大豆花葉病毒半夏分離物外殼蛋白多克隆抗體的制備

關(guān)鍵詞：半夏（Pinelliaternata）；大豆花葉病毒；外殼蛋白；原核表達；多克隆抗體

中圖分類號： S432.4⁺1 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）05-0080-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.05.012

Preparation of polyclonal antibody against coat protein of pinellia isolate of soybean mosaic virus

LI Xin-yun， ZHOU Yi，F(xiàn)ANG Shou-guo （Collegeof Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract：Toestablish arapid detection methodforsoybean mosaic virus（SMV），the primary pathogencausing mosaic disease in Pi neliaternata，thecoatproteingeneofSMVwasamplifiedbyreversetranscription-polymerasechainreaction（RT-PCR），anditsro karyoticexpressionvectorwasconstructed.Thepurifiedfusion-expressd proteinwasusedasanantigen toimmuizerabbitsforthe preparation of polyclonal antibodies.The results showed that the prepared antiserum exhibited a titer of 1：102，400 as determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），a Western blot detection limit of 300ng for the antigen，and demonstrated strong specificity.

Key words：Pinellia ternata；soybean mosaic virus；coat protein；prokaryotic expression；polyclonal antibody

半夏（Pinelliaternata）為天南星科植物，以其塊莖入藥，主要有鎮(zhèn)咳止痰、鎮(zhèn)靜安眠等作用，并且其在對抗新型冠狀病毒肺炎中發(fā)揮了一定作用[2]。半夏廣泛分布于中國長江流域以及東北、華北等地區(qū)，以省的荊半夏最為地道，《全國道地藥材生產(chǎn)基地建設(shè)規(guī)劃（2018—2025年）》更是在華中地區(qū)藥材產(chǎn)區(qū)要求大力發(fā)展荊半夏[3]。由于人們用藥的需求量不斷增加以及除草劑等農(nóng)藥對半夏生長環(huán)境的影響，使得半夏需求量的增加與野外資源的減少之間的矛盾愈發(fā)突出[4]。半夏主要采用人工種植的方式，依靠無性繁殖[5，但是半夏感染病毒后其產(chǎn)量會大幅下降，且在無性繁殖過程中病毒會不斷積累[6]。研究發(fā)現(xiàn)感染半夏的病毒主要是大豆花葉病毒和黃瓜花葉病毒]。

大豆花葉病毒（Soybeanmosaicvirus，SMV）是馬鈴薯Y病毒屬成員，其主要寄主為大豆[8]。有研究者首次發(fā)現(xiàn)大豆花葉病毒能自然侵染半夏9]SMV的外殼蛋白（Coatprotein，CP）比較保守，且是該病毒惟一的結(jié)構(gòu)蛋白[10]。為有效降低SMV侵染半夏帶來的危害，急需可以快速、高效檢測病毒的技術(shù)。目前檢測病毒的方法有PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)，Polymerasechainreaction）法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[]。ELISA操作較為簡單，可以快速、高效地對大量樣品進行檢測。通過構(gòu)建原核表達載體制備抗原，這一方式能夠有效提高抗原的濃度和純度，進而使制備的抗體具有更高的效價和更強的特異性。本研究針對SMV外殼蛋白制備多克隆抗體，以期為SMV的血清學(xué)檢測技術(shù)和CP蛋白功能的進一步研究提供一定的基礎(chǔ)

1 材料與方法

1.1材料

半夏植株采自省潛江市半夏種植基地;pET-28a、大腸桿菌BL21和馬鈴薯Y病毒的外殼蛋白（PVY-CP）均為本實驗室保存;Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit）PrimeSTARMaxPremix（ 2× ）、T4DNALigase、BamHI、SalI均購自Takara公司；IPTG（異丙基 -β -D-硫代半乳糖昔）購自Biosharp公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自O(shè)megaBIO-TEK公司;雄性日式大耳兔購自省荊州市動物研究中心；ECL顯色液購自普美生物有限公司；PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）購自Millipore公司;ProteinMarker、HRP標記的羊抗兔購自ABclonal公司。

1.2 方法

1.2.1大豆花葉病毒半夏分離物外殼蛋白原核表達載體pET-28a-CP的構(gòu)建根據(jù)NCBI中SMV外殼蛋白（CP）基因序列設(shè)計特異性引物， -CGGGATCCTCAGGGAAGGAGACAGGC- ?3^′ ： R：5^′ -AC-GCGTCGACTTACTGTGGTGGGCCCATCCCC -3^′ （下劃線為BamHI和 SalI 酶切位點），由深圳華大基因科技有限公司合成。采用Trizol法提取半夏感病葉片中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試驗按照說明書操作（其中將隨機引物替換為R引物），PCR反應(yīng)使用PrimeSTARMaxPremix（ 2× ，并嚴格按照說明書操作。擴增產(chǎn)物用 BamHI/SalI 酶切后，經(jīng)凝膠電泳后切膠回收酶切片段。用T4DNA連接酶將酶切片段克隆人質(zhì)粒 pE-28a（+） 的 BamHI/SalI 酶切位點，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，再挑選陽性克隆進行測序，將序列正確的質(zhì)粒命名為pET-28a-CP。

1.2.2pET-28a-CP的原核表達及可溶性分析將pET-28a-CP菌液按 1：100 比例加入 100mL 含卡那霉素的液態(tài)LB培養(yǎng)基中， 37°200r/min 培養(yǎng)3h 左右，直至 OD_600nm 為0.6＼～0.8，然后加入終濃度為0.2mmol/L 的IPTG，于 25c200r/min 過夜培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達后 6000r/min 離心 5min ，收集菌體。向細菌沉淀中加人 10mL 細胞裂解液，混勻后冰浴，再用超聲細胞破碎儀處理 10min ，取 1mL 破碎樣品于6000r/min 離心 5min 后，收集上清液和沉淀。在上清液和沉淀中分別加入 1×PBS 緩沖液（磷酸緩沖鹽溶液）重懸菌體，之后再加入 5× 蛋白上樣緩沖液，沸水中煮 10min ，于 12 000r/min 離心 5min ，收集樣品。將樣品進行 12% SDS-PAGE電泳后，用考馬斯亮藍染色，以此檢測蛋白表達量并判斷蛋白的可溶性。1.2.3pET-28a-CP融合蛋白的純化將破碎后的菌體沉淀用BindingBuffer（ 8mol/L 尿素、 .100mmol/L Na₂HPO₄?100mmol/LTris 重懸后用 0.22μm 的無菌濾膜過濾，濾液通過Ni-NTA柱純化重組蛋白。對純化的蛋白進行透析復(fù)性后經(jīng)真空冷凍干燥機處理得到粉末狀的蛋白，收集后置于 -80^°C 保存。

1.2.4多克隆抗體制備及效價分析用純化的融合蛋白 （2μg） 作為抗原溶于PBS，與弗氏完全佐劑1：1（體積比）混合，充分乳化后皮下多點注射雄性日式大耳兔，經(jīng)過4次免疫后，采血收集抗血清。采用間接ELISA對抗血清進行效價檢測。

1.2.5多克隆抗體的靈敏度和特異性檢測將 1mg 蛋白粉溶于 1mL PBS，倍比稀釋（體積比），分別取10μL 樣品，以 1：5000 （體積比）的抗血清為一抗，通過Westernblot方法檢測抗血清的靈敏度。分別取 1mg 感病和健康半夏葉片，研磨后加人 1mL 加樣緩沖液，煮沸 15min 后冰浴 5min ，離心后取上清液;分別取 20μg 純化的SMV-和PVY-CP，以1：5000的抗血清為一抗，采用Westernblot方法檢測抗血清的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1SMV半夏分離物CP基因的原核表達載體構(gòu)建及序列分析

提取感病半夏葉片的總RNA，通過RT-PCR擴增SMV-CP基因，擴增產(chǎn)物經(jīng) BamHI/SalI 酶切后，將膠回收的酶切片段克隆入 pET-28a（+） 質(zhì)粒的BamHI/SalI 酶切位點，構(gòu)建SMV-CP的原核表達載體 pET-28a-CP ，并對其進行雙酶切及測序驗證（圖1），顯示載體構(gòu)建成功。序列分析顯示，SMV-CP基因由846個核苷酸組成，推測編碼一個由282個氨基酸組成，分子質(zhì)量約為 31.5kDa 的蛋白。

2.2 SMV-CP的原核表達

pET-28a-CP轉(zhuǎn)入原核表達菌株BL21后，用IPTG誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達的融合蛋白大小為 ，符合預(yù)期（預(yù)測的融合蛋白約為 36kDa （圖2）。

2.3pET-28a-CP融合蛋白的可溶性分析及純化

對融合蛋白進行可溶性分析，發(fā)現(xiàn)融合蛋白主

A.SMV半夏分離物CP基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳檢測;B.pET-28a-CP的BamHI/SalI酶切產(chǎn)物的凝膠電泳檢測； 泳道1-3.陽性克隆;泳道4.pET-28a （+） ;M.蛋白Marker

要以包涵體的形式存在（圖3）。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)蛋白條帶單一（圖3）。之后進行透析、真空冷凍干燥得到蛋白粉，置于 -80^°C 保存。

M.蛋白Marker;1.BL21;2.BL21+IPTG;3.pET-28a;4.pET-28a+IPTG; 5.pET-28a-CP;6.pET-28a-CP+IPTG

M.蛋白Marker；1.上清液；2.沉淀；3.純化蛋白

2.4多克隆抗體的制備與效價分析

將純化的蛋白作為抗原，對日式大耳兔進行免疫，采血后獲取多克隆抗體。隨后，以該多克隆抗體作為一抗，開展ELISA效價檢測。根據(jù)陽性血清與

陰性血清在 OD_450nm 波長下的吸光度比值，當該比值大于或等于2.0時，可判定為陽性結(jié)果。分析結(jié)果（圖4）表明，多克隆抗體的效價為 1：102 400 。

2.5 多克隆抗體靈敏度和特異性檢測

以 1mg/mL 的純化蛋白作為起始濃度，按照1：2進行倍比稀釋，每個樣品分別取 10μL 進行Westernblot檢測。結(jié)果（圖5）顯示，多克隆抗體最低可以檢測到 300ng 的抗原。分別提取健康半夏和感病半夏葉片的總蛋白，采用Westernblot方法檢測。結(jié)果表明，在健康葉片中沒有信號，而在 10μg/mL 感病葉片中仍可檢測到正確條帶且背景干凈（圖6A）。而抗血清不與純化的PVY-CP發(fā)生特異性反應(yīng)（圖6B），說明制備的多克隆抗體具有較好的特異性。

3 討論

半夏具有經(jīng)濟價值和藥用價值[，而半夏被病毒侵染后，其產(chǎn)量與品質(zhì)大幅下降，無法滿足國內(nèi)外對半夏的需求，造成巨大的經(jīng)濟損失[4]。病毒的快速檢測是防控病毒病的關(guān)鍵措施，為建立半夏中大豆花葉病毒的快速檢測方法，通過構(gòu)建大豆花葉病毒半夏分離株的病毒外殼蛋白基因的原核表達載體，轉(zhuǎn)人大腸桿菌BL21后用IPTG誘導(dǎo)表達獲得重組蛋白，用重組蛋白作為抗原制備多克隆抗體進行病毒檢測對后期的防治至關(guān)重要。本研究制備的多克隆抗體效價高達1：102400（圖2），且靈敏度高，特異性強（圖5、圖6），可用于建立ELISA檢測體系，快速、高效地檢測半夏繁殖材料的帶毒情況。本試驗結(jié)果將為半夏繁殖材料中SMV的檢測提供方法和技術(shù)，也為SMV的早期防控提供理論支持。

參考文獻：

[1]朱曉春，夏振江，沈慶紅，等.半夏炮制方法及其現(xiàn)代研究進 展［J].上海中醫(yī)藥雜志，2023，57（7）：81-87.

[2]LUO WK，DINGRQ，GUO XH，et al. Clinical data mining reveals Gancao-Banxia as a potential herbal pair against moderate COVID