耐硒菌株BacilluscereusZJ2的篩選及四種碳源對(duì)其合成納米硒穩(wěn)定性的影響

關(guān)鍵詞：耐硒菌株；蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）；納米硒；還原率；穩(wěn)定性；碳源中圖分類號(hào)：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2025）05-0025-08DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.05.00：

Isolation of selenium-resistant strain Bacillus cereus ZJ2 and the effects of four carbon sources on the stability of selenium nanoparticles synthesized by the strain

HE Jia-li，LIU Meng-qi， ZHONG Wen-yi，HE Yi，WANG Zhang-qian，CHENG Shui-yuan （ScholofModeIdustryforSelenScieneandEngeing，WuhanPolytecicUiversitNtioalRamp;DCenterforSRichAgcral Products Procesing/HubeEngeigandTecnicalResearchCenterforDeepProcessingofGnSelen-RichAgriulturalProduts， Wuhan 430048，China）

Abstract：Toeteutilzcrorganismsfrenvronmentaloremediation，educeseleumpolutionisoil，andrationalyeplit seleniumresources，aselenumtolerantstrain，ZJ2，wassolatedfromselenum-richsoilinYutangba，EnshiCity，HubeiProvice. MolecularbiologicalidentificationconfimeditasBacilluscereus.Tisstrainexhbitedhightoleranceandreductioncapabilitytosodium selenite Na₂SeO₃ ），converting itinto stable biogenic selenium nanoparticles（SeNPs）.Additionally，theeffctsoffourdifferent carbonsourcesonthesodiumselenitereductioneficiencyandthestabilityofsynthesizedSeNPswereinvestigated.Theresultssowed that strain ZJ2 had a 92% reduction capacity to 5mmol/L sodium selenite.The bio-nanoselenium synthesised by this strain was sphericalparticleswithanaverageparticlesizeof（188.422.63）nmandaZetapotentialof（-41.17±1.77）mV.Itwasfoundthatheadditionof rhamnoseand glucose promotedthereductionofsodium selenitebystrain ZJ2，withan increase inthereductionrateof 37.48% （204號(hào) and 39.53% ，respectively.Inaddition，rhamnose hadagood promoting effectonthe synthesisof stable seleniumnanoparticles bythe strain.Basedonacomprehensiveevaluationof thesodiumselenitereductioncapability，characterizationofseleniumnanoparticles （SeNPs）andtheirstabilityitwasdemonstratedthattheditionofhamossignificantlyenhancedtheabiltofBcilusceresZ to efficiently synthesize more stable biogenic SeNPs.

KeyWords：selenium-resistant strain；Baciluscereus；nano-selenium；reductionrate；stability；carbon source

微量元素硒（Se）是一種非金屬元素，是在1817年由瑞典化學(xué)家永斯·雅各布·貝采利烏斯發(fā)現(xiàn)并命名的[。硒在自然界中主要以兩種形式存在，分別為無機(jī)硒和有機(jī)硒。無機(jī)硒主要指硒酸鹽、亞硒酸鹽，是人們最早的補(bǔ)硒方式，可用于提高低硒地區(qū)食物的硒濃度和人們的硒攝入量[2]。但由于無機(jī)硒的安全劑量范圍較窄，可因吸入、食入或皮膚接觸等方式攝入過量，難以滿足實(shí)際補(bǔ)硒需要[3]。有機(jī)硒通常指含有硒元素的氨基酸、蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)，其安全劑量范圍寬，易于吸收，但轉(zhuǎn)化速度慢，所需時(shí)間長。納米硒作為單質(zhì)硒的特殊形態(tài)，生物體對(duì)其吸收能力強(qiáng)、安全性較高且易于生產(chǎn)制備，具有很大的開發(fā)潛力[4。硒與人體健康息息相關(guān)，在維持人體健康方面具有不可忽視的作用，其在人體內(nèi)的生理生化作用主要表現(xiàn)為抗氧化功能、抗癌防癌功能、拮抗有害重金屬解毒作用、提高人體免疫力等。由于人體內(nèi)不能合成硒，當(dāng)人體對(duì)硒的攝入量不足時(shí)，會(huì)使人體健康狀況出現(xiàn)異常5，主要表現(xiàn)為脫發(fā)、指甲脫落、人體免疫力下降、大骨頭病和克山病等[。缺硒和攝入過量的硒都會(huì)影響人體健康，通過食物攝入是科學(xué)補(bǔ)硒的方法[7]。，納米硒因其具有多種生物活性、高生物相容性、低生物毒性、比表面積大等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于制藥工程、種植業(yè)、畜牧業(yè)、環(huán)境治理等多個(gè)領(lǐng)域[8-1]。

環(huán)境中硒資源的開發(fā)通常有蒸發(fā)結(jié)晶、電化學(xué)及利用微生物異化還原等方法，相比于前兩者，通過微生物異化還原開發(fā)富硒資源具有綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。此外，微生物利用無機(jī)硒合成的納米硒可作為動(dòng)物膳食補(bǔ)充劑及化肥（用于缺硒地區(qū)生產(chǎn)富硒農(nóng)產(chǎn)品），是缺硒群體科學(xué)補(bǔ)硒的途徑。

生物合成納米硒通常指利用植物提取物或通過微生物還原亞硒酸鹽、硒酸鹽、亞硒酸和二氧化硒等前體合成納米硒。與物理法和化學(xué)法相比，生物合成納米硒具有低能耗、低成本、綠色可持續(xù)、環(huán)境友好無污染等優(yōu)點(diǎn)[12]。微生物如細(xì)菌、真菌以及藻類等可利用自身體內(nèi)的還原酶在胞內(nèi)或胞外合成納米硒。自然界中的微生物細(xì)菌（如大腸桿菌、陰溝腸桿菌和乳酸菌等）和真菌（如酵母菌）能將硒酸鹽、亞硒酸鹽等無機(jī)硒通過轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)化、組裝等過程合成顆粒尺寸較小、生物相容性高的微生物納米硒[13-16]。微生物合成的納米硒因被蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)等有機(jī)物包裹而具有更高的穩(wěn)定性[17]，并且可顯著提升抗氧化、抗菌、消炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種重要生物活性[18-22]。雖然已有多種微生物可以有效還原納米硒，但其還原率、還原速率和貯藏穩(wěn)定性等效果不同。碳源可能是影響微生物生長的重要因素，從而影響微生物次生代謝產(chǎn)物的生成，促進(jìn)或降低其對(duì)亞硒酸鈉的還原，同時(shí)影響納米硒的合成和穩(wěn)定。因此，篩選具有將亞硒酸鈉還原合成納米硒能力的菌株，尋找具有提高還原率及環(huán)境穩(wěn)定性功能的添加劑，可為微生物應(yīng)用于水體和土壤硒污染修復(fù)提供方法學(xué)依據(jù)和理論支持，對(duì)微生物合成納米硒的應(yīng)用具有重要意義。

本研究從湖北省恩施市魚塘壩富硒土壤中篩選到1株具有耐硒能力的蠟樣芽孢桿菌ZJ2，分析了其生物學(xué)特性及亞硒酸鈉還原能力，表征了其合成的納米硒，并研究了碳源物質(zhì)對(duì)該菌株亞硒酸鈉還原過程的影響，為提高微生物的亞硒酸鈉還原效率提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

試劑：亞硒酸鈉（分析純）酵母粉、胰蛋白肺、氯化鈉、瓊脂粉、抗壞血酸、溴化鉀，武漢欣申試化工科技有限公司；引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白陳 10g ，酵母粉 5g ，氯化鈉 10g ，去離子水 ¹₀₀₀mL，pH7 。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白膚 10g ，酵母粉 5g ，氯化鈉 10g ，去離子水1000mL ，瓊脂 20g，pH 7 。

儀器：UV1802G型紫外-可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；AG223331型PCR擴(kuò)增儀，德國Eppendorf公司； Neo15R 型冷凍高速離心機(jī)，德國艾本德公司；CF1524R型高速冷凍型微量離心機(jī)，美國SCJLOGEX公司；ZEN360型馬爾文粒度儀，上海思百吉儀器系統(tǒng)有限公司；JN-MiniPro型低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀，廣州聚能納米生物科技股份有限公司。

1.2 土壤樣品的采集

土壤樣品取自湖北省恩施市魚塘壩（富硒土壤，去除表層雜物和廢石，采集地表以下 5～10cm 的土壤。

1.3 耐硒菌株的分離純化

將 10g 土樣加人 50mL 無菌水中，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為 180r/min 、溫度為 37^°C ，于搖床振蕩培養(yǎng) 30min 再靜置 30min 后取上清液。采用稀釋涂布法將土壤上清液稀釋后取 100μL 均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，第2天將平板上的菌株分離純化，接種于含有 50mmol/L 亞硒酸鈉的LB固體培養(yǎng)基平板上，于37^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 后，選出耐硒能力較好的菌株進(jìn)行多次純化，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4菌株菌落形態(tài)及革蘭氏染色

將純化后的菌株分別接種于LB固體培養(yǎng)基平板和含 5mmol/L 亞硒酸鈉的LB固體培養(yǎng)基平板上，于 37^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 后取出觀察細(xì)菌菌落形態(tài)變化。取少量菌體涂抹于載玻片上，參考革蘭氏染色法進(jìn)行染色并判斷菌株類型。

1.5 菌株分子生物學(xué)鑒定

用通用引物27F（ 5^′ -GGTTACCTTGTTACGAC TT-3^′ 和1492R（ 5^′ -GGTTACCTTGTTACGACTT- ?3^′ ） 對(duì)供試菌株16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件： 95^°C 預(yù)變性 3min ： 94^9C 變性 25s，55‰ 退火 30s ， 72^°C 延伸 1min ，35個(gè)循環(huán)； 72^°C 延伸 5min 。

供試菌株16SrDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序所得的序列提交至NCBI網(wǎng)站，在BLAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap設(shè)置為 1000 次。

1.6 菌株還原亞硒酸鹽的動(dòng)力學(xué)特性

將菌株ZJ2在LB液體培養(yǎng)基中活化，然后接種到含有 5mmol/L 亞硒酸鈉的LB液體培養(yǎng)基中，以不添加亞硒酸鈉作為對(duì)照，于 37°C，180r/min 的搖床中培養(yǎng) 72h 。根據(jù) OD_600nm 判定細(xì)菌的生長情況，并測定培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的濃度。 ① 亞硒酸鈉濃度采用抗壞血酸還原法測定。制作亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線：以亞硒酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)品，將 0.5mL 濃度為 4mol/L 的HCl及 1mL 濃度為 1mol/L 的抗壞血酸加入試管內(nèi)，分別加入 1mL 濃度為 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L 的亞硒酸鈉溶液，振蕩混勻，室溫下靜置 10min ，用紫外-可見分光光度計(jì)測定反應(yīng)液在 500nm 處的吸光度，做3次重復(fù)，以亞硒酸鈉濃度為 x 軸， OD_500nm 為y 軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ② 參照張立秋[23的方法對(duì)亞硒酸鈉的還原率進(jìn)行測定。取 2mL 菌液于 12000r/min 離心 10min ，取 1mL 上清液，并向其中加入 0.5mL 濃度為 4mol/L 的HC1及 1mL 濃度為 1mol/L 的抗壞血酸，充分混勻靜置反應(yīng) 10min ，反應(yīng)液于 500nm 處測定吸光度，計(jì)算亞硒酸鈉還原率。

1.7 菌株合成納米硒的純化及表征

將活化后的菌株ZJ2以 1% 的接種量接種于含5mmol/L 亞硒酸鈉的LB液體培養(yǎng)基中，于 37^°C 、180r/min 的搖床中培養(yǎng) 24h 后， 10000r/min 離心10min 收集沉淀，將沉淀用去離子水洗滌3次后得到納米硒-菌株，將沉淀重懸于超純水中，經(jīng)細(xì)胞破碎儀破碎菌體后除去菌體碎片，采用 0.22μm 濾膜過濾除菌，濾液用正己烷萃取后收集并合并水相，以10000r/min 離心 10min 收集沉淀即制得納米硒。使用ZEN360型馬爾文粒度儀對(duì)ZJ2合成的納米硒顆粒進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和Zeta電位分析。在25^°C 下記錄數(shù)據(jù)，平衡時(shí)間為 30s ，測量納米硒顆粒的平均粒徑和Zeta電位。通過SEM觀察納米硒的表面形態(tài)特征，并制作樣品的EDX譜圖。通過冷凍干燥得到納米硒顆粒粉末，用于納米硒紅外光譜的測定。

1.8 菌株對(duì)亞硒酸鈉還原活性的定位

菌株細(xì)胞內(nèi)組分提取分離參照 Wang 等[24]的方法。將菌株ZJ2在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) ^18h ，并在10140r/min 下離心 10min 。用 0.9% NaCl洗滌2次后，將菌體重懸于緩沖溶液中（30mmol/LTris-HCl，pH8.0，30% 蔗糖），分別提取菌株ZJ2的細(xì)胞周質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、上清液和胞外多糖組分。

取 100μL 細(xì)胞周質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、胞外多糖及上清液樣品分別轉(zhuǎn)移至96孔板中，向每個(gè)孔中加人 88μL McIlvaine緩沖液 10μL 亞硒酸鈉溶液（終濃度為 5.0mmol/L 和 2μL NADH/NADPH（電子供體，終濃度為 2.0mmol/L ，共 200μL 體系。將混合物在 30^qC 下孵育至少 72h 。設(shè)置3個(gè)陰性對(duì)照組，分別為無亞硒酸鈉、無電子供體和無蛋白組。若孔中出現(xiàn)紅色，則表明產(chǎn)生了納米硒。

1.9 不同碳源對(duì)ZJ2合成納米硒的影響

在含 5mmol/L 亞硒酸鈉的LB液體培養(yǎng)基中分別添加終濃度為 5mmol/L 的鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖，另外以不加入任何一種物質(zhì)作為空白對(duì)照，每個(gè)處理和空白均設(shè)置3個(gè)重復(fù)；接種菌株ZJ2后，放置恒溫培養(yǎng)振蕩器中于 條件下培養(yǎng) 12h ，測定菌株ZJ2對(duì)亞硒酸鈉的還原率。

將新鮮制備的納米硒溶液分別在室溫自然光、4^°C 避光、室溫避光、 37^°C 避光等條件下保存 10d 分別測量添加鼠季糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖后菌株ZJ2合成納米硒的粒徑和Zeta電位。設(shè)置還原率與電位絕對(duì)值為正相關(guān)、與粒徑為負(fù)相關(guān)，根據(jù)還原率、粒徑及電位分別占 70%.15% 和 15% 的比例進(jìn)行積分，根據(jù)總評(píng)分篩選出最優(yōu)的碳源添加劑。

1.10 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次測定，以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用GraphPadPrism8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析；通過SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件的Duncan's法進(jìn)行樣本間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZJ2的菌落形態(tài)及革蘭氏染色

革蘭氏染色結(jié)果表明，ZJ2為革蘭氏陽性細(xì)菌，顯微觀察其菌株細(xì)胞形狀為桿狀（圖1a）。在LB固體培養(yǎng)基上生長 24h ，觀察其菌落為不透明的乳白色，表面平滑，邊緣齊整（圖1b）。添加亞硒酸鈉后，菌落表面仍光滑且邊緣齊整，但菌落轉(zhuǎn)為不透明的紅色（圖1c），這可能是因菌株ZJ2對(duì)亞硒酸鈉還原產(chǎn)生的納米硒引起的。

2.2 菌株ZJ2的分子生物學(xué)鑒定

以ZJ2基因組DNA為模板，以細(xì)菌通用16SrD-NA引物（27F，1492R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后出現(xiàn)約 1500bp 的特異性條帶。將PCR產(chǎn)物測序后，將測序所得的序列提交至NCBI網(wǎng)站，在BLAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，該序列與數(shù)據(jù)庫中BacilluscereusW44聚為同一支，同源性自展值為 92% （圖2）。菌株形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示，菌株ZJ2為蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）。

2.3 菌株ZJ2對(duì)亞硒酸鈉的還原能力

菌株ZJ2在 6h 后進(jìn)人對(duì)數(shù)生長期，在含5mmol/L 亞硒酸鈉條件下，菌株ZJ2生長的吸光度與不加亞硒酸鈉的對(duì)照相比無明顯的生長抑制現(xiàn)象（圖3）。ZJ2對(duì)亞硒酸鈉的還原率在 0～42h 內(nèi)持續(xù)上升，在 42h 時(shí)還原率達(dá) 80% ，在 42h 后ZJ2對(duì)亞硒酸鈉的還原率趨于平穩(wěn)，在 60h 時(shí)還原率達(dá)最大，為 92% 。菌株ZJ2對(duì)亞硒酸鈉具有良好的耐受能力和還原能力，在水污染和土壤污染的生物修復(fù)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2.4 納米硒的形貌表征

掃描電鏡結(jié)果（圖4a、圖4b、圖4c）顯示，菌株ZJ2合成納米硒呈形狀規(guī)則、大小均勻的球形；能量色散X射線（EDX）分析結(jié)果（圖4d）顯示，在1.4、

11.4keV 處觀察到有硒的特征峰，顆粒表面Se元素的相對(duì)含量最高達(dá) 80.57% 。

2.5 納米硒的粒徑和電位

菌株ZJ2合成的納米硒呈規(guī)則的球形，動(dòng)態(tài)光散射粒度儀測量結(jié)果顯示其平均粒徑為（ 188.42± 2.63） nm （圖5）。納米硒的大小分布類似于其他細(xì)菌，如彭氏變形桿菌LAB-1（Proteus penneriLAB-1）和乳酸片球菌DSM20284（PediococcusacidilacticiDSM20284）的粒徑分別為 274.9nm 和 239.6nm^[25，26] 。Zeta電勢分析結(jié)果顯示，ZJ2在LB中生物轉(zhuǎn)化的納米硒顆粒Zeta電位為 （-41.17±1.77） 1 mV ，說明納米硒顆粒具有良好的分散穩(wěn)定性，不易發(fā)生團(tuán)聚。

2.6 納米硒紅外分析

FTIR光譜（圖6）顯示，納米硒在 3434cm^-1 處有吸收帶，可歸屬于-OH伸縮振動(dòng)； 2920cm^-1 和2850cm^-1 處的吸收峰為甲基、亞甲基中C-H對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，源于脂質(zhì)；以 1637cm^-1 為中心的峰是由 C=0 伸縮振動(dòng)引起的，源于蛋白質(zhì)類物質(zhì)；1541cm^-1 和 1455cm^-1 處的吸收峰為C-N伸縮振動(dòng)和酰胺II型（-NH-）彎曲振動(dòng)引起的，源于蛋白質(zhì)類物質(zhì)； 1 222cm^-1 和 1057cm^-1 處的峰分別被歸類為C-O-C和C-O的振動(dòng)，表明存在多糖。FTIR分析結(jié)果表明，菌株ZJ2合成的納米硒表面被有機(jī)物包被（碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等）。有研究表明，地衣芽孢桿菌 Bl-001^[24] 與彭氏變形桿菌 LAB-1^[27] 產(chǎn)生的納米硒外表面上的有機(jī)基團(tuán)的組成類似，這些有機(jī)基團(tuán)參與了納米硒的形成和穩(wěn)定過程。

2.7 菌株ZJ2還原亞硒酸鈉部位的探究

將菌株ZJ2的細(xì)胞周質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、上清液和胞外多糖分離，分別在各組分中添加亞硒酸鈉（終濃度為 5mmol/L ），觀察不同處理組的顏色變化，如有紅色出現(xiàn)，則可證明該組分具有將亞硒酸鹽還原成納米硒的能力。結(jié)果（圖7）顯示，菌株ZJ2的細(xì)胞周質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、上清液4個(gè)組分中均有紅色出現(xiàn)，表明菌株ZJ2還原亞硒酸鹽是在多部位協(xié)同作用下進(jìn)行的，且亞硒酸鹽的還原過程不依賴于NADH和NADPH的存在。此外，對(duì)菌株各分離組分進(jìn)行熱處理后，除細(xì)胞質(zhì)外其他組分還原亞硒酸鹽的能力喪失，說明還原亞硒酸鹽生成納米硒的過程中具體起作用的成分可能為對(duì)熱敏感的組分，而細(xì)胞質(zhì)中對(duì)亞硒酸鈉起還原作用的物質(zhì)具有一定的耐熱性。

2.8 不同碳源對(duì)菌株ZJ2亞硒酸鈉還原率的影響

在培養(yǎng)基中添加不同糖類物質(zhì)后菌株ZJ2對(duì)亞硒酸鈉的還原能力見圖8。結(jié)果顯示，葡萄糖和鼠李糖對(duì)菌株ZJ2亞硒酸鈉還原能力的促進(jìn)效果較佳，其中碳源為葡萄糖時(shí)，菌株在 12h 時(shí)亞硒酸鈉的還原率最高，達(dá) 62.78%±4.82% ，比CK提高39.53個(gè)百分點(diǎn)，鼠李糖的亞硒酸鈉還原率比CK提高37.38個(gè)百分點(diǎn)，推測葡萄糖和鼠季糖的加入上調(diào)了亞硒酸鹽還原基因的相對(duì)表達(dá)量，促進(jìn)了亞硒酸鈉還原相關(guān)酶的合成。袁志輝2的研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基中添加葡萄糖和硫酸鉀時(shí)，Stenotrophomonas sp.EGS12對(duì)亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化率與空白對(duì)照相比變化不大。不同種類的糖添加劑對(duì)BacillusparalicheniformisSR14生長的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示，葡萄糖加人促進(jìn)了菌株SR14的生長，并通過上調(diào)硫氧還蛋白氧化還原酶、富馬酸還原酶和谷胱甘肽過氧化物酶的表達(dá)提高了其對(duì)亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化率[28]

2.9 不同碳源對(duì)菌株ZJ2合成納米硒環(huán)境穩(wěn)定性的影響

如圖9所示，添加葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖及對(duì)照制備得到的納米硒的粒徑分別為（ 210.90± 1.37） nm.（287.37±7.98）nm.（282.23±4.44）nm.（265.64±6.08）nm. 3.21） nm 和 （243.30±4.16）nm. ，葡萄糖的添加能顯著減小菌株ZJ2生物合成納米硒的粒徑，而其他3種碳源的添加使得菌株合成的納米硒粒徑均增大。納米硒Zeta電位結(jié)果顯示，甘露糖、阿拉伯糖和鼠李糖的添加使納米硒Zeta電位的絕對(duì)值與對(duì)照相比顯著增加，對(duì)納來硒的穩(wěn)定具有促進(jìn)作用。

在儲(chǔ)存期間，光照和溫度條件對(duì)保持納米硒粒徑穩(wěn)定起重要作用。如圖10所示，光照處理使對(duì)照合成的納米硒粒徑明顯增大，而添加甘露糖、阿拉伯糖和鼠李糖合成的納米硒在光照和避光條件下粒徑幾乎不變。對(duì)照和添加葡萄糖合成納米硒的粒徑隨著溫度的增加而增大，而甘露糖、阿拉伯糖和鼠李糖的添加使得納米硒在不同溫度中可以保持粒徑的穩(wěn)定。Zeta電位結(jié)果顯示，幾種光溫條件下對(duì)照，合成的納米硒在室溫避光條件下電位絕對(duì)值最大，而添加鼠季糖合成的納米硒幾乎不受到光照和溫度變化的影響，其電位始終能夠保持較高的絕對(duì)值。同時(shí)根據(jù)總評(píng)分可得，除 37^°C 避光條件外，添加阿拉伯糖的得分最低， 37^°C 避光條件下，對(duì)照的評(píng)分最低。在不同環(huán)境下儲(chǔ)藏10d后，添加鼠李糖還原得到的納米硒評(píng)分始終較高，說明鼠李糖的添加改善了菌株合成納米硒的穩(wěn)定性。

3 小結(jié)與討論

利用微生物合成納米硒是進(jìn)行硒資源高效綠色轉(zhuǎn)化的熱點(diǎn)，通過微生物還原得到的納米硒因其優(yōu)異的生物利用度和低毒性等性能，引起了人們的廣泛關(guān)注。然而，大部分微生物對(duì)硒酸鹽、亞硒酸鹽等無機(jī)硒的耐受性不強(qiáng)，在含硒的培養(yǎng)基中生長緩慢或無法生長，因此篩選出具有硒耐受能力和高效還原能力的細(xì)菌對(duì)納米硒的高效合成具有重要意義。本研究從湖北省恩施市魚塘壩富硒土壤中分離得到1株耐硒能力較強(qiáng)的菌株，將該菌株接種到含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基中，驗(yàn)證其還原亞硒酸鹽合成納米硒的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究篩選到的耐硒菌株ZJ2接種于含有 5mmol/L 亞硒酸鈉的LB1培養(yǎng)基中后，培養(yǎng)基明顯變紅，在 42h 時(shí)還原率可達(dá) 80% ，

60h 時(shí)即可將亞硒酸鈉基本完全還原，說明菌株ZJ2具有還原亞硒酸鹽并合成納米硒的能力。Wang等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將 SeO₃^2- 的初始濃度設(shè)定為5mmol/L時(shí)，BacillusmirabilisYC801在 12h 內(nèi)僅還原了 2.4% 的 SeO₃^2- 。Wang等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，BacillusparalicheniformisY4在 ^72h 后對(duì) 5mmol/L 亞硒酸鈉的還原率為 73.4% ，且還原過程主要發(fā)生在對(duì)數(shù)生長期。本研究中ZJ2的還原過程與Bacillusparali-cheniformisY4具有相似性，且還原能力更強(qiáng)，具有更高效的納米硒還原能力。

納米硒的性質(zhì)通常由其大小、形狀、組成和結(jié)構(gòu)決定。物理和化學(xué)性質(zhì)可控的納米硒具有很高的實(shí)用性。采用微生物還原得到的納米硒可以通過篩選不同菌種、調(diào)節(jié)發(fā)酵條件和投入添加劑等方式促進(jìn)納米硒的還原。本研究在菌株ZJ2還原亞硒酸鹽的基礎(chǔ)上，通過在培養(yǎng)基中添加葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖4種碳源，驗(yàn)證其在添加這4種碳源條件下的亞硒酸鈉還原率，發(fā)現(xiàn)添加阿拉伯糖和甘露糖抑制了菌株ZJ2對(duì)亞硒酸鈉的還原能力，而添加鼠季糖和葡萄糖有效促進(jìn)了菌株對(duì)亞硒酸鈉的還原，可能是因?yàn)檫@兩種糖類對(duì)菌株亞硒酸鈉合成途徑中的相關(guān)還原酶發(fā)揮了作用。張晨婷[30]的研究發(fā)現(xiàn)，添加葡萄糖顯著上調(diào)了硫氧還蛋白基因trxA和 ^trxB 、亞硒酸鈉轉(zhuǎn)運(yùn)基因 tcyC 和tcyA以及電子傳遞基因fdhF的表達(dá)水平，可以顯著促進(jìn)解淀粉芽孢桿菌納米硒的合成。本研究中，在含亞硒酸鹽的培養(yǎng)基中添加 5mmol/L 葡萄糖或鼠李糖顯著提高了亞硒酸鹽的還原率，可提高35個(gè)百分點(diǎn)以上，說明外源添加葡萄糖和鼠李糖能顯著促進(jìn)蠟樣芽孢桿菌對(duì)納米硒的合成。

納米硒是一種粒徑在 0.1～1000nm 的單質(zhì)硒，納米硒的生物活性與粒徑、表面積與體積之比呈負(fù)相關(guān)。納米硒因具有較高的表面能而容易發(fā)生聚集，導(dǎo)致生物活性降低甚至失去功能。許多合成方式及物理化學(xué)手段可被用來合成穩(wěn)定的納米硒顆粒，以維持其納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和生物活性。Bul-garini等[31]對(duì)5種細(xì)菌合成納米硒封蓋層分子組成的研究結(jié)果顯示，使用十二烷基硫酸鈉（SDS）和Tri-tonX-100作為洗滌劑去除內(nèi)層和外層分子可使納米硒顆粒的尺寸和分散性顯著增加，表明納米硒自身不穩(wěn)定，總碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)可能是維持納米硒穩(wěn)定的關(guān)鍵。本研究對(duì)添加了鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖的菌株ZJ2制備的納米硒進(jìn)行粒徑和Zeta電位測量，并在不同溫度和光照儲(chǔ)存條件下對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明，葡萄糖的添加有助于產(chǎn)生粒徑更小的納米硒，而在條件儲(chǔ)存試驗(yàn)中，添加鼠李糖制備的納米硒在不同的光照和溫度儲(chǔ)存條件下最穩(wěn)定，說明外源添加鼠季糖能顯著提高蠟樣芽孢桿菌合成納米硒的穩(wěn)定性和長期儲(chǔ)存性能。

本研究篩選出1株具有利用亞硒酸鈉合成納米硒能力的菌株BacilluscereusZJ2，對(duì)硒污染環(huán)境治理和納米硒微生物合成具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鼠李糖和葡萄糖的添加能有效提高菌株ZJ2對(duì)亞硒酸鈉的利用率，且鼠李糖的添加能提高納米硒的環(huán)境穩(wěn)定性，為微生物法高效合成納米硒提供了新思路。本研究還對(duì)菌株ZJ2的生長特性、亞硒酸鈉還原特性、納米硒合成機(jī)理進(jìn)行了研究，為更好地使納米硒在微生物體內(nèi)合成提供了理論依據(jù)。研究表明，BacilluscereusZJ2在硒污染環(huán)境修復(fù)及納米硒生物合成領(lǐng)域中具有潛在的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 呂海霞）