煙草青枯病發生與根際細菌群落結構特征關聯分析

引用格式：，等.煙草青枯病發生與根際細菌群落結構特征關聯分析[J].湖南農業科學，2025（5）：54-62

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.005.011

中圖分類號：Q939.96 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）05-0054-09

Abstract：Thissdyimstoinvestigateteasociationbetweentobaccobacterialwiltseverityndrzosphremicrobialcounity structure.Tobacco plants with different disease indexes wereused as materials，and high-throughput sequencing was performed torevealtherhizosphere microbialcommunitystructure.Theresultsshowedthat increase intheseverityof tobacco bacterialwilt mildlyaffectedthebacterialphylaandgenerabutsignificantlyaffectedtheabundanceofvarious groupsofbacteria.Atthe phylum level，thediseaseseverityhadthe mostsignificantefectsonActinobacteriaandFmicutes，decreasingtheirrelativeabundnce by 16.04% and 12.68% ，respectively，while increasing the abundance of Bacteroidetes by 20.41% .At the genus level， the abundance of Burkholderceeatofccilo severityof thediseaseenhanced.Theresultsofalphaandbeta diversityanalysesshowed thattheincidenceoftobacco bacterial wilt increased the number and communitystructure diversity of rhizosphere bacteria.

Keywords：tobacco bacterial wilt; rhizosphere bacterial diversity; community characteristics

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的一種毀滅性土傳細菌病害，給我國煙葉生產造成了極大的經濟損失[1-2]。眾所周知，青枯菌的宿主范圍很廣，可以感染50多個科數的百種植物，包括許多重要經濟作物，如番茄、馬鈴薯和香蕉。這種細菌能夠定殖宿主植物的木質部導管，導致植物枯萎并死亡。這種病害通過受污染的土壤、水、幼苗和植物碎片傳播。有效的控制措施包括使用抗病品種、無毒種子、輪作和銷毀受感染的植物等。細菌通過根部進入植物，傳播到木質部導管，擾亂水和營養物質的流動，導致枯萎和死亡[2-4]。青枯病會降低土壤的肥力和有機質，減少有益微生物的數量，從而對土壤質量產生負面影響，隨著時間的推移，這可能會導致作物產量下降和土壤健康狀況下降。青枯病會對其他土壤微生物產生負面影響。如果病原體在土壤中迅速傳播，損傷植株，可供其他微生物分解的有機物減少，這可能會導致土壤微生物的多樣性和豐度下降，最終影響土壤生態系統的穩定性，并影響養分循環和植物生長[14]。

青枯病發病指數與其他土壤微生物之間的關聯是復雜的，取決于土壤類型、氣候和農業實踐等多種因素[5-7]。宿主根部其他細菌物種的生態位空間可能會因共存于同一環境中，爭奪資源或相互依賴生存的細菌之間的相互作用而變化。人們可利用微生物之間的這種競爭進行生物防控[8-9]。當前，從土壤或植物根際分離的有益細菌為農作物病害的生物防治提供了大部分菌株來源。使用專門的拮抗細菌，如芽孢桿菌，通過產生抗菌代謝物來誘導宿主產生對病原體的系統性抗性是一種常用的方法[10-12]。因此，目前研究的一個熱門領域是尋找對煙草青枯病有抑制作用的細菌群落。研究表明，青枯菌可以與土壤中的其他病原菌共存。例如，一項研究發現，該細菌經常與辣椒根際的丁香假單胞菌和野油菜黃單胞菌等其他植物病原菌共分離[12-14]。然而，目前對于煙草青枯病不同發病程度煙株根際土壤中微生物群落結構和分子特征的變化信息的理解仍然有限。通過研究煙草青枯病發生程度對根際微生物群落結構的影響，可以深入理解不同病害程度下微生物群落的組成、多樣性和功能變化，進而揭示病害發生的微生物學機制，從而為煙草青枯病的防治提供新的策略和方法。通過優化根際微生物群落結構，可以提高煙草植株的抗逆性和適應性，增強其對環境的適應能力和競爭力，保障煙草產業的可持續發展。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

在永州市共取樣12個地點，其中江永縣、新田縣、江華縣和寧遠縣各3個地點。每個地點在有青枯病發生的煙田選擇健康煙株（病指 =0 ）、輕度發病（病指 ⁼¹ ）中度發病株（病指 =5 ）和重度發病株（病指 =9 ）各3株，取根際土壤樣品，即挖出整株煙株，清理掉主體根周圍土壤，采用抖根法收集須狀根 2mm 范圍內的土壤，將土樣混合后編號，用自封袋裝好，保存于便攜式冰盒中， 72h 內帶回實驗室。取樣點土壤類型和耕作制度在當地具有代表性。

以采樣地點縣級名稱拼音的首字母作為樣品編號的前兩個字母，未發病煙株樣品加“_Control”，發病樣品加“RS”，以樣品發病級數（阿拉伯數字）為樣品編號的最后一位，測序時3個點的樣品名稱分別加“_J”“_N”“_X”，具體編號情況見表1。

1.2土壤總DNA提取和16rRNA基因擴增

土壤總DNA的提取參考Han等[15]的方法進行。用土壤DNA提取試劑盒E.Z.N.A Soil DNA Kit（OmegaBio-Tec，Inc.USA，美國Omega生物技術公司）提取土壤樣品總DNA，操作流程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 生物信息分析

Miseq測序后，PE讀數最初根據其重疊關系進行合并，并對其序列質量進行控制和過濾。然后對樣本進行區分，并進行OTU聚類和物種分類分析。該分析包括基于OTU聚類結果的多樣性指數分析?；诜诸愋畔?，在群落結構分析的不同分類水平上再進行測序深度檢測?；谶@些分析，對多樣本組成和系統開發信息進行了一系列深人的統計和可視化分析，如多重分析和差異分化檢驗。

1.4分類、物種組成和方差分析

將OTU分析結果與分類學信息相結合，并利用等級－豐度曲線來評估物種OTU的豐度和均勻性。a 多樣性、 β 多樣性和稀釋曲線分析按照Costa等[16]的方法進行。為了評估環境中微生物的多樣性，按照Lam等[17]的方法，使用物種維恩圖分析和群落組成分析等方法計算了單個樣本中微生物組的豐富度和多樣性。進行物種方差分析，以確定不同組或樣本之間微生物組豐度的差異。

2 結果與分析

2.1 煙草根際土壤細菌群落分析

2.1.1煙草根際細菌群落結構門水平分析

從圖1、圖2分析煙草青枯病不同發病階段根際細菌群落結構發現，相對豐度最高的是變形菌門（Proteobacteria， 33.62%～78.51% ），其次是放線菌門（Actinobacteria， 3.27%～24.59% ）、擬桿菌門（Bacter-oidetes， 1.59%-22.71% ）酸桿菌門（Acidobacteria， 0.15% 13.31% ）厚壁菌門（Firmicutes， 0.29%～42.91%） 0煙草不同發病階段根際細菌種類在門水平相似，但其豐度發生了變化，其中放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度隨著病情加重而逐漸降低，變化較為顯著的新田十字社區樣本（XTRS）中放線菌門的相對豐度由 21.31% 降至5.27% ，厚壁菌門的相對豐度由 13.11% 變為 0.43% 。而擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度隨著煙草青枯病病情的加重而逐漸升高，在XTRS的樣本中其相對豐度由 4.32% 升高至 24.73% 。

2.1.2煙草根際細菌群落結構屬水平分析

根據圖3、圖4可知，屬水平細菌群落結構在不同發病程度的煙草根際差異不大?？傮w來說，相對豐度較高的是不動桿菌屬（Acinetobacter）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）假單胞菌屬（Pseudomonas）新根瘤菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizob-ium-Rhizobium）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、伯克氏菌屬（Burkholderiaceae_unclassified）、節桿菌屬（Pseudarthrobacter）、雷爾氏菌（Ralstonia）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、Sphingomonadaceae_unclassified、Rhizobiaceae_unclassified、乳酸鏈球菌屬（Lactococcus）、腸桿菌屬（Enterobacteriaceae_unclassified）、鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）。但不同屬的細菌隨發病程度不同而呈現豐度升高或降低，其中，Burkholderiaceae、Flavobacterium隨著發病程度加重其豐度升高。Enterobacteriaceae_unclassified、Lactococcus、Bacillus、Pseudomonas、Pseudarthrobacter、Sphingomonadaceae_unclassified、Sphingomonas隨著發病程度的加深而豐度下降。

2.2 煙草根際細菌多樣性差異分析

2.2.1 煙草根際細菌Alpha多樣性分析

樣本的Alpha多樣性指數可以反映煙草根際細菌群落的豐度、多樣性。其中Chao1指數可以作為衡量根際細菌物種豐富度的指標，它的值越高，根際細菌的物種就越豐富。Shannon指數是用來估算樣本中根際細菌多樣性的指標，其值越大，細菌群落多樣性越高。本次測序共得到高質量細菌序列12600468條，聚為5681個不同的細菌操作分類單元（OperationalTaxonomicUnits，OTUs）。經拼接并按 97% 的序列相似性進行劃分，隸屬于7個門，12個綱，41個目，62個科，203個屬和74個種。多樣性指數圖如圖5所示，青枯病發病土壤的Shannon-Wiener、Chao1指數均高于未發病土壤，且隨著發病程度的增加，Shannon指數逐漸增大，Chao指數先增大后減小，其總體呈現升高趨勢，但樣本的豐富度指數和多樣性指數并未達到顯著差異。以上結果說明了煙草青枯病發生嚴重的土壤中根際細菌的數量和群落結構的多樣性更為豐富。

稀釋曲線（RarefactionCurve）常被用來評價測序量是否足以覆蓋所有類群，可以直接反映測序數據量的合理性，間接反映樣品中物種的豐度。從圖6Shannon稀釋曲線可知，當隨機選取煙草根際細菌樣品測序數量為10000個后，該曲線已趨于平緩。稀釋曲線趨于平緩，表明本次試驗測序數據量已逐步趨于合理，較多測序數據僅產生少數新種（OTUs）。說明煙草根際細菌測序數據量能夠滿足煙草根際細菌群落結構后續變化分析的要求。

2.2.2 煙草根際細菌Beta多樣性及差異分析

Beta多樣性（BetaDiversity）是對不同樣本的煙草根際細菌群落構成進行比較分析，即分析樣本間的微生物群落多樣性，可以從中發現采得不同發病程度樣本中根際細菌群落的散落狀況，間接表達不同發病期煙草根際細菌的真實情況。Venn圖（圖7）和upset圖（圖8）分析結果顯示，不同組之間共有183個共同的OTU。對樣品組間的多樣性指數差異分析和β多樣性分析統計結果表明，不同的樣品組之間，以及不同的發病程度煙株之間的差異呈現出顯著或極顯著的關系，說明青枯病會極大的影響煙草根際土壤細菌的多樣性。

3 結論與討論

煙草青枯病發病程度的增加，在門水平和屬水平上對細菌群落種類的影響較小，但對各種類細菌的豐度影響較大。門水平上影響最為顯著的是放線菌門，相對豐度由 21.31% 降至 5.27% ；厚壁菌門，相對豐度由 13.11% 變為 0.43% ；擬桿菌門，豐度由4.32% 升高至 24.73% 。屬水平上，Burkholderiaceae_unclassified、Flavobacterium隨著發病程度加重其豐度升高。Enterobacteriaceae_unclassified、Lactococcus、Bacillus、Pseudomonas、Pseudarthrobacter、Sphingo-monadaceae_unclassified、Sphingomonas隨著發病程度的加深而豐度下降。與青枯病發生直接相關的Ralstonia屬則隨著發病程度的增加快速上升，發病煙草植株中Ralstonia的相對豐度占總細菌群落組成的 2.18%～58.97% ，遠高于健康煙草植株的 0.36%～ 6.07% 。Alpha及Beta多樣性分析結果顯示，煙草青枯病的發病提高了根際細菌的數量和群落結構的多樣性。這些變化揭示了煙草青枯病發病程度與根際細菌群落結構的變化關聯特征，煙草發生青枯病會導致根際細菌群落結構的失衡，即放線菌門和厚壁菌門豐度的降低，擬桿菌門豐度的升高。在屬層級上，黃桿菌屬細菌豐度會隨著青枯病發生程度增加而升高，芽孢桿菌屬、假單胞菌屬等對青枯病有抑制作用的細菌則豐度下降，這一現象與前人研究結果是一致的[18]。黃桿菌屬細菌作為易感煙草青枯病煙田土壤的標志性細菌之一[19]，發病煙株通過招募更多的此類拮抗菌來抵抗青枯病菌[20]。據此推測，青枯病菌可以通過動態調整相關功能菌群的豐度而使自身發展處于有利地位，發病煙株則通過特定的招募機制來抵抗青枯病的發生和發展，但具體機制還有待于進一步研究。

煙草青枯病的發生不僅影響煙草的健康生長，還會改變土壤微生物群落結構與功能，加劇病害的發展。對煙草青枯病發病過程中土壤微生物群落變化的研究，不僅有助于更好地理解病害的發病機制，也為開發新的病害防治策略提供了重要的試驗依據。易感青枯病和健康土壤的細菌物種豐富度無顯著差異，黃桿菌屬（Flavobacterium）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizoum）、羅丹桿菌屬（Rhodanobacter）是易感煙草青枯病煙田土壤的標志性細菌，unidentifiedBurkholderiaceae是健康煙田土壤的標志性細菌[19]。在本研究中，unidentifiedBurkholderiaceae豐度隨著發病程度的增加而上升，黃桿菌屬（Flavobacterium）在各樣本中為高豐度菌屬，這些結果與前人研究結論吻合。張玉芹等[2]的研究發現，青枯病發病初期根際土壤微生物多樣性顯著降低，但是隨著病害的發展，后續根際土壤微生物多樣性又有恢復趨勢。本研究也發現了類似的現象，煙草青枯病的發病提高了根際細菌的數量和群落結構的多樣性，說明青枯病的發生程度與根際細菌的多樣性存在關聯。對煙草青枯病病株根際土壤可培養細菌多樣性特征分析結果表明，與健康煙株相比，在門分類水平上，患病煙株根際Proteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度提高，Firmicutes和Actinobacteria的相對豐度降低[22]。本研究結果也發現，煙草不同發病階段根際細菌種類在門水平相似，但其豐度發生了變化，其中放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度隨著病情加重而逐漸降低，而擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度隨著煙草青枯病病情的加重而逐漸升高。這些結果表明，煙草青枯病的發生發展可能與煙株根際細菌種群豐度變化有關，有差異的細菌種群可用于煙草青枯病的生物防控。

高通量測序是當前研究微生物群落結構的主流方法，發生了青枯病的番茄[23-25]、煙草[9，26-27]等作物根系及土壤微生物群落結構均采用了高通量測序技術進行研究。但青枯病菌侵染煙株是一個動態變化過程，但大多數研究只比較了最終健康和發病土壤樣品的差異特性，并沒有關注發病過程中的微生物群落變化[18]。闡釋青枯病發病程度與根際微生物組成的關聯特征，可為有益生防微生物的篩選和微生物制劑、肥料的合理利用提供參考[27-29]。本研究通過高通量測序分析了煙草根際細菌隨發病程度而變化的情況，獲得的種類數均高于培養法所得到的結果[22]，說明采用擴增子高通量測序能夠更全面準確地反映微生物群落結構的動態變化情況，為后續研究提供更準確的數據參考。本研究只對青枯病煙株根際細菌種群多樣性及組成動態變化情況進行了初步比較分析，后續可利用高通量測序對真菌群落變化情況進行研究，以更全面地揭示煙草青枯病害發生發展與微生物群落特征之間的關系。

參考文獻：

[1]JIANG GF，WEI Z，XU J，et al. Bacterial wilt in China ：history，current status，and future perspectives[J].Frontiers inPlant Science，2017，8：1549.

[2]CHANGXH，WANGY，SUNJG，et al.Mitigation oftobacco bacteria wilt with microbial degradation of phenolicallelochemicals[J].Scientific Reports，2022，12：20716.

[3]HUY，LIYY，YANGXQ，etal.Effects of integrated biocontrolon bacterial wilt and rhizosphere bacterial communityof tobacco[J].Scientific Reports，2021， 11：2653 ：

[4]SEO S，GOMI K，KAKU H，etal.Identification of naturalditerpenes that inhibit bacterial wilt disease in tobacco，tomato andArabidopsis[J].Plantamp;Cell Physiology，2012，53（8）：1432-1444.

[5]LIGC，JINL P，WANGXW，et al.Gene transcription analysisduring interaction between potato and Ralstonia solanacearum[J].Russian Jourmal of Plant Physiology，2010，57（5）：685-695.

[6] LIYY，FENGJ，LIUHL，et al.Genetic diversity andpathogenicity of Ralstonia solanacearum causing tobacco bacterialwilt in China[J].Plant Disease，2016，100（7）：1288-1296.

[7]LIYY，WANGL，SUNGW，et al.Digital gene expressionanalysis of the response to Ralstonia solanacearum between resistantand susceptible tobacco varieties[J].ScientificReports，2021，11：3887.

[8]HORITAM，TSUCHIYAK，SUGAY，et al. Current classficationofRalstonia solanacearum and genetic diversity of the strains inJapan[J].Journal of General Plant Pathology，2014，80（6）：455-465.

[9]WANG ZB，ZHANGY Z，BOGD，etal.Ralstoniasolanacearum infection disturbed the microbiome structurethroughout the whole tobacco crop niche as well as thenitrogen metabolism in soil[J].Frontiers in Bioengineering andBiotechnology，2022， 10：1043 ：

[10] BUDDENHAGEN I， KELMAN A. Biological and physiologicalaspects of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum[J].Annual ReviewofPhytopathology，1964，2（1）：203-230.

[11]LIM，POMMIERT，YINY，etal.IndirectreductionofRalstoniasolanacearum via pathogen helper inhibition[J]. The ISME Journal，2021，16（3）：868-875.

[12]WEN T，ZHAO M，LIUT，et al.High abundance of Ralstoniasolanacearum changed tomato rhizosphere microbiome andmetabolome[J].BMC Plant Biology，2020，20（1）：1-11.

[13]BERENDSENRL，PIETERSECMJ，BakkerPAHM.ThermZospnere Imicrobiome and pIant neain. Irenas in Piant Science，2012，17（8）：478-486.

[14]BERENDSENRL，VISMANSG，YUK，etal.Disease-inducedassemblageofaplant-beneficial bacterial consortium[J].The ISMEJourmal，2018，12（6）：1496-1507.

[15]HANGM，LANJY，CHENQQ，etal.Responseof soilmicrobial community toapplicationof biocharincotton soilswithdifferent continuous cropping years[J]. Scientific Reports，2017，7：10184.

[16] COSTA S S，GUIMARAES L C，SILVAA，et al. First steps in theanalysis of prokaryotic pan-genomes[J]. Bioinformatics and BiologyInsights，2020，14：1177-9322.

[17]LAMF，LALANSINGHCM，BABARANHE，etal.VennDiagramWeb：a webapplication forthegenerationof highlycustomizable Vennand Euler diagrams[J].BMC Bioinformatics，2016，17（1）：401.

[18] 李俊領，馬曉寒，張豫丹，等.土壤微生物與煙草青枯病發生關系的研究進展[J].生物技術通報，2020，36（9）：88-99.

[19]李想，殷全玉.健康和易感青枯病煙田土壤細菌群落結構特征及其標志菌[J].中國煙草科學，2024，45（3）：68-76.

[20]LIANGJC，WEI CJ，SONGXR，et al.Bacterial wilt affects thestructure and assembly of microbial communities along the soil-rootcontinuum[J].EnvironmentalMicrobiome，2024，19（1）：6.

[21]張玉芹，曾文，耿麗，等.煙草青枯病根際土壤細菌群落動態變化分析[J].中國土壤與肥料，2024，（7）：60-68.

[22]申云鑫，沈廣材，包玲鳳，等.煙草青枯病病株根際土壤可培養細菌多樣性特征分析[J].西南農業學報，2022，35（4）：871-878.

[23]劉洪，董元華，申民，等.番茄青枯病抑病土壤根際微生物群落特征及其抑制性傳遞機制[J].土壤學報，2022，59（4）：1125-1135.

[24] 李婷婷，鄧旭輝，李若塵，等.番茄青枯病發生對土壤真菌群落多樣性的影響[J].生物技術通報，2022，38（10）：195-203.

[25] LEE S M，KONG HG，SONG GC，et al.Disruption ofFirmicutes and Actinobacteria abundance in tomato rhizospherecausestheincidenceofbacterialwilt disease[J].The ISME Journal，2021，15（1）：330-347.

[26]向立剛，郭華，周浩，等.健康與感染青枯病煙株根際土壤與莖稈真菌群落結構與多樣性[J].植物保護，2020，46（1）：189-196，228.

[27] 朱永官，沈仁芳，賀紀正，等.中國土壤微生物組：進展與展望[J].中國農業文摘-農業工程，2018，30（3）：6-12，38.

[28] 張蕾，徐慧敏，朱寶利.根際微生物與植物再植病的發生發展關系[J].微生物學報，2016，56（8）：1234-1241.

[29]王衛雄，沈博，賈洪柏，等.根際生防菌群的應用及其防病增效的潛在機制[J].生物技術通報，2020，36（9）：31-41.

（責任編輯：高國賦）