺激性，其含量高低是衡量烤煙品質(zhì)的重要指標(biāo)[18-22]。土壤水分條件會(huì)影響煙堿含量，本研究中中部葉煙堿含量表現(xiàn)為土壤相對(duì)含水量 35%～45% 最高， 75%～85%最低，這與汪耀富等[3研究結(jié)果一致。氮作為煙堿的重要組成成分，其施用量與煙堿含量密切相關(guān)。水分和氮肥在作物生長(zhǎng)中存在相互促進(jìn)、相互制約的關(guān)系。馬振奇[23]進(jìn)行水氮耦合研究發(fā)現(xiàn)，不同水氮處理下中部葉的煙堿含量均呈現(xiàn)隨土壤相對(duì)含水量降低而升高，隨施氮量增加而升高的規(guī)律。本研究中中部葉煙堿含量整體變化規(guī)律與之一致。

張瑞霞[24]測(cè)定了不同滲透脅迫程度下24h內(nèi)烤煙葉片精氨酸脫羧酶和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的酶活性變化，發(fā)現(xiàn)精氨酸脫羧酶活性隨脅迫程度的加劇而顯著升高，這與本研究一致；不同的是，在該研究中隨脅迫程度加劇、時(shí)間延長(zhǎng)，烤煙鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性無(wú)顯著變化，而在本研究中移栽后36d、51d烤煙根部鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性受土壤相對(duì)含水量影響較小，在移栽后66d土壤相對(duì)含水量 35%～45% 條件下其活性降低，這種差異是否是由取樣部位不同、處理時(shí)長(zhǎng)不同或者是由植株生長(zhǎng)水平不同帶來(lái)的尚需進(jìn)一步研究。本研究中，不同土壤水分條件下施氮量的增加不同程度上提高了精氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性，但其作用機(jī)制尚不明確。黃化剛等[25]研究表明，同等用氮量下有機(jī)氮相比于無(wú)機(jī)氮可以提高鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的表達(dá)量，導(dǎo)致烤煙上部葉煙堿含量增加。不同氮素形態(tài)也會(huì)影響精氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性，從而導(dǎo)致煙堿積累量的差異[26]。烤煙根系腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶活性與葉片煙堿含量呈顯著正相關(guān)[27-28]。

近年來(lái)，代謝組學(xué)不斷發(fā)展，為煙草的提質(zhì)增香及代謝機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。本研究中，精氨酸含量與煙堿含量呈正相關(guān)。對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，這種差異的形成可能是由于取樣部位不同造成，本研究所用材料為合成煙堿的根系部位，而向海英等[29]研究對(duì)象為烤煙葉片部位，根部與葉片部位的這種差異與煙堿合成、轉(zhuǎn)運(yùn)之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究；此外，研究共識(shí)別出4086個(gè)含有二級(jí)碎片的一級(jí)質(zhì)譜峰，鑒別出245個(gè)差異代謝產(chǎn)物。本研究中，對(duì)不同水氮處理后煙堿含量差異較高的兩個(gè)處理進(jìn)行代謝物提取及組學(xué)分析，共鑒別出190種代謝物，這種差異可能是由于取樣部位、提取效率、儀器分辨率等不同導(dǎo)致。識(shí)別出的代謝產(chǎn)物數(shù)量及精準(zhǔn)度是代謝組學(xué)精確分析的基礎(chǔ)，完善植物組織中代謝產(chǎn)物提取方法，提高代謝產(chǎn)物提取效率及比對(duì)精準(zhǔn)度是代謝組學(xué)發(fā)展的重要內(nèi)容。

4結(jié)論

施氮量對(duì)煙堿合成的作用效果因土壤相對(duì)含水量不同而有所差異，中部葉煙堿含量在土壤相對(duì)含水量 35%～45% 條件下最高，且以施氮量 6g/ 株處理煙堿含量最高，煙堿含量以W1N1處理最低。不同水分條件下適宜的施氮量可以提高煙堿合成關(guān)鍵酶活性，代謝物差異分析結(jié)果表明，差異代謝物在氨酰tRNA生物合成途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器通路、氨基酸生物合成途徑及嘌呤代謝中顯著富集；煙堿合成途徑代謝產(chǎn)物存在顯著差異，其中天冬氨酸、精氨酸含量與煙堿含量呈顯著正相關(guān)。

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（收稿日期：2025-02-19）