葫蘆素B對‘亞腰’葫蘆幼苗生長和生理生化特性的影響

Effects of Cucurbitacin B on Growth and Physio-biochemical Traits of ‘ Yayao’ Lagenaria siceraria Seedlings

Jiang Yiyue，Zhang Xiaodi，Mu Hongmei，Qi Meng （College of Agriculture and Biology， Liaocheng University， Liaocheng 252OoO， China）

AbstractIn this experiment，‘ Yayao’ Lagenaria siceraria was used as test material，and six concentrations of cucurbitacin B were set for hydroponics，which were 0.00mg/mL （CK，water）， 1.20mg/mL （B1）， 3.60mg/mL （B2）， 6.00mg/mL （B3）， 8.40mg/mL （B4）and 10.80mg/mL （B5）.Their effects on seed germination and seedling growth physiology of $L _ { ☉ }$ ， siceraria were studied. The results showed that the content of cucurbitacin B in rhizosphere soil of 5-year continuous cropping L . siceraria was 33 times that in the unplanted soil.Different concentrations of cucurbitacin B had diferent effects on seed germination，seedling growth and root development. Low concentration of cucurbitacin B promoted the growth of seedlings，and the strongest promotion effect occurred when the cucurbitacin B concentration was 6.00mg/mL . Compared with CK，the plant height increased by 34.36% ，the root volume increased by 69.05% ，and the activities of superoxide dismutase （SOD），catalase （CAT） and peroxidase （POD）were 1.22，1.24 and 1.32 times of that in CK，respectively.

The expression levels of SOD ， CAT and POD genes reached the maximum and increased by 62.60% ， 42.86% （204 and 41.79% ， respectively，compared with CK，and the photosynthetic parameters were significantly improved. When the concentration of cucurbitacin B increased to 10.80mg/mL ，the growth of seedlings was inhibited. Compared with CK，the plant height decreased by 5.97% ，the root volume decreased by 35.71% ，the activities of SOD，CAT and POD decreased by 7.10% ， 3.44% and 3.75% ，respectively， the expression levels of SOD ， CAT and genes were the smallest and decreased by 30.53% ， 11.28% and 16.42% ，respectively， and the photosynthetic parameters were reduced.The results of this study showed that the long years of continuous cropping should be avoided in the production of L . siceraria，which might affect the efficient and highquality development of L. ， siceraria industry. The results could provide technical references for the scientific planting of L . siceraria in Dongchangfu District of Liaocheng.

KeyWordsCucurbitacin B； Lagenaria siceraria ； Growth； Photosynthetic parameters；Antioxidant en-zymes

葫蘆［Lagenaria siceraria（Molina）Standl.]是葫蘆科（Cucurbitaceae）葫蘆屬（Lagenaria）一年生蔓性草本植物，栽培歷史悠久，可用作蔬菜、器具、樂器、工藝品和醫藥等[1-2]。研究表明，葫蘆可用于治療黃疸、糖尿病、潰瘍、腎炎等疾病[3-4]幼嫩葫蘆果實作為蔬菜有獨特風味，其鮮味主要相關物質是游離谷氨酸[5]。由于葫蘆成分中有對脂肪酶起抑制作用的物質，其果實提取物也具有治療肥胖的潛在作用[6]

葫蘆具有豐富的文化內涵，中國古代常用作“神器”，多個民族以葫蘆為圖騰[]。中國葫蘆制作工藝有幾百年歷史，聊城工藝葫蘆歷史悠久，2008年“東昌葫蘆雕刻”入選國家級非物質文化遺產名錄。聊城東昌府區是“葫蘆藝術之鄉”，有葫蘆文化協會、葫蘆文化博物館，葫蘆種植面積達2000余公頃，年產值超過15億元，成為當地經濟的主導產業之一。然而，葫蘆種植過程中易受到連作障礙影響，導致其產量和質量下降，病蟲害嚴重，這是當地葫蘆產業急需解決的問題。研究發現，連作障礙的誘因主要是土壤理化性質改變、土壤微生物群落結構失衡和自毒物質積累的綜合效應[8-11]。有文獻報道，植物自身分泌的化學物質可能是導致連作障礙的原因之一[12]

植物在面對生物和非生物脅迫時，可以釋放次生代謝物質[13-14]，用以調節植物與環境之間的關系，緩解生物和非生物脅迫[15-17]。葫蘆素屬于四環三萜類化合物，是葫蘆科植物特有的天然活性成分，屬于次生代謝產物[18]。葫蘆素的化學式為 C₃₀H₄₂O₇ ，根據其側鏈不同，分為葫蘆素 A＼～T^[19] 。目前關于施用葫蘆素對葫蘆種子萌發和幼苗生長影響方面的研究較少

為此，本試驗以聊城地區種植面積廣的‘亞腰'葫蘆為試材，采用HPLC方法測定葉片和未種植葫蘆土壤、連續種植5年葫蘆根際土壤中的葫蘆素B含量，研究澆灌不同濃度葫蘆素B對葫蘆種子萌發、幼苗生長、生理生化特性和抗氧化酶相關基因表達的影響，以期為當地葫蘆產業高效高品質發展提供技術參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

供試葫蘆品種為‘亞腰’。葫蘆素片（迪沙藥業集團有限公司產品）中每片含葫蘆素 B0.06 mg。

1.2 試驗設計與處理

于2024年3月在人工氣候室中進行試驗。挑選飽滿粒大的葫蘆種子，剝去外殼，置于鋪有發芽紙并用蒸餾水浸潤的培養皿中，每個培養皿擺放30粒種子，恒溫25^°C 、濕度 50% 條件下進行發芽，重復3次。種子發芽后，移至水培盒（規格： 38cm×28cm×14 cm）中，每盒水培12株。待葫蘆幼苗長至兩葉時，將水培盒中的液體更換為葫蘆素B溶液，共處理8d。試驗共設置6個葫蘆素B濃度處理，分別為 0.00mg/mL （CK，清水） .1.20mg/mL （B1）、 （B4） .10.80mg/mL（B5） 。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 根際土和葫蘆葉片中葫蘆素B含量測定

根際土和葫蘆葉片均取自試驗基地，根際土有兩種即種植5年葫蘆的根際土壤和未種植葫蘆土壤。分別稱取根際土和烘干葉片各 1.00g ，分別置于錐形瓶中用純凈水浸泡，再用超聲清洗機處理3次，每次 10min ，得到浸出液。取 1.00mL 浸出液樣品置于具塞三角燒瓶中，加甲醇 25.00mL 配置成供試液。與此同時，配置濃度為 5.00mg/mL 的葫蘆素B標準品母液，再按試驗設計梯度分別稀釋成1.00、2.00、3.00，4.00mg/mL 標準溶液。各供試液和供試標準溶液均在 4^°C 下保存。吸取處理完畢的供試液2.00mL ，過 0.45μm 微孔濾膜一次，然后將濾液過 0.22μm 微孔濾膜，并注入色譜進樣瓶中，使用島津高效液相色譜儀對供試液和標準品進行葫蘆素B含量測定。測定條件——色譜柱：DiamonsilC18柱（ 250×4.6mm，5μm） ；柱溫： 30^°C ;流速：1.0mL/min ;檢測波長范圍： 190～700nm ;進樣量5μL ;流動相：甲醇-水（30：70）。

1.3.2 葫蘆素B對葫蘆種子發芽的影響 葫蘆素B溶液處理后4d和 分別測定發芽勢和發芽率。

1.3.3生長指標測定葫蘆素B溶液處理 8d 時，測量株高并用根系掃描儀（型號：HP ScanjetG4050）測定總根長、根系投影面積、根系平均直徑、根體積、根尖數、最大根長和根系表面積

1.3.4幼苗光合指標測定葫蘆素B溶液處理8d時，于上午9時使用CIRAS-2型光合儀對葫蘆葉片進行胞間二氧化碳濃度、蒸騰速率、氣孔導度及凈光合速率測定。測定不同光照強度下各參數時，光強選擇 400lx 和 1200lx ，光源類型選擇LED，大氣二氧化碳濃度設置為環境濃度。

1.3.5 抗氧化酶活性測定葫蘆素B溶液處理8d時，用Liu等[20]的方法測定葫蘆幼苗的超氧化物歧化酶（SOD）過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性。

1.3.6 抗氧化酶基因表達的測定 葫蘆素B溶液處理8d時，稱取葫蘆幼苗葉片 500.00mg ，置于不含任何酶的 1.5mL 離心管中，離心管中加入兩個研磨球，對試管進行標記并液氮冷凍。隨后，在研磨機預冷后，對管內樣品進行粉碎。利用快速通用植物RNA提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司產品，北京，中國）從葉片中提取RNA，之后使用微型分光光度計檢測RNA濃度。用cDNA合成試劑盒（LabLead有限公司，北京，中國）將RNA 轉錄為cDNA，在 37^°C 下反應 2min ，55^°C 下反應 15min ， 85^°C 下反應 5min 。PCR體系的總體積為 20μL ，其中 SYBR green Ex taq（Vazyme生物科技有限公司，南京，中國） 10μL 、cDNA 2μL 、上、下游引物各 0.2μL 和 μL 。擴增條件為 95^°C30s;95^°C5s，60^°C30s 40個循環： 95^°C10s，60^°C5s，95^°C5s_c 。基因相對表達水平計算使用 2^-ΔΔct 方法。引物序列使用Premier3Plus軟件設計，見表1。

1.4 數據處理與分析

運用MicrosoftExcel、SPSS27.0軟件分別進行數據處理和分析（Tukey-Kramer檢驗），使用Origin2022軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 葫蘆素B含量測定

由表2可見，未種植葫蘆土壤葫蘆素B含量為 0.01mg/g ，連作‘亞腰'葫蘆5年根際土葫蘆素B含量為 0.33mg/g ，連作5年根際土是未種植葫蘆土壤的33倍。‘亞腰'葫蘆葉片中葫蘆素B含量比未種植葫蘆根際土高出 0.06mg/g ，是連作5年根際土的 21.21% 。

2.2 葫蘆素B對葫蘆種子發芽的影響

由表3可以看出，葫蘆素B溶液在低濃度下促進葫蘆種子發芽;濃度達到 6.00mg/mL （B3）時發芽勢是CK的1.06倍，發芽率是CK的1.05倍；達到 10.80mg/mL （B5）時葫蘆種子發芽受到一定抑制，發芽勢和發芽率比CK降低 4.94% 和4.60% 。表明高濃度葫蘆素B溶液處理抑制葫蘆種子發芽。

2.3 葫蘆素B對葫蘆幼苗生長的影響

2.3.1 葫蘆素B對葫蘆幼苗株高和總根長的影響圖1顯示，與CK相比，隨著葫蘆素B濃度升高，葫蘆幼苗株高、總根長呈現先升高后降低趨勢。CK葫蘆幼苗株高為 14.23cm ，總根長為97.74cm 。葫蘆素B濃度為 6.00mg/mL （B3）時，幼苗株高增至 19.12cm ，總根長增到 151.76cm ，分別比CK增加 34.36% 和 55.27% 。葫蘆素B濃度達到 10.80mg/mL （B5）時，則呈現抑制效果，株高降到 13.38cm ，總根長降到 81.65cm ，分別比CK降低 5.97% 和 16.46% 。

2.3.2葫蘆素B對葫蘆幼苗根系生長的影響由圖2可知，與CK相比，隨著葫蘆素B濃度升高，葫蘆幼苗根系投影面積、根系平均直徑、根體積、根尖數、最大根長、根系表面積均呈現先升高后降低趨勢。葫蘆素B濃度為 6.00mg/mL （B3）時，幼苗根系投影面積、根系平均直徑、根體積、根尖數、最大根長、根系表面積依次為 $0 . 7 1 ～ ＼mathrm { c m } ^ { 3 } ＼ 、 2 2 6 . 3 3$ 個 15.24cm?28.81cm² ，分別比CK增加 86.06%、15.66%、69.05%、58.64%、12.00% 和31.79% ;葫蘆素B濃度達到 10.80mg/mL （B5）時，則呈抑制效果，分別比CK降低 24.28% ） 22.89% ！35.71%.20.72%.8.89% 和 24.29% 。不同濃度葫蘆素B處理對根系投影面積、根體積的提升效果均表現為 B3gt;B2gt;B4gt;B1 O

2.4葫蘆素B對葫蘆幼苗光合特性的影響

圖3顯示，與CK相比，隨著葫蘆素B濃度升高， 400，1200lx 光強下葫蘆幼苗凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率、胞間二氧化碳濃度均呈現先升高后降低趨勢。葫蘆素濃度為 6.00mg/mL （B3）時，葫蘆幼苗各光合參數提升效果最好， 400lx 和1200lx 光強下凈光合速率分別為285.52、326.73μmol/（m²?s） ，較CK提升 21.90% 和 23.37% ；氣孔導度分別為 ，較CK提升38.89% 和 46.67% ；蒸騰速率分別為1.58、1.79mmol/（m²?s） ，較CK 提升 22.48% 和 21.77% ;胞間二氧化碳濃度分別為 578.33，570.67μmol/mol ，較CK提升 19.49% 和 13.75% 。葫蘆素B濃度達到10.80mg/mL （B5）時，則呈現抑制效果， 400lx 光強下凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率、胞間二氧化碳濃度較CK分別降低 3.27%.8.33%.18.60% 、4.89%，1 200k 光強下分別降低 3.56%，11.11% ！17.01%.7.57% 。

2.5 葫蘆素B對葫蘆幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖4可知，隨著葫蘆素B濃度升高，葫蘆幼苗SOD、CAT、POD活性均呈現先升高后降低趨勢。葫蘆素B濃度為 6.00mg/mL （B3）時，葫蘆幼苗 SOD、CAT、POD 活性達到最高，分別為

491.44U/g 和 ，是CK的1.22、1.24倍和1.32倍。葫蘆素B濃度達到 10.80mg/mL （B5）時，則呈現抑制效果，葫蘆幼苗SOD、CAT、POD活性分別比CK降低 7.10% ！3.44% .3.75% 。

2.6 葫蘆素B對葫蘆幼苗抗氧化酶相關基因表達的影響

圖5顯示，隨著葫蘆素B濃度升高，葫蘆幼苗SOD、CAT、POD抗氧化酶基因的表達量均呈先升高后降低趨勢，濃度為 8.40mg/mL（Bc 4）之前處理均表現為增加。葫蘆素B濃度為 6.00mg/mL （B3）時，葫蘆幼苗 SOD、CAT、POD 基因的表達量達到最大，分別比CK增加 62.60%.42.86% 和41.79%_oB1?B2?B4 處理SOD基因的表達量與CK相比分別增加 9.92%.41.22% 和 32.82% ， CAT 基因的表達量與CK相比分別增加 6.02% ） 20.30% 和 23.31%，POD 基因的表達量與CK相比分別增加 15.67% ） 35.82% 和 26.87% 。葫蘆素B濃度達到 10.80mg/mL （B5）時， SOD、CAT、POD 基因的表達量與CK相比分別降低 30.53% 、 11.28% 和16.42% 。

3討論與結論

本研究結果表明，‘亞腰‘葫蘆根際土中葫蘆素B含量隨著種植年限的延長而增加，連作5年葫蘆的根際土中葫蘆素B含量是未種植葫蘆土壤的33倍，增高的原因可能是葫蘆植株在土壤中分解所致。高濃度葫蘆素B處理會抑制葫蘆幼苗生長，當葫蘆素B濃度為 10.80mg/mL 時，株高降低 5.97% ，總根長降低 16.46% 。

研究顯示葫蘆素具有抗氧化作用[21]，可以調節植物體內的抗氧化酶系統，包括SOD、CAT、POD等。通過調節這些抗氧化酶的活性，間接影響活性氧（ROS）水平，影響植物體內的氧化還原平衡[22-24]。抗氧化酶是植物細胞中的一類重要酶類，它們幫助植物抵御氧化應激，保護細胞免受ROS 的損害[25-28]。本研究中，隨著葫蘆素B濃度升高，葫蘆幼苗抗氧化酶（SOD、CAT、POD）活性先升高后降低，葫蘆素B濃度達到 10.80mg/mL 時SOD、CAT、POD 活性分別降低 7.10%.3.44% 3.75% 。這表明高濃度葫蘆素可通過多種機制影響抗氧化酶活性，降低自由基的清除程度，促進ROS的產生，降低抗氧化酶基因的表達

本研究表明，葫蘆素B濃度達到 10.80mg/mL 時， 400lx 和 1200lx 光強下的葫蘆幼苗凈光合速率分別降低 3.27%.3.56% 。葫蘆素作為一種三萜類化合物，可能通過多種機制影響植物的光合作用。例如，非生物脅迫會破壞葉綠素的合成或穩定性，從而改變光能的捕獲效率[29-31]。本研究結果表明，高濃度葫蘆素B可通過改變植物光合效率、呼吸速率以及抗氧化防御機制等方式，來抑制其生理過程。因此，葫蘆生產中應避免連作年限過長，影響其產業的高效高品質發展。本研究結果將為葫蘆高質量和高效生產提供技術指導和支持。

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