蕎麥種間雜交群體基因定位解析

關鍵詞：蕎麥（FagopyrumesculentumMoench.）;種間雜交群體;基因組測序;基因定位中圖分類號：S334 文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2025）05-0167-06DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.05.026

Genetic mapping analysis of interspecific hybrid population in buckwheat

{INGui-fang1，LUWen-jiel，LONG Wen-jie'，SUNDao-wang1，HUANGChun-yan2，ZHAIBing-xin2，WANGLi-ua’ （1.BiotechnologndGeneticGemplasmResourcesResearchIsituteYunanProvincialKeyLaboratoryofgiculturaloteologKey LaboratoryofSouthwesteCropGeneResouresandGermplasmInnovation，MinistryofAgricultureandRuralAfairs，YunnanAcademyof AgriculturalSciences，Kunming 650205，China;2.Instituteof Resource Plants，Yunnan University，Kunming6505oo，China）

Abstract ： An F₂ population was constructed by crossng the cultivated buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench.）variety Yunqiao 1 （YQ1）withthelodging-resistantanddisease-resistantwildbuckwheatYZ56，extremephenotypicindividualsfortraitsincludingplantheight，rainweightperplant，ndleafblightresistancewerescreenedbasedonagronomictraitinvestigationdataadDA wasextractedfrombuckwheatleavesusing theCTABmethodtoconstruct extremephenotypicDNApools.Theresultsdemonstrated that plant height and grain weight per plant in the F₂ population showed normal distributions，with individuals exhibiting lowerleaf blightincidenceoccupyingahigherproportioninthedistribution.Theaverage grainweightperplantoftheF2populationwas7.8g， higherthnthatof heparentalinesYZ56（13.1g）andYQ1（16.7g），indicatingsignificantheterosis.Rationalutilizationofdistant germplasmesourcesforhybridizationcouldimproveprogenyyield.Pearsoncorelationaalysisrevealedhighlysignificantcoelations amongplantheight，grainweightperplant，andleafblightincidencerate.Poledsequencingcombinedwithbulkedsegregantanalysis （BSA）successfully identified 1O QTL regions associated with plant height at a 95% confidence interval，7 candidate QTL regions related to grain weight per plant，and 6 candidate QTL regions linked to leaf blight resistance.

Key words：buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench.）；interspecific hybrid population;genome sequencing;genemapping

蕎麥（FagopyrumesculentumMoench.）是蓼科蕎麥屬1年生或多年生草本或半灌木植物，其中苦蕎和甜蕎是2種廣泛栽培的重要亞種[1-3]。蕎麥是集營養、保健、藥用為一體的食藥同源作物，廣泛種植于亞洲、歐洲、美洲的多個國家。中國蕎麥的種質資源豐富，“七五\"和“八五\"期間全國共收集到3338份蕎麥種質資源。中國農業科學院對2795份蕎麥資源的10余個性狀進行鑒定[4.5]。1998—2001年云南省農業科學院收集到10個種（包括2個變種）的野生蕎麥種質資源100余份，明確了云南野生蕎麥的特征特性及地理分布，其中YZ56（地方野生種）具有早熟、矮稈（抗倒伏）抗病等優異特性。

中國有近20個省份種植蕎麥，2019年中國蕎麥播種面積38.8萬 hm² ，產量54.3萬t；2020年中國蕎麥播種面積37萬 hm² ，產量53.3萬t。截至2015年底，中國育成并通過全國審定（鑒定）的蕎麥品種28個，通過各省農作物品種審定委員會審（認）定的蕎麥品種44個[6。其中云蕎1號（國品鑒雜2010012）為云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所選育的品種，具有早熟、高產等優異特性，但易感葉枯病和葉脈病，株高較高，易倒伏[7]

混合分組分析（Bulksegregateanalysis，BSA）是基于表型分離群體的基因定位方法。該方法首先選擇目標表型性狀差異顯著的2個親本進行雜交，構建表型分離群體；隨后對分離群體進行表型鑒定，篩選出極端表型的個體，分別混合構建DNA池并進行建庫測序；通過比較不同表型DNA池之間的基因突變頻率差異，定位目標基因或數量性狀位點（QTL）所在的染色體候選區域，從而實現性狀相關基因的快速定位。BSA可以高效、快速、準確定位目標性狀相關基因位點，顯著降低檢測成本，已被廣泛應用于多物種的基因挖掘與功能研究。

基于蕎麥分離群體的BSA分析，已成功定位到多個與收獲前發芽相關的主效和微效QTL[8]。此外，通過對苦蕎 F₂ 群體的BSA分析，研究者定位到與脫殼難易相關的QTL位點Ftes1，并通過精細定位鑒定出3個候選基因[9]。然而，目前關于蕎麥株高、產量及抗病性等重要農藝性狀的QTL或基因定位研究鮮見報道。

為了挖掘利用野生蕎麥種質資源的優異基因，本研究利用野生蕎麥YZ56和栽培苦蕎品種云蕎1號（YQ1）的雜交F群體，針對株高、單株粒重、葉枯病抗性進行BSA研究，定位相關性狀的基因位點，為后續的基因解析與育種應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料

采用云蕎1號（YQ1）和地方野生種蕎麥YZ56進行雜交。母本云蕎1號為云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所功能食品作物產業技術創業團隊選育的高產品種，其特點為早熟、中稈、大粒，生育期為95d左右。父本YZ56為云南滇西北地區地方野生種，其特點為矮稈、超早熟、種子棱上有刺、不易倒伏，主要分枝集中在植株的下部，平均株高為52.1cm ，生育期為65d左右。

1.2 方法

1.2.1群體構建2020年年初親本分批播種于云南省農業科學院實驗基地，5月底開始做人工去雄雜交，6月底收獲雜交種；7月底將雜交種 F₁ 代播種于安寧基地大棚，10月中旬調查農藝性狀并收獲 F₂ 代種子。

1.2.2表型鑒定2021年5月初， F₂ 代被播種于安寧基地大棚，采用 28cm×30cm 規格的育苗盆，共播種580盆，每盆1苗，播種1個月后取葉片樣品冷凍保存。于8月初（約 80% 的子粒成熟）調查和記載生育期、株高（主莖高）3個最高分枝長、一級分枝數、主莖節數、莖粗、果刺、葉枯病和葉脈病抗性等性狀，用紙袋收取單株全部種子，帶回室內調查果刺、單株粒數、單株粒重、千粒重等性狀。其中葉枯病率 Ψ=Ψ （發病葉片數/單株總葉片數） ×100% 。

1.2.3混池測序基于農藝性狀調查數據篩選出株高、單株粒重及葉枯病抗性等性狀的極端表型個體，采用CTAB法從樣本葉片中提取DNA，構建極端表型DNA混池。按照華大基因的DNA建庫流程，對親本DNA及子代DNA池進行片段化、接頭連接及PCR擴增等步驟，構建測序文庫，并在華大DNBSEQ-T7平臺上進行雙端測序（PE150）。

1.3 數據分析

測序數據下機后，首先用FastQCV0.11.4對測序數據進行質控，去除污染序列及測序接頭序列，獲得干凈測序數據（Cleandata），然后用BWAV0.7.13軟件將所得片段序列與苦蕎參考基因組（http：//mb-kbase.org/Pinku1/）進行比對。對其結果中的重復項使用SAMTOOLS的rmdup命令刪除。用GATKV4軟件的UnifedGenotyper模塊檢測樣本的SNPs和Indel標記。用以下篩選標準對 SNPs/Indel 進行過濾： ① 刪除具有多種基因型的SNP/Indel位點； ② 刪除測序深度低的SNP/Indel位點； ③ 刪除親本間無多態或親本間有多態但2個混池間純合卻多態的SNP/Indel位點。用QTLseqr程序對樣本進行BSA分析。分別計算每個混池的SNP指數及SNP指數差，并與顯著性閾值進行比較獲得關聯標記及染色體區域。

2 結果與分析

2.1 表型性狀統計

由表1可知， F₂ 群體的單株粒重平均值為 17.8g 高于親本YZ56（ 13.1g） 和YQ1（ 16.7g ，表現出雜種優勢。由圖1、圖2可知， F₂ 群體的株高和單株粒重呈正態分布，且葉枯病率較低的個體在分布中占比較高。從Pearson相關分析來看，株高和單株粒重的相關系數 （r） 為0.558（ Plt;0.000 1） ，株高和葉枯病率的相關系數 （r） 為0.235 Plt;0.000 1 ，單株粒重和葉枯病率的相關系數 （r） 為0.201（ P=0.002） ，3個性狀間存在極顯著相關性。分別從 F₂ 群體中篩選出株高極端單株42株、單株粒重極端單株45株、葉枯病抗性極端單株48株進行混池測序分析。

2.2 測序數據質控及基因定位

每個樣品測序數據經過質控過濾后，獲得約5000萬條有效片段，產出約 15.00Gbp 的 Clean bas-es，測序深度（Depth）約為33X，質控Q20大于97.00% ，序列GC含量大于 38.00% ，超 99.00% 的片段能比對到苦蕎參考基因組，覆蓋度（Coverage）大于 95.00% （表2）。利用親本間SNP開展基因定位分析，計算每個混池的SNP指數及SNP指數差（△SNP-index），在 95% 置信區間內成功定位到與株高相關的10個QTL區域、與單株粒重相關的7個候選QTL區域以及與葉枯病抗性相關的6個候選QTL區域（表3，圖3）。

3 討論

蕎麥的株高與抗倒伏能力直接相關，株高越高，植株重心越高，倒伏風險也相應增加。在一定范圍內，莖稈重心較低的甜蕎品種，其莖稈抗折力參數值大，倒伏指數小，抗倒伏能力強[10.1]。對甜蕎的株高和莖粗的遺傳分析發現，株高和莖粗的遺傳由2對主基因主導，同時存在加性-顯性多基因的修飾效應，株高的主基因和多基因遺傳率高達 80% 以上，適合在低世代進行選擇[12]。甜蕎株高和抗折力的遺傳以加性效應為主，受主效基因控制，遺傳力較高，可以在早期世代進行篩選[13]。本研究利用混池測序和BSA分析定位到10個與苦蕎株高相關的QTL位點，其中第2和第4染色體上的QTL顯著性較高，達到 99% 置信區間，可能為主效基因位點，與上述基于表型遺傳分析的結果一致。

已明確病原的蕎麥病害超過10種，大多為真菌性病害，其中黑孢霉葉斑病由木穉黑孢霉引起，鏈格孢葉斑病由互格鏈格孢引起[14]，蕎麥葉枯病由鏈格孢屬病菌感染引起[15]。本研究發現蕎麥株高與葉枯病有極顯著相關性，后續的混池測序分析也在第2染色體同一區間定位到控制株高（ Π_qPH2.4） 和葉枯病抗性（qLB2.3）的基因位點，說明該株高的基因與葉枯病抗性基因連鎖。此外，在第1染色體（qPH1.1，qGW1.1）和第8染色體（qPH8.2，qGW8.4）的相近區間定位到控制株高和單株粒重的基因位點。在后續的研究中，需要在定位到QTL的目標區間開發SNP標記，通過構建分離群體進行標記-性狀關聯分析，驗證QTL的遺傳效應，篩選表型效應值大且在不同環境中穩定表達的QTL位點，對相關基因進行功能解析。

蕎麥的單位面積產量與多個性狀相關。苦蕎的單位面積產量與株高（ 和單株產量（ 0.259）呈顯著相關[16]。而且苦蕎的單位面積產量與果殼厚度有極顯著的相關性[17]。甜蕎的單株粒重與單株粒數、單位面積產量均呈正相關關系[18]

4小結

本研究中蕎麥YQ1和YZ56的雜交后代株高與單株粒重存在極顯著相關性，育種中應平衡株高、產量和抗倒伏性的關系，在維持高產的基礎上，通過適度降低株高和增加莖粗來提高抗倒伏性。 F₂ 群體的單株粒重平均值為 17.8g ，高于親本 YZ56（13.1g） 和YQ1（16.7g） ，表現出明顯的雜種優勢。在實際育種中，適當利用遠緣種質資源進行雜交，整合高質量蕎麥參考基因組[19.20]和本研究定位的QTL區間SNP位點信息，開發KASP標記進行QTL效應驗證，同時開展分子標記輔助選擇育種，篩選兼具高產、抗倒伏和抗病特性的蕎麥新品系。

致謝

華智生物技術有限公司的葉昌榮、黃剛、李為國、陳哲紅等協助完成了試驗方案設計、測序及數據分析工作，在此表示感謝。

參考文獻：

[1]唐宇，邵繼榮，周美亮.中國蕎麥屬植物分類學的修訂[J].植物遺傳資源學報，2019，20（3）：646-653.

[2]范昱，丁夢琦，張凱旋，等.蕎麥種質資源概況[J].植物遺傳資源學報，2019，20（4）：813-828.

[3]范昱，丁夢琦，張凱旋，等.中國野生蕎麥種質資源概況與利用進展[J].植物遺傳資源學報，2020，21（6：1395-1406.

[4］內蒙古農業科學院，中國農業科學院作物品種資源研究所.中國蕎麥品種資源目錄（第一輯）M].北京：中國農業出版社，1986.

[5]中國農業科學院作物品種資源研究所.中國蕎麥品種資源目錄（第二輯）[M].北京：中國農業出版社，1996.

[6]趙建棟，李秀蓮，陳穩良，等.我國蕎麥育種成就、問題及對策[J].種子，2017，36（4）：67-71.

[7]王莉花，王艷青，盧文潔，等.云蕎1號的選育及高產栽培技術[J].山西農業科學，2012，40（8）：829-832.

[8]TAKESHIMAR，OGISO-TANAKAE，YASUIY，etal.Targetedamplicon sequencing + next-generation sequencing-based bulkedsegregant analysis identified genetic loci associated with preharvestsprouting tolerance in common buckwheat （Fagopyrum esculentum）[J].BMC plant biology，2021，21（1） ：18.

[9]DUAN Y，YIN G，HE R，et al. Identification of candidate genes foreasily-shelled traitsin Tartarybuckwheat based on BSA-Seq andRNA-Seq methods[J].Euphytica，2022，218，91：42.

[10]汪燦，阮仁武，袁曉輝，等.蕎麥莖稈解剖結構和木質素代謝及其與抗倒性的關系[J].作物學報，2014，40（10）：1846-1856.

[11]汪燦，阮仁武，袁曉輝，等.不同蕎麥品種抗倒伏能力與根系及莖稈性狀的關系[J].西南大學學報（自然科學版），2015，37（1）：65-71.

[12]李英雙，胡丹，聶蛟，等.甜蕎株高和莖粗的遺傳分析[J].作物學報，2018，44（8）：1185-1195.

[13]胡丹.甜蕎莖稈重心高度和抗折力的遺傳分析[J].作物雜志，2022（4）：83-89.

[14] SHEN Q，PENG X X，HEF，et al.First report of Nigrospora os-manthi causing leaf spot on tartary buckwheat in China［J].Plantdisease，2021，105：1227.

[15]盧文潔，羅志明，李春花，等.云南省蕎麥葉枯病病原菌鑒定及其生物學特性[J].植物保護學報，2019，46（5）：1065-1072.

[16]李月，石桃雄，黃凱豐，等.苦蕎生態因子及農藝性狀與產量的相關分析[J].西南農業學報，2013，26（1）：35-41.

[17]陳慶富，陳其餃，石桃雄，等.苦蕎厚果殼性狀的遺傳及其與產量因素的相關性研究[J].作物雜志，2015（2）：27-31.

[18]陳穩良，李秀蓮，史興海，等.甜蕎產量性狀綜合評價及AMMI分析[J].核農學報，2023，37（1）：60-68

[19]ZHANG L，LIX，MA B，et al. The tartary buckwheat genome pro-vides insights into rutin biosynthesis and abiotic stress tolerance[J].Molecular plant，2017，10（9）：1224-1237.

[20]HEQ，MAD，LI W，et al.High-qualityFagopyrumesculen-tum genome provides insights into the flavonoid accumulationamong different tissuesand self-incompatibility[J]. Journal of in-tegrative plant biology，2023，6：1423-1441.

（責任編輯雷霄飛）