基于網絡藥理學的藤梨根治療結直腸癌的機制研究

[摘要] 目的 通過網絡藥理學和分子對接技術，探討藤梨根治療結直腸癌的作用機制。方法 通過中醫藥數據庫和疾病數據庫篩選出藤梨根主要化學成分的作用基因和疾病基因。通過蛋白質互作網絡分析主要基因，對主要化學成分和關鍵靶點進行分子對接。測定藥物對腫瘤細胞的影響，檢測信號通路關鍵蛋白水平。結果 藤梨根治療結直腸癌的主要成分為槲皮素、β-谷甾醇、蘆薈大黃素、兒茶素；作用靶點144個；蛋白質互作網絡的主要基因是AKT1、TP53、MAPK1、JUN及TNF等；識別網絡中的模塊共5個，參與多種生物過程和信號通路。各主要成分與靶點的對接活性極佳或較好。一定濃度的藥物可抑制結直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，且影響細胞PI3K/AKT信號通路。結論 藤梨根通過多途徑、多靶點治療結直腸癌，PI3K/AKT信號通路是可能的機制。

[關鍵詞] 藤梨根；網絡藥理學；分子對接；結直腸癌

[中圖分類號] R259" """"[文獻標識碼] A""" [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.17.011

Study on the mechanism of Actinidia Chinensis Planch Radix in treating colorectal cancer based on network pharmacology

MA Chenyang， WANG Yu， YANG Shaohui， LU Jun

Department of Colorectal Surgery， Ningbo Medical Center Lihuili Hospital ， Ningbo 315000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To explore the medicinal mechanism of Actinidia Chinensis Planch Radix （ACPR） in the treatment of colorectal cancer （CRC） by network pharmacology and molecular docking technology. Methods The genes involved in the effects of the main chemical components and disease genes of ACPR were screened from the TCM database and disease database. The main genes were analyzed through protein interaction network analysis， and molecular docking was performed on the main chemical components and key targets. The effects of the drug on tumor cells were measured， and the levels of key proteins in the signaling pathway were detected. Results The primary components of ACPR for treating CRC include quercetin， β-sitosterol， aloe baicalin， and catechin. It targets 144 protein interaction sites and were involved in the protein interaction network， with key genes including AKT1， TP53， MAPK1， JUN， and TNF. The recognition network includes five modules that were involved in various biological processes and signaling pathways. The main components exhibited excellent or good activity when interacting with these targets. At a certain concentration， the drug could inhibit the proliferation， invasion， and migration of colorectal cancer cells and affect the PI3K/AKT signaling pathway. Conclusion ACPR has been used to treat colorectal cancer through multiple pathways and multiple targets， among which the PI3K/AKT signaling pathway may be the mechanism.

[Key words] Actinidia Chinensis Planch Radix; Network pharmacology; Molecular docking; Colorectal cancer

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化系統惡性腫瘤，除常規的手術和放化療外，傳統中醫藥治療CRC的價值逐漸受到重視^[1-2]。藤梨根（Actinidia Chinensis Planch Radix，ACPR）作為治療惡性腫瘤的經典用藥，在腫瘤細胞生物過程中的作用和功效逐漸被發掘^[3]。本研究基于網絡藥理學和分子對接技術，探討ACPR治療CRC的分子生物學過程和機制。

1 "資料與方法

1.1 "ACPR化學成分及相對應作用靶點的檢索和篩選

通過傳統中醫藥化學成分數據庫（TCMSP數據庫、BATMAN-TCM數據庫、ETCM數據庫等）以關鍵詞“藤梨根”“獼猴桃根”檢索。考慮到ACPR及其相關方劑大都經口服用，故有效化學成分的口服生物利用度需gt;30%，類藥性需gt;0.18。將檢索到的化學成分在TCMSP數據庫中檢索對應的目標基因，利用Unitprot數據庫進一步整理。

1.2" 基因靶點網絡的構建和分析

在OMIM數據庫、GeneCards數據庫中檢索CRC疾病相關基因，去除重復和評分較低部分。將作用靶點和疾病靶點進行匯總，導入FunRich 3.1.3 軟件繪制韋恩圖，交集部分即是藥物作用疾病的核心靶點。使用Cytoscape3.8.2軟件，繪制“藥物-化學成分–靶點–疾病”網絡圖。

1.3 "蛋白–蛋白相互作用網絡構建

將核心靶點提交STRING 11.0 數據庫，進行蛋白–蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建。PPI網絡中密度較高區域可能代表分子復合體，稱為模塊。通過其具有的MCODE功能識別出 PPI網絡的子網，并對其參與的生物學過程進行描述。

1.4" 基因本體論分析和京都基因與基因組百科全書富集分析

將得到的核心基因靶點導入Metascape數據庫平臺，行基因本體論（gene ontology，GO）生物過程（biological process，BP）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。進一步預測其參與的生物過程和信號通路。通過SwissDock平臺模擬藥物成分和蛋白結構的對接結合能。

1.5 "實驗驗證

1.5.1 "材料與方法" 用不同濃度（分別設為0、100μg/ml、500μg/ml）ACPR水提物培養基，培育 正常生長的腫瘤細胞48h；隨后恢復普通培養基繼續培育，進行相關的實驗操作。人腸癌細胞系 SW480 由寧波市醫療中心李惠利醫院實驗室提供。ACPR水提物由浙江中醫藥大學提供。MTT 試劑盒（中國碧云天公司）；Western blot試劑盒（中國碧云天公司）；Matrigel 膠采（美國Corning公司）；Transwell 小室（美國Costar公司）；單克隆抗體（美國Abcam公司）。

1.5.2 "測定細胞增殖能力 "提取適量正常狀態的腫瘤細胞常規接種于96孔板，并設置12h、24h、48h、72h的培養時間梯度。依據設定的各時間節點，按照MTT比色法，加入試劑盒內提供的20μl MTT溶液。根據說明書檢測570nm吸光度值。

1.5.3 "腫瘤細胞侵襲實驗和遷移實驗 "①侵襲實驗：Transwell上室內平鋪50μl稀釋后的Matrigel膠晾干后備用。各組SW480細胞替換為不含胎牛血清的培養基，并配置為細胞懸液，以密度（1～2）×10?個/ml、容量200μl接種至Transwell上室，下室為500μl含有20%胎牛血清的培養基。常規培育48h，擦除Matrigel膠。0.1%結晶紫溶液染色20min。隨機選取5個100倍視野進行統計。②遷移實驗：將CRC細胞在六孔板內平鋪接種，每孔2ml，密度（2～3）×10?個/ml，3個復孔。培育24h；在確認腫瘤細胞正常平鋪生長后，以200μl的移液器槍頭在六孔板內垂直劃線，間距0.5～1.0cm范圍內，隨后替換更改為無血清培養基繼續培育24h。測量培養前后所畫細胞間隙間的垂直距離，得到劃痕愈合率。

1.5.4" 蛋白免疫印跡法對標志蛋白的測定 "收集各實驗組的細胞，運用預冷的裂解液提取細胞的總蛋白，并加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟化物避免樣品中蛋白水解，測定其濃度，留取樣本備用。根據濃度進一步計算和配置樣品，按照試劑盒說明書進行上樣、電泳和轉膜，用BSA封膜。常溫下，將硝酸纖維素膜浸入封閉液內1h，進行封閉。依次在冰箱冷藏環境（4℃）孵育一抗約10～12h，常溫下孵育二抗2h。條帶顯影使用試劑盒內提供的增強型化學發光液，拍照并記錄各條帶情況。用Image J軟件完成條帶灰度值的計算。

1.6 "統計學方法

采用 SPSS 18.0 統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（"）表示，組間比較采用t檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 "結果

2.1 "ACPR 關鍵靶點預測

共檢索到ACPR有效成分26種，按照條件篩選，得到的6種主要化學成分為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、蘆薈大黃素、兒茶素、（+）-表兒茶素。6種化學成分在TCMSP數據庫中共檢索到173個作用靶點，見表1。在疾病數據庫中檢索到1337個CRC較高評分的靶點。藥物作用靶點和疾病功能靶點交集的共同靶點114個。

2.2 "“成分-靶點”網絡圖的構建

基于“藥物–靶點–成分–藥物”網絡關系信息繪制“成分-靶點”網絡圖。網絡中不同成分、靶點及其關系分別用不同節點和灰色連線表示。其中，化學成分作用的靶點越多，其“藍色方形”越大。軟件分析計算各化學成分節點在網絡中的拓撲學數據信息，見表1。槲皮素作用靶點最多，β-谷甾醇、蘆薈大黃素和（+）-表兒茶素作用靶點較少，而豆甾醇和兒茶素幾乎無作用靶點，見圖1。

2.3" PPI網絡圖的構建

基于114個核心靶點構建PPI網絡圖，見圖2。根據PPI網絡中各基因靶點與其他基因相關關系的密切程度進行排序，與其他基因靶點關系越密切，則作為核心靶點基因的可能性越高；其中就包括AKT1、TP53、JUN、MAPK1、TNF、RELA、IL-6等。經Metascape數據庫MCODE功能對核心靶點進一步分析其潛在的子網，識別模塊，見圖3。部分生物學過程的功能描述見表2。

2.4 "富集分析與分子對接結果

富集分析各靶點基因可能存在的生物過程包括對無機物質的反應、對外來生物刺激的反應、對激素的反應等。可能存在的信號通路包括腫瘤信號通路、脂質與動脈粥樣硬化和PI3K/Akt信號通路等。各配體（藥物所含的重要化學成分）和受體（基因所對應蛋白結構）分子對接結果見圖4。其中β-谷甾醇與MAPK1的結合能數值最大（8.52kJ/mol），相互作用更易實現。

2.5 "實驗驗證

對不同藥物濃度處理過的SW-480細胞系進行MTT檢測，當藥物濃度達到一定時（500μg/ml），ACPR對結腸癌增殖能力產生抑制。通過Transwell侵襲實驗，500μg/ml藥物濃度處理過的高濃度組腫瘤細胞的侵襲能力與遷移能力差異均有統計學意義（Plt;0.05），見圖5。

檢測不同組的樣品中PI3K和AKT蛋白磷酸化水平發現，高濃度組腫瘤細胞的PI3K和AKT蛋白磷酸化水平差異有統計學意義（Plt;0.05），提示該信號通路可能受到抑制。

3 "討論

中藥網絡藥理學作為一門新興的交叉學科，是從多靶點、多通路、多層面利用現代醫學視角審查和研究傳統中醫藥的有效工具。利用現代醫學技術逐步解析中醫藥治療惡性腫瘤的內在機制，以期發掘傳統醫學的獨特價值。

傳統中醫藥理論認為ACPR性寒味苦，可用于治療腫毒、癌癥^[4]。考慮到傳統中醫藥大都經口服用、通過胃腸道消化吸收，對數據庫中檢索到的藥物成分按照一定標準進行篩選，可見并不是所有的化學成分均發揮實際作用。通過這些化學成分的作用靶點和CRC的疾病靶點進行匯總并經拓撲學計算，發現槲皮素是作用靶點最多的化學成分。研究表明槲皮素可通過抑制M2巨噬細胞極化和下調hsa_circ_0006990抑制CRC的發生，并通過抗炎作用在體內抑制腫瘤活性^[5-6]。ACPR提取液對肝細胞癌的相關藥物研究就有類似的發現，ACPR的主要化學成分槲皮素可通過多種基因靶點和信號通路抑制肝癌細胞的增殖和侵襲能力^[7]。

PPI分析結果發現AKT1、TP53等經典腫瘤相關基因^[8-9]。此外，整個PPI網絡中還存在密度較高區域，即模塊，這些區域可能代表分子復合體，是具有生物學意義的集合。這種意義包括兩方面： ①作為蛋白質復合體，多種蛋白間相互協同發揮生物學作用；②作為功能模塊，尤其是位于同一信號通路的多個蛋白分子，通過信號承接，對生物學功能的調節作用更加密切^[10]。通過對關鍵靶點基因進行富集分析，本研究發現ACPR作用CRC涉及的信號通路最重要的是在惡性腫瘤方面。Hu等^[11]發現ACPR提取物可通過Notch信號通路促進CRC細胞凋亡，進而顯著抑制腫瘤的生長。Gao等^[3]對胃癌的研究發現ACPR通過促進凋亡、鐵死亡和抑制間質轉化實現對胃癌細胞進展的抑制作用，并在斑馬魚的動物模型中得到印證。

利用計算機模擬各個化學成分間相互作用的可能性，可為相關基礎實驗提供前期參考。本研究中β-谷甾醇與MAPK1的結合能數值最大，二者間最容易發生相互作用。Sharmila等^[12]的研究表明β-谷甾醇可抑制MAPK1（Erk2）功能，通過MAPK信號通路實現抗腫瘤作用，與本研究結果類似。

進一步的基礎實驗也驗證了前述分析結果，但基礎實驗是在細胞水平進行的，無法模擬人體內復雜結構和腫瘤所處微環境。綜上，ACPR可通過多種信號通路和作用靶點實現對CRC的抑制，其中PI3K/AKT信號通路是其可能機制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–03–07）

（修回日期：2025–05–09）

基金項目：浙江省醫藥衛生科技項目（2022KY1081，2023KY1045）

通信作者：魯俊，電子信箱：56389756@qq.com