玫瑰和桂花復配提取物的體外護膚功效研究

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】A 【文章編號】1007－8517（2025）11－0030-05

DOI： 10.3969/j .issn.1007-8517.2025.11.zgmzmjyyzz202511007

Study on in Vitro Skincare Effect of Rose and Osmanthus Flower Compound Extract

CHEN Zhixiong1XIA Jin2ZHU Tingheng2YAN Cui1HONG Ni1CAO Ping1 1.Huzhou Jahen Industrial Co.，Ltd.，Huzhou 31300o，China; 2.Wukang Sub-district Community Health Service Center of Deqing County，Deqing 3132Oo，China; 3.College of Biotechnologyand Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310ooo，China

Abstract：ObjectiveTo investigatetheskincare efectsof Damascusroseandosmanthus flowercompound extract（ROT）on whitening，anti-oxidation，andanti-agingin vitro，various methodswereemployed.MethodsTheimpactofROTonthegrowth activityof B16F10cellswasasessedusing theCCK-8method，while the DPPHscavengingabilityandABTSscavengingabilityof ROTwas evaluated throughafreeradicalscavenging test.Theefectof ROTonmelanincontentinB16F10cels wasdetermiedusing thesodiumhydroxidecrackingmetod，andtheinhibitionofelastasebyROTwasstudiedthroughanelastaseinhibitiontestAddion aly，the eyeiitationpotentialofROTwasexaminedusingthechickembroalantoic membranemethod.ResultsTeresultsindicated that ROT concentrations ranging from 0. 1% to 2% had no adverse effects on B16F1O cell growth. Furthermore，the DPPH and ABTS test demonstrated that ROT concentrations of 0.5% to 2% exhibiteda high free radical scavenging ability of up to 90% .The melanin content influence test revealed that ROT concentrations of 0.1% to 2% significantly inhibited melanin production in B16F10 cells.Moreover，the elastase inhibition experiment showed that ROT concentrations of 0.1% to 2% effectively inhibited elastaseactivitynaconcentration-dependent manner.ThechickembryoalantoicmembranemethodconfirmedthatROTdidnotcauseeyeritation.ConclusionROTdemonstrated notableabilitiesinclearingDPPHandABTS，inhibitingmelaninproductioninB16F1cells， andinhibitingelastaseactivityinvitro，allwilesowingnoeyeiitationTesefidingssuggestthatROT，asaskinareactiesubstance，holds promise for in vitro whitening，antioxidant，and anti-aging effcts，with a certain levelof safety.

Key words：ROT；in Vitro Efficacy；Cell；Security

玫瑰，薔薇科薔薇屬灌木，是一種藥食同源植物[1]。玫瑰在我國新疆、甘肅、平陰等地大量種植，國內(nèi)的玫瑰品種主要包括山東平陰傳統(tǒng)玫瑰、河南鄢陵玫瑰、北京妙峰山玫瑰等2，國外引進的玫瑰主要包括大馬士革玫瑰花、保加利亞玫瑰花等。玫瑰花中富含黃酮、多酚、多糖和氨基酸等活性成分，具有顯著的護膚功效[3]。周穎等[4]發(fā)現(xiàn)通過水蒸氣蒸餾法獲得的玫瑰純露含有維生素E、胡蘿卜素等活性成分，且具有補水保濕、滋養(yǎng)護發(fā)等功效。曹陽5研究發(fā)現(xiàn)玫瑰提取物在體外能顯著抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素的生成。

桂花，作為木犀科木樨屬植物，又稱九里香、金桂、銀桂等，是我國的傳統(tǒng)十大名花之一。桂花含有糖類、黃酮、蛋白質(zhì)等多種活性物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抑菌等功效[7]。王玥等[8]研究表明桂花發(fā)酵液具有顯著的DPPH、ABTS自由基清除能力。包騏林等研究發(fā)現(xiàn)桂花提取物在體內(nèi)外都具有較好的抗氧化活性。譚志梅等[\"提取了桂花色素，并研究發(fā)現(xiàn)桂花色素對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等具有顯著的抑菌功效。

本實驗利用體外B16F10黑色素細胞模型研究ROT的體外美白護膚功效，利用DPPH和ABTS清除其抗氧化功效，通過彈性蛋白酶抑制其體外抗衰功效，并通過雞胚尿囊膜方法研究其眼刺激性，為化妝品活性物體外功效研究提供方法參考。

1材料與方法

1.1主要實驗材料小鼠黑色素瘤細胞（B16F10細胞）（上海富恒生物科技有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、CCK－8試劑盒、TargetMol、DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞礬（細胞培養(yǎng)級別）（北京索萊寶生物科技有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸－對硝基苯胺（N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide，AAAPAN）、沒食子酸標準品（EGCG）（美國sigma公司）；維生素C（Vc）、彈性蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司）；DPPH檢測試劑盒、ABTS檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RNAisoPluskit、Prime-ScriptTMRT reagentKit、TBGreenqPCR（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；SPF雞蛋（江蘇勃林格殷格維通生物技術(shù)有限公司）；大馬士革玫瑰和桂花復配提取物：ROT（湖州嘉亨實業(yè)有限公司自制）。

1.2主要實驗設備二氧化碳培養(yǎng)箱、HWS-12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（上海啟步生物科技有限公司）；TDL-60C低速離心機（上海安亭科學儀器廠）；多功能酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Bio-radCFXConnect（伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司）；正大微生物全自動孵化機（山東省德州市正大孵化設備基地）。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基（含胎牛血清10% 和青鏈霉素 1% ）培養(yǎng)B16F10細胞，在37^°C 、 5% 的 CO₂ 培養(yǎng)箱里面培養(yǎng)細胞達到濃度85% 左右，使用胰蛋白酶消化 3～5min ，觀察細胞狀態(tài)為圓形且不貼壁后加入DMEM培養(yǎng)液使其消化結(jié)束，再離心收集細胞，最后使用DMEM培養(yǎng)基緩慢吹打細胞懸液并進行計數(shù)鋪板，用于下面的細胞相關(guān)實驗。

1.3.2B16F10細胞的活力檢測選用CCK-8法測B16F10細胞的活性，選取對數(shù)生長中的B16F10細胞，根據(jù) 5×10⁴ 個細胞/孔接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，放人二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。實驗分為空白組、實驗組（添加ROT體積分數(shù)分別為0.1% 、 0.2% 、 0.5% 、 1% 、 2% ），每組設置5個復孔，樣品作用于細胞 24h 后再加入CCK-8試劑， 3～4h 后在酶標儀 450nm 處測吸光度。按照以下公式計算相對細胞活性：

相對細胞活性

1.3.3 DPPH自由基清除能力檢測 DPPH自由基清除能力實驗嚴格按照試劑盒說明書進行測定，以維生素C（Vc）作陽性對照，Vc和ROT測試濃度均為 0.1% 、 0.2% 、 0.5% 、 1% 和 2% ，每組濃度3次重復。按照以下公式計算清除率：

1.3.4ABTS自由基清除能力檢測ABTS自由基清除能力實驗嚴格按照試劑盒說明書進行測定，以維生素C（Vc）作陽性對照，Vc和ROT測試濃度均為 0.1% 、 0.2% 、 0.5% 、 1% 和 2% ，每組濃度3次重復。按照以下公式計算清除率：

ABTS 自由基清除率（%）=（1-實驗組A7m）1.3.5B16F10細胞的黑色素含量檢測 參考蔣勇炫等[1]的實驗方法培養(yǎng)B16F10細胞，選擇對數(shù)生長中的B16F10細胞進行實驗，用 0.25% 的胰蛋白酶消化細胞，按照每孔 5×10⁵ 個細胞接種在6孔板中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，注意B16F10細胞的生長狀況，若細胞狀態(tài)良好棄去上清液，加入DMEM培養(yǎng)基后再加入 200μL 的樣品進行檢測，樣品濃度分別為 0.1% 、 0.2% 70.5% 、 1% 、 2% ，每組ROT濃度設置5個復孔。培養(yǎng) ^48h 后，每孔棄去上清液，PBS清洗1～2次，加入 200μL 含有 10% DMSO的氫氧化鈉溶液，在 80^°C 水浴鍋中反應 40min ，最后在多功能酶標儀上 405nm 處測吸光度。計算公式為：

相對黑色素含量

1.3.6彈性蛋白酶活性檢測參考王麗麗等[1]的實驗方法進行彈性蛋白酶抑制實驗，并在此基礎(chǔ)上稍加修改。取 85μL50mmol/LTris-HCl 緩沖液 （ pH8.0 ）與 15μL 的ROT混合后加人 25μL 彈性蛋白酶溶液（ ），在 25^qC 下孵育15min ，然后再加入 25μL1.015mmol/L AAAPAN溶液，大約 15min 后在 410nm 處測定吸光度值，彈性蛋白酶溶液和AAAPAN溶液均用 50mmol/L Tris-HCl緩沖液（ pH8.0 ）配制，以EGCG溶液作為陽性對照，每個濃度組測定3次。彈性蛋白酶的抑制率計算公式為：

式中：A指樣品ROT和酶的反應溶液的吸光度；B指無酶的反應溶液的吸光度；C指無ROT的反應溶液的吸光度；D指無ROT和酶的反應溶液的吸光度。

1.3.7雞胚絨毛尿囊膜實驗采用雞胚絨毛尿囊膜實驗方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的動物實驗方法來評價樣品的眼刺激情況[13]，雞胚絨毛尿囊膜實驗方法參照《化妝品評價替代方法標準實施指南》第八章第二節(jié)，選用反應時間法進行試驗，同時設置陰性（ 0.9% NaCl）和陽性對照組（ 0.1mol/LNaOH） 。1.4數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)果采用Excel處理數(shù)據(jù)并用Origin軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗組均重復3次，數(shù)據(jù)以均值加減標準差（ ）表示，各組間使用單因素方差分析， Plt;0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1ROT對B16F10 細胞生長活性的影響含有體積分數(shù)為 0.1%～2% 的ROT作用于B16F10細胞 24h 后，再采用CCK-8試劑檢測其生長活性。實驗結(jié)果如圖1所示，體積分數(shù)為 0.1%～2% 的ROT對B16F10細胞的生長活性均沒有影響，可知在這濃度范圍內(nèi)的ROT對B16F10細胞沒有毒性，可用于后續(xù)的其他細胞相關(guān)功效檢測實驗。

2.2ROT對DPPH自由基清除能力的影響清除自由基也被叫作抗氧化，人體中自由基過量時，會產(chǎn)生衰老等相關(guān)癥狀。早在1958年就已經(jīng)出現(xiàn)DPPH法用于檢測食品等樣品的抗氧化能力[4]本實驗選取體積分數(shù)為 0.1%～2% 的ROT檢測清除自由基的能力，如圖2所示， 0.1% 、 0.2% 、0.5% ROT清除DPPH自由基能力逐漸遞增，具有濃度依賴性，在 0.5% 時清除DPPH自由基能力達到 90% ，與陽性對照組 0.5%Vc 相比，清除DPPH自由基能力一致。在 0.5% ROT濃度后，清除DP-PH自由基的能力稍微有點下降，比陽性對照組Vc清除DPPH自由基能力低。本實驗證明了ROT具有較高的清除DPPH自由基能力，推測ROT具有一定的體外抗氧化護膚功效的潛力。

2.3ROT對ABTS自由基清除能力的影響ABTS清除能力檢測作為評估抗氧化劑效果的常用方法之一，通過檢測樣品對ABTS自由基的清除能力，可評估其抗氧化效果，該方法廣泛應用于食品和化妝品等領(lǐng)域[15]。如圖3所示，ROT 隨著體積濃度的增加，清除ABTS自由基能力逐漸遞增，具有一定濃度依賴性。在 2% 時清除ABTS自由基能力達到 90% 以上，與陽性對照組 2% Vc相比，均具有有效的ABTS自由基清除能力。本實驗證明了ROT具有較高的清除ABTS自由基能力，與2.2DPPH結(jié)果相一致，推測ROT具有一定的體外抗氧化護膚功效的潛力。

2.4ROT對B16F10 細胞的黑色素含量的表達如圖4所示，實驗結(jié)果顯示體積分數(shù)為 0.1%～2% 的ROT均能顯著抑制B16F10細胞中黑色素的生成，且與空白對照組相比具有顯著的統(tǒng)計學差異。B16F10細胞是體外篩選化妝品美白劑的常用細胞模型，具有成本低、周期短的特點。結(jié)合上述細胞生長活性實驗結(jié)果推斷，體積分數(shù)為 0.1%～2% 的ROT具有體外抑制黑色素生成的美白護膚功效的潛力。

2.5ROT對彈性蛋白酶的抑制能力彈性蛋白酶能夠水解膠原蛋白、彈性蛋白等多種蛋白質(zhì)，而皮膚中的彈性蛋白被水解后，將會導致皮膚衰老等癥狀，因此彈性蛋白酶是常用的抑制皮膚衰老的研究靶點[16]。如圖5所示，體積分數(shù)為 0.1% ＼～2% 的ROT對彈性蛋白酶的抑制率逐漸升高，具有濃度依賴性，且在 2% 時對彈性蛋白酶的抑制率最高，達到 26% ，但是和EGCG對照組相比抑制效果較低。實驗結(jié)果證明，一定濃度的ROT對彈性蛋白酶活性具有一定的抑制效果，推測一定濃度的ROT具有體外抗衰老的護膚功效潛力。

圖4ROT對B16F10細胞中黑色素生成的影響情況圖

注：與空白對照組相比， ^***Plt;0.001 。

2.6眼刺激性實驗本實驗嚴格按照《化妝品評價替代方法標準實施指南》第八章第二節(jié)雞胚絨毛尿囊膜實驗方法，使用 0.1mol/LNaOH 作為陽性對照并用生理鹽水作為陰性對照。通過雞胚絨毛尿囊膜實驗發(fā)現(xiàn)，ROT原液沒有眼刺激性，推測ROT作為化妝品活性物具有一定的安全性。

3結(jié)論

體積分數(shù)為 0.1%～2% 的ROT作用于B16F10細胞 24h 后，CCK-8實驗結(jié)果表明均對細胞的生長活性沒有影響，因此選擇 0.1%～2% 的濃度用于后續(xù)的功效。通過自由基清除能力實驗表明， 0.1%～2% 濃度ROT均有清除DPPH和ABTS自由基能力，且在 0.5% 時清除DPPH自由基能力達到 90% ，而在 2% 時清除ABTS自由基能力達到 90% 。與陽性對照組Vc相比，ROT均具有一定清除DPPH和ABTS自由基能力。從彈性蛋白酶活性實驗結(jié)果表明， 0.1%～2% 濃度的ROT對彈性蛋白酶活性都具有一定的抑制效果，且抑制效果具有濃度依賴性，但與陽性對照EGCG相比，抑制效果比較弱；最后通過雞胚絨毛尿囊膜實驗表明，ROT沒有眼刺激性。綜上所述，推測ROT作為一種護膚活性物具有體外美白、抗氧化、抗衰老護膚功效的潛力，且具有一定的安全性。

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對來稿內(nèi)容的要求

（一）政治上必須符合黨和政府的各項方針政策；

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