潤通萊蜜栓對慢傳輸型便秘小鼠的治療作用

崔長升 劉莉 齊濱 李鐵 趙晉瑩 曹家楨 李麗 孫琦 王金鳳 張昊旻

(長春中醫藥大學 1藥學院，吉林 長春 130117；2針灸推拿學院；3吉林正容醫藥發展有限責任公司；4吉林敖東延邊藥業股份有限公司；5長春中醫藥大學康復醫學院)

現代醫學認為，慢傳輸型便秘(STC)臨床主要表現為排便次數減少、便意減退甚則消失，且可伴有腹脹等癥狀〔1〕。在我國，STC發病率為4%～10%，且約1/3的老年人患有便秘，嚴重影響老年人的生活質量。中醫認為便秘多由腸中有熱，灼傷陰津所致。《蘭室秘藏·大便結燥門》謂：“若饑飽失節，勞役過度，損傷胃氣，及食辛熱厚味之物，而助火邪，伏于血中，耗散真陰，津液虧少，故大便燥結”。中醫通過辨證論治對STC的治療具有獨特的優勢，取得了較好的臨床療效，患者接受度高〔2〕。

潤通萊蜜栓是由蜂蜜、萊菔子、枳實、白術四味藥組成的臨床驗方，其中蜂蜜補氣溫中、潤燥通便，萊菔子健脾消食、行氣導滯，枳實健脾行氣、白術健脾益氣，四者聯用可起到行氣潤腸、通腑中郁滯的功效。但其治療作用及機制尚不明確，不利于臨床推廣及新藥開發，故本文旨在動物實驗中探討潤通萊蜜栓對STC小鼠的治療作用。

1 資料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 小白鼠(ICR，雄，體重18～22 g，SPF級)由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供；合格證編號：SCXK(吉)2016-0003。符合《動物實驗管理條例》規定。

1.1.2實驗材料 白術配方顆粒、萊菔子配方顆粒、枳實配方顆粒由廣東一方制藥有限公司提供。鹽酸洛哌丁胺膠囊(批號：180726655)由西安楊森制藥有限公司提供。枸櫞酸莫沙必利片(批號：181003)由江蘇豪森藥業集團有限公司提供。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自Solarbio，批號：20180704。山羊血清購自Solarbio，批號：20190408。一抗購自bioworld，批號：BS13278。c-kit抗體購自bioworld，批號：BS3621。二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒購自Solarbio，批號：20190416。

1.1.3實驗儀器 RM2245型RM2245型輪轉切片機，德國萊卡測量系統設備有限公司；EG1150H型自動包埋機，德國萊卡測量系統設備有限公司；HI1220型烘片機，德國萊卡測量系統設備有限公司；HI1210型鋪片機，德國萊卡測量系統設備有限公司；DK-420S型三用恒溫水浴槽，上海精宏實驗設備有限公司；尼康SMZ25型體視顯微鏡，北京瑞科中儀科技有限公司。

1.2動物模型制備及分組給藥 將小鼠平均分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、低、高劑量組。空白對照組采用蒸餾水灌胃，剩余組采用鹽酸洛哌丁胺膠囊(1.5 mg/kg)經口灌胃，2次/d，連續灌胃21 d〔3〕。待造模成功后，空白、模型對照組，給予蒸餾水灌胃；陽性對照組采用枸櫞酸莫沙必利片(2.5 mg/kg)經口灌胃；低、高劑量組分別給予0.05 ml/10 g、0.10 ml/10 g的潤通萊蜜栓經口灌胃，2次/d，共7 d。

1.3觀察指標

1.3.1活性炭推進率 經藥物治療7 d，禁食不禁水24 h。每組小鼠經炭末汁0.4 ml灌胃，灌胃完成立刻計時，30 min后將小鼠脫頸處死。幽門至所剪回盲處的距離計為腸管總長度，幽門至炭末汁前端處計為炭末推進長度〔4〕。

1.3.2觀察小鼠結腸病理結構改變 剪取小鼠近肛門部位長約2 cm的結腸組織，采用生理鹽水沖洗，置于10%中性甲醛溶液中固定，常規石蠟切片，厚度5 μm。HE染色后，顯微觀察結腸組織的結構〔5〕。

1.3.3觀察小鼠結腸內酪氨酸肌酶受體(c-kit)蛋白表達量 剪取小鼠約2 cm的結腸組織，生理鹽水沖洗干凈后，置于10%中性甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，切5 μm薄片，脫蠟、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗、加二抗、DAB顯色、復染細胞核、脫水封片、顯微鏡鏡檢。

1.4統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1小鼠小腸炭末推進率結果 與空白組相比，模型組炭末推進率明顯降低〔(56±4.90)%,P<0.01〕，鹽酸洛哌丁胺已使小鼠腸道蠕動減慢，降低腸道傳輸功能，說明造模成功；與模型組相比較，陽性、低、高劑量組小鼠的炭末推進率均明顯升高〔(85±7.08)%、(79±8.20)%、(82±7.78)%，P<0.01〕，陽性及潤通萊蜜栓給藥組對鹽酸洛哌丁胺造成的小鼠便秘均具有治療作用，且高劑量組炭末推進率接近陽性對照組。

2.2潤通萊蜜栓對小鼠結腸形態結構的影響 小鼠結腸切片顯示，模型對照組與空白對照組相比，結腸黏膜出現紊亂表征，肌層明顯變薄，并伴有炎性細胞浸潤現象；陽性對照組及低、高劑量組與模型組相比，小鼠結腸內黏膜排列趨向正常，且高劑量組肌層厚度最佳。見圖1。

圖1 小鼠結腸形態結構(HE)

2.3潤通萊蜜栓對小鼠結腸內c-kit表達的影響 免疫組化法檢測c-kit蛋白的表達如圖2所示，c-kit陽性呈現棕黃色顆粒。模型組小鼠結腸肌層、結腸黏膜內棕黃色顆粒顯著減少，說明c-kit蛋白表達較正常組顯著降低；與模型組比較，陽性藥組、低劑量組、高劑量組小鼠結腸內c-kit表達均有顯著升高。

圖2 小鼠結腸組織中c-kit表達(免疫組化法)

3 討 論

中醫在治療STC中，獲得了確切顯著的臨床療效〔6〕。潤通萊蜜栓是根據《傷寒論》蜜煎導方，結合多年臨床實踐而研制的，應用于各類便秘患者，尤其以慢性功能性便秘，取得了較好的臨床療效。方中蜂蜜具有補氣溫中、潤燥通便，萊菔子可健脾消食、行氣導滯、消食除脹、降逆化痰〔7〕，白術具有健脾益氣、燥濕利水的功效〔8〕，枳實具有破氣消極、化痰散癖等功效〔9〕，四者合用起到行氣潤腸，通腑郁滯的功效。

現代研究表明，白術含有揮發性成分、多糖類、內酯類、黃酮類、苷類等化學物質，具有抗腫瘤、抗炎鎮痛、改善記憶力、調節脂代謝、降血糖、抗血小板、抑菌等多種藥理作用〔10〕。枳實主要含有黃酮類、生物堿類、揮發油類等化學物質，具有調節腸胃運動、調節子宮功能、升壓、強心、抗氧化、抗菌、鎮痛、抗血栓等藥理作用〔11〕。萊菔子含生物堿、硫代葡糖苷、異硫氰酸鹽、黃酮、揮發油、脂肪油、蛋白質、多糖等化學物質，具有平喘、鎮咳、祛痰、抗氧化、降血壓、降血脂、抗菌、增強胃腸道動力、改善泌尿系統等多種藥理作用〔12〕，三者與蜂蜜合用具有調節胃腸道疾病的特點。

目前，有學者認為便秘與Cajal細胞有密切的關系〔13～15〕。與c-kit是Cajal細胞(ICC)的特異性標志物〔16〕，胃腸道中平滑肌收縮運動與ICC數量有關，結腸組織ICC數量減少將導致結腸動力障礙〔17〕。ICC的發育、生存、形態異常或過度自噬均可導致胃腸節律性電活動異常，是導致胃腸動力下降的重要原因之一，c-kit可通過與干細胞因子(SCF)結合，激活SCF-c-kit信號通路，用來維持ICC發育、生長，因此c-kit可作為STC檢測指標〔18～20〕。本研究說明潤通萊蜜栓具有促進c-kit表達的作用，潤通萊蜜栓與療效存在量效關系，而且治療效果比陽性藥組更佳。

本試驗結果證明潤通萊蜜栓對STC小鼠有較好的治療作用，為臨床應用提供了參考依據。