黔桂煙區煙草赤星病菌種群鑒定及其對藥劑敏感性的研究

中圖分類號： S432.4+4 文獻標識碼：A 文章編號：1008-0457（2025）03-0048-08

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2025.03.006

煙草赤星病是由鏈格孢屬（Alternaria）真菌引起的煙草主要葉斑病害之一，又稱褐斑病和赤斑病[]，在部分地方又被煙農稱為火炮斑或紅斑。該病最早于19世紀末被報道，20世紀初在我國北京附近首次發現，隨后在北方煙區爆發，并逐步傳播至全國各主要煙區[2-3]。煙草赤星病的典型病斑直徑可達 1～3cm ，常呈現同心輪紋和黃色暈圈的特征[4]。該病具有潛育期短、傳播速度快和具爆發性的特點[56]，至今在我國部分煙區仍維持較高的發病率，并造成嚴重的經濟損失。

在早期研究中，國外學者將引起煙草赤星病的病原命名為 Alternaria longipes（Ell.amp;Ev.）Mason[7]。隨著研究的深人，發現鏈格孢菌（A.alternata）也是煙草赤星病的主要病原[2]。由于A.longipes 和A.alternata在形態特征上極為相似，早期并未明確區分。近年來，隨著病原分類標準的完善和技術手段的進步，我國學者進一步明確了煙草赤星病的病原種類，包括鏈格孢菌（A.alternata）、長柄鏈格孢菌（A.longipes）鴨梨鏈格孢菌（A.yaliinficiens）和細極鏈格孢菌（A．tenuissima）等[8-o]，同時，不同煙區的病原種類和優勢種群存在顯著差異，并受栽培模式、氣候條件及病原傳播等多重因素的影響。這種病原種群的動態變化對當地煙草赤星病的持續防控提出了更高的要求，因此，定期完善各煙區的病原種類調查，對于制定科學有效的防治策略具有重要意義。

目前，煙草赤星病的防治措施仍以化學防治為主。然而，長期大量且單一的藥劑使用，致使病原菌對藥劑的抗藥性問題日益突出[11-12]。例如，作為主防藥劑之一的菌核凈，在我國大部分煙區已出現明顯的抗藥性，且赤星病菌對藥劑的敏感性、抗性水平及其分布存在顯著差異[13-15]。這種差異使得篩選高效、低毒且適宜輪換使用的藥劑成為煙草赤星病防控的關鍵。

賀州煙區是廣西壯族自治區（以下簡稱“廣西”）的重要烤煙種植區域[1，貴州長順煙區因烤煙種植歷史悠久，被視為中南部優質烤煙的重要生產基地[1]，而貴州威寧煙區作為全省種植面積最大、產量最高且品質最優的縣級煙區，在我國西南煙草生產中占據重要地位[18]。本研究以這三個煙區為對象，通過田間調查、病原分離鑒定及藥劑敏感性測定等方法，開展煙草赤星病的病原種類及敏感性研究，旨在明確并完善我國西南生態煙區煙草赤星病的病原種群組成及對藥劑的敏感性差異，為當地煙草赤星病的化學防治技術提供科學依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

2023年5月在廣西賀州（海拔 800m 左右，年氣溫 16.5～23.1°C ），2023年7月在貴州長順（海拔 1200m ，年平均氣溫 15.1°C ）和8月在貴州威寧（海拔 2000m ，年氣溫 10～12.4°C ）采集感病煙葉樣本。樣本經顯微鏡觀察后，采用病原菌分離純化法處理，并備用。

1.1.2供試殺菌劑和相關試劑

試驗中使用12種殺菌劑原藥，包括 95.8% 吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）和 98% 啶酰菌胺（boscalid）[師范大學提供]； 97% 咪鮮胺（prochloraz）、97% 惡霉靈（hymexazol） 98% 氟啶胺（fluazinam）、97% 醚菌酯（kresoxim-methyl）、 97% 戊唑醇（tebuconazole） 95% 苯醚甲環唑（difenoconazole）、98% 丙硫菌唑（prothioconazole）、 96% 烯唑醇（diniconazole） 97% 異菌脲（lprodione）和 97% 烯酰嗎啉（dimethomorph）［常熟恒耀新材料有限公司]；其他試劑包括丙酮（分析純）[重慶萬盛川東化工有限公司]，吐溫-80（分析純）[重慶擎科生物科技有限公司]和馬鈴薯葡糖瓊脂（PDA）培養基［青島海博生物技術有限公司]。

1.2 試驗方法

1.2.1病原菌的分離純化

病葉樣品經顯微鏡觀察后，采用組織分離法對病原菌進行分離培養。將樣本用 75% 酒精表面消毒后，用無菌水沖洗，晾干后裁剪成約 5mm×5mm 的病健交界組織塊，接種于PDA培養基，在 28^°C 下暗培養 5～7d 。待病葉組織長出菌絲后，切取干凈菌餅接種于新鮮PDA培養基，重復3次以完成病原菌的分離與純化。

1.2.2病原菌的致病性測定

采用柯赫氏法則驗證病原菌致病性。選擇健康的‘云煙87'煙株，采用刺傷接種法[19進行煙葉感病測定。具體步驟如下：用無菌水清洗煙葉表面，經 75% 酒精消毒后沖洗殘留酒精，晾干。適當劃破煙葉表面，在其對稱面分別接種直徑 9mm 的菌餅，每片煙葉接種6處。接種后用自封袋保溫，并以無菌脫脂棉保濕，將煙株置于約 25°C 的溫室內培養。觀察煙葉發病情況，病葉發病后再次分離病原菌，與初始菌株對比鑒定，以確認病菌的致病性。

1.2.3病原菌的形態學鑒定

將純化后的病原菌接種于PDA培養基， 28^°C 暗培養7d。記錄各菌株的菌落形態與顏色特征，待菌株產生孢子后，用顯微鏡觀察孢子和菌絲形態，依據形態特征進行初步分類鑒定。

1.2.4病原菌的分子生物學鑒定

采用柱式真菌基因組DNA提取試劑盒［產品編號：B518259，生工生物工程（上海）股份有限公司］提取病菌DNA。以引物對ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴增核糖體轉錄間隔區（rDNA-ITS），PCR反應體系為 25μL ，程序參照朱宇航5的方法。擴增產物經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京擎科生物科技有限公司重慶分公司進行測序。測序所得堿基序列在NCBI上通過BLAST比對分析，下載高度相似的模式菌株序列，同時參考煙草葉斑病相關研究，下載同屬不同種和不同屬的ITS序列（表1）。利用MEGA11軟件采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹。

1.2.5病原菌對藥劑的敏感性測定

按原藥有效含量稱取 _0.5g ，用丙酮溶解配制10 000mg/L 母液，現配現用。依據預試驗結果，設置以下濃度梯度： 95% 苯醚甲環唑、 96% 烯唑醇和98% 啶酰菌胺的濃度梯度設為 1、5、25、50、150 和300mg/L;95.8% 吡唑醚菌酯 97% 咪鮮胺 97% 惡霉靈 97% 戊唑醇 97% 異菌脲和 97% 烯酰嗎啉的濃度梯度設為 5、25、50、100、200 和 300mg/L;98% 氟啶胺 97% 醚菌酯和 98% 丙硫菌唑的濃度梯度設為10、30、60、120、250和 500mg/L 。將上述系列濃度的10倍液混勻后倒入 50～60^°C PDA培養基中，配制成藥劑與培養基體積比為1：9的含藥培養基，無菌水培養基為對照，重復3次。預試驗表明，丙酮與 0.1% 吐溫-80（丙酮體積分數約為 0.3% ）對病原菌生長無影響。

采用菌絲生長率法測定病原菌對藥劑的敏感性。用 9mm 打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種于含藥培養基中央，在 28^°C 恒溫暗培養 8d 。利用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，并根據李梅云等[13]提出的敏感性評定方法評估赤星病菌對藥劑的抗性水平（評定標準：高抗 E_c50? 100mg/L ；中抗 50mg/Lc50lt;100mg/L ；敏感E_c50?50mg/L， ）。抑制率的計算公式如下：

式（1）中 R 表示菌絲抑制率， D 表示對照菌落直徑（單位： mm ）， d 表示處理菌落直徑（單位： mm 。

1.2.6 統計分析

利用Excel2010和SPSS27軟件進行數據統計分析，計算相應的抑制中濃度（ E_cs0 ）、毒力回歸方程和相關系數 R² 等。

2 結果與分析

2.1田間病狀、病原菌的分離培養和致病性測定

廣西賀州、貴州長順和貴州威寧采集的煙草赤星病病斑如圖 _1-a，b 和c所示，樣本均來自栽培品種‘云煙87’的上部、中部和下部葉片。病斑形態呈近圓形，表面附有霉狀物和黑點，病斑中心呈深棕褐色，具有同心輪紋，周圍伴有黃色暈圈或與煙葉成熟期的淺黃色白斑相融合。病斑質地硬而易破，直徑約為 0.5～2cm ，符合煙草赤星病的典型癥狀特征。通過分離純化獲得3株菌株，分別命名為廣西賀州菌株GXHZ1、貴州長順菌株GZCS1和貴州威寧菌株GZWN1。對‘云煙 ₈₇? 煙株進行致病性測定，接種后6d在煙葉上形成黃褐色病斑（圖1-d、e、f），對照未發?。▓D1-g）。GZCS1和GZWN1在接種后第3＼～4天即開始發病，病斑較大且中心部位呈現棕色化；而GXHZ1則在第6天發病，病斑較小且顏色較淺。在顯微鏡下觀察發現，煙葉發病部位的分生孢子形態與田間病斑上的孢子一致。對發病組織再次進行分離純化，獲得的病原菌與接種菌株的形態特征一致。

2.2病原菌的菌落性狀及形態學鑒定

GXHZ1、GZCS1和GZWN1在PDA上的菌落形態如圖 2-a，b 和c所示。培養7d后，菌落直徑可達 65～75mm ，菌落呈圓形，整體菌絲呈灰白色絨毛狀，氣生菌絲較發達，生長中后期在菌落中心堆積。其中，GXHZ1菌落背面有褐色斑點聚集呈棕褐色，無輪紋，菌絲相對疏松；GZCS1背面呈淺棕褐色，輪紋不明顯；GZWN1背面呈棕褐色，有明顯輪紋，菌絲濃密。三者初生菌絲為白色，由邊緣到中心加深至褐色。病菌菌絲均為有隔、分叉菌絲（圖2-d），病原菌在PDA上能產生分生孢子和分生孢子梗（圖2-h），孢子尺寸較病斑上的小，且橫隔、縱斜隔減少，主要以短喙和無喙為主，其形態較為豐富。

GXHZ1、GZCS1和GZWN1在田間病斑上的分生孢子形態如圖2-e、f和 g 所示。其中，GXHZ1孢子呈黃褐色，孢子體較長、喙細長和無喙、球棒形，并具有5＼～8個橫膈和1～4個縱斜隔，孢子大小27～48μm×7～11.5μm ；GZCS1孢子呈褐色，有細長喙、短喙和無喙，呈棒狀或倒棒狀，具有 3～ 7個橫膈和0～3個縱斜隔，孢子大小 16～43μm×

5～10μm ;GZWN1孢子呈褐色和淺黃褐色，有細長喙、錐形喙、短喙和無喙等，孢子有棒狀、倒棒狀、卵形狀等，具有3＼～7個橫隔和1＼～3個縱斜隔，孢子大小 14.5～40μm×6～10.5μm 3個菌株的形態特征與朱宇航[5]對 A longipes和 A . alternata的描述相似，結合2.1和2.2初步鑒定為鏈格孢屬（Alternaria）病菌。

注：a、b和c分別為廣西賀州、貴州長順和貴州威寧煙葉赤星病病菌接種在PDA上的菌落形態;d為PDA上的病原菌菌絲;e、f和g分別為GXHZ1、GZCS1和GZWN1在煙葉上分離到的分生孢子和分生孢子梗；h為菌落在PDA上產生的分生孢子和分生孢子梗。

2.3 分子鑒定

通過測序獲得GXHZ1、GZCS1和GZWN1的ITS擴增序列，長度分別為530、574和 571bp 。在NCBI數據庫中與模式菌種序列進行比對后，結合其他參考序列構建了系統發育樹（圖3）。聚類分析顯示，GXHZ1 與 Alternaria longipes（KY542121.1）聚為一支，支持率為 90% ;GZCS1 和 GZWN1與 Alternariaalternata（PP094555.1）聚為一支，支持率為 65% 。結合形態特征，將GXHZ1鑒定為A.longipes，GZCS1和GZWN1鑒定為A.alternata。

2.4殺菌劑對病原菌菌絲生長的影響

室內毒力測定結果（表2和圖4）顯示，12種殺菌劑均對煙草赤星病菌的菌絲生長具有一定抑制作用，但抑菌效果因殺菌劑種類和病原菌菌株不同而存在顯著差異。以藥劑的半最大效應濃度（ E_cs0） ）為評價標準， E_cs0 值越小抑菌活性越強。藥劑對3株病菌的抑菌活性強弱順序為： 97% 咪鮮胺 gt; 95% 苯醚甲環唑 gt;98% 啶酰菌胺 gt;97% 惡霉靈 gt; 98% 氟啶胺 gt;97% 異菌脲 gt;96% 烯唑醇 gt;97% 醚菌酯 gt;97% 戊唑醇 gt;95.8% 吡唑醚菌酯 gt;98% 丙硫菌唑 gt;97% 烯酰嗎啉。具體分析發現，GXHZ1（A.longipes）對咪鮮胺、惡霉靈、啶酰菌胺、苯醚甲環唑和氟啶胺敏感， E_cs0 分別為17.701、24.531、26.587、31.500和 31.776mg/L ;對烯唑醇表現為中抗， E_cs0 為 84.651mg/L ;而對異菌脲、醚菌酯、戊唑醇、吡唑醚菌酯、丙硫菌唑和烯酰嗎啉表現為高抗， E_cs0 分別為101.374、139.232、447.441、732.017、2 020.218和 2 230.539mg/L 。GZCS1（A. alternata）對咪鮮胺、苯醚甲環唑、惡霉靈、啶酰菌胺、吡唑醚菌酯、戊唑醇、氟啶胺和烯唑醇敏感， E_cs0 分別為4.648、10.004、17.935、24.747、25.381、28.133、44.64和 48.517mg/L ;對異菌脲、醚菌酯和丙硫菌唑表現為中抗， E_cs0 分別為53.389、58.547和

77.570mg/L ；對烯酰嗎啉表現為高抗， E_cs0 為274.026mg/L 。GZWN1（A.alternata）對苯醚甲環唑、咪鮮胺、戊唑醇、啶酰菌胺、氟啶胺、吡唑醚菌酯、丙硫菌唑和惡霉靈敏感， E_cs0 分別為2.571、3.303，10.668，16.304，19.609，22.091，30.035 和31.758mg/L ;對異菌脲、醚菌酯和烯唑醇表現為中抗， E_cs0 分別為59.672、63.134和 90.555mg/L ；對烯酰嗎啉同樣表現為高抗， E_cs0 為 446.855mg/L 綜合分析顯示，A.longipes對大多數藥劑的抗藥性較高，而兩個A.alternata菌株對藥劑的敏感性和種類較為接近。

3 討論與結論

煙草赤星病是烤煙生產中的主要真菌病害之一，其病原屬于子囊菌亞門（半知菌亞門）鏈格孢屬（Alternaria），包含內生菌和腐生菌的混雜種群[24]。作為一種廣泛分布的病原，鏈格孢屬小孢子的種類繁多，且伴隨時間推移種群不斷演化，對小孢子種類的準確鑒定和分類完善具有重要意義。本研究表明，廣西賀州煙草赤星病的病原為A.longipes，這是繼A.alternata后另一病原的報道；貴州長順和威寧地區的病原菌均為A.alternata。結合前人研究，黔桂煙區的赤星病病原包括A.longipes和A.alternata，其中A.alternata為優勢種，更為普遍[25-26]。本研究發現，A.alternata 相較于A.longipes對煙草具有更強的致病力，其致病力的差異可能與胞外酶及毒素（如AT毒素和TA毒素）有關[27-29]，具體致病力分化機制需進一步研究。

通過對12種原藥的室內毒力測定發現， 97% 咪鮮胺 95% 苯醚甲環唑 98% 啶酰菌胺 97% 惡霉靈和 98% 氟啶胺對煙草赤星病菌表現出較強的抑菌效果，平均 E_cs0 分別為8.551、14.692、22.546、24.741和 32.008mg/L ，表明病原菌對這些藥劑敏感。因此，相應農藥制劑可作為后續田間防效驗證的備選參考。然而，不同藥劑間的抑菌效果存在顯著差異，這可能與藥劑的作用機制、病原菌的生理特性及試驗環境的差異有關[30-32]。本研究結果與朱宇航[5]和張彬彬[31]的研究結果類似，同時也體現出地區間的差異性。這表明，煙草赤星病的防治策略不能簡單復制，應定期監測不同地區病原菌對藥劑的敏感性變化，及時更新用藥方案，以確保

防效。

本研究結果顯示，A.longipes對大多數供試藥劑的抗藥性較強，而A.alternata菌株對藥劑更為敏感且菌株間差異較小。這與Tymon等[33]關于茄鏈格孢菌（A．solani）和A.alternata在啶酰菌胺和醚菌酯的抗藥性差異的結果一致。研究表明，同一屬內不同種群間的抗藥性差異可能源于靶標位點基因突變。例如，鏈格孢屬菌株中 β -微管蛋白的167位氨基酸由苯丙氨酸（Phe）突變為酪氨酸（Tyr）會導致對特定藥劑的抗藥性[34]；此外，病原菌鐵硫蛋白和嵌膜蛋白等靶標基因的突變，以及細胞色素b基因上的特定位點變異，也可能引起甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的抗藥性[35-36]。同時，當地的栽培技術、氣候環境以及長期用藥措施也會影響病原群體的抗藥性水平。例如，在田間條件下，若病原群體規模過大且缺乏與外界的基因流動，不合理的藥劑使用將加速抗藥群體的形成[37]

綜合分析顯示，病原菌對藥劑敏感性差異的形成受多方面因素影響，涉及內因（如基因突變）和外因（如栽培管理）。因此，在煙草赤星病的防治中，應適當采用不同作用機制的藥劑輪換使用，通過多靶點防治策略提高防效并延緩抗藥性的產生。此外，為更好地應對區域間病原群體的差異，應結合田間實際情況調整用藥方案，優先選用對當地病原菌敏感的藥劑。需要注意的是，本研究中A.longipes和A.alternata的供試種群數量有限，研究結果可能存在局限性。未來的研究應擴大菌株樣本量，進一步探究不同種群對藥劑敏感性差異的機制及其動態變化，從而為制定更為精準的防控策略提供依據。

（責任編輯：胡吉鳳）

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Zhao Qingxun Π¹ ，Gang Weili ^?1 ，Sang Weijun ¹ ， Liu Jianfeng ² ，Song Saijie ³ ，ShenJian ³ ，Sun Guangjun ⁴ ，Lu Guanlin ⁵ ， Wen Yun ⁴ ， Ai Yongfeng * （1.College of Tobacc Science，Guizhou University，Guiyang 55o25，Guizhou，China;2.InstituteofEntomology，Guizhou University，Guiyang 55o25，Guizhou，China；3.CollegeofChemistryandMaterials Science，Nanjing Normal University， Nanjing 21023，Jiangsu，China; 4.Guizhou Province Companyof China National Tobaco Corporation，Guiyang 550004，

Guizhou，China；5. Guizhou Tobacco Company Tongren City Company，Tongren ，Guizhou，China）

Abstract：To clarify the pathogenic species of tobacco brown spot in Guizhou and Guangxi tobacco regions and analyze theirsensitivityto fungicides，this study provided scientificguidance for effectivediseasecontrol.Pathogens were isolatedand purified fromsymptomatic tobacco leavescollected in Hezhou（Guangxi），Changshun（Guizhou），and Weining（Guizhou）using the tissue isolation method.Pathogen identification was performed through morphological and molecular analysis.Additionally，thesensitivityof thepathogens to12 fungicideswas evaluatedusing themycelial growth rate method.The results indicated that the pathogen causing tobacco brown spot in Guangxi was Alternaria longipes，whileAlternaria alternata was identifiedas the pathogen in both Guizhouregions.A.alternata exhibited stronger pathogenicity compared to A .longipes. Fungicide sensitivity tests revealed that A. longipes exhibited higher resistance to most fungicides，whereas A .alternata was more sensitive. The E_cs0 values of 97% prochloraz， 95% （20 difenoconazole， 98% boscalid， 97 % hymexazol，and 98% fluazinam were all below 5O mg/L，demonstrating excellent inhibitory efects onmycelial growth，making them the preferred choices for disease management.This study highlighted theimportance of regionalized control strategiesandprovides a scientific basis for managing tobaccobrown spot in Guizhou and Guangxi tobacco regions.

Keywords ：tobacco brown spot；pathogen identification； Alternaria ； antibacterial activity； sensitivity