PELP1在上皮性卵巢癌血管生成中的作用研究

Studyon theRoleofPELP1in AngiogenesisofEpithelial Ovarian Cancer

XIELelel，WUJiangling2，ZHANGWenwen3，HUANGXiyue]，YANGXiao1，WANGJia1 （DepartmentofObstetricsndGyecology，DepartmentofClincalLaboratory，DepartmentofPathology，theUnversityTown Hospital of ChongqingMedical University，Chongqing ，China）

Astract：Ueeesteeoleprouotegeso MethodsNoalovarianepithelialellISE8OndepithelialovarancancercellsOVCAR-3ndHeyereselectedHeyCtrlgroupassetas blankcontroloioldeaie PELP1wasdetedyeal-teuoresceceuanitativePCR（RTCR）ndWestBlot（WB）TerelativeexpressnevelofPwas detectedbyWB.TheconcentrationofVEGFAinthesupernatant（CM）ofOE-Vector-CMgroupandOE-PELP1-CMgroupwasdeterminedby enzyme-linkedimmunosorbents（ELA）efectsofCMontemigraioandubefoationofuanbilcalveinedothelialels （HUVECs）weredetectedbyTranswellandangiogeesisethodsResultseexpresionlevelofELPinepithelialovariancanceels OVCAR-3 and Heywas higher than that in normal ovarian epithelial cells IOSE80（ Plt;0 . 0 5 ） .The expressionlevel of PELP1 in Hey-OE-PELP1 group was higher than that in Hey-Ctrl group and Hey-OE-Vector group .The concentration of VEGFA，the numberof migrated cellsand the number of tube nodes in OE-PELP1-CM group were higher than those in OE-Vector-CM group（ .Conclusion PELP1 promotes angiogenesis in epithelial ovarian cancer.

Keywords：Epithelial ovarian cancer；PELP1；Angiogenesis

上皮性卵巢癌是卵巢癌發(fā)病率最高的病理類型，其生長(zhǎng)、侵襲及遷移等高度依賴于血管形成]。當(dāng)上皮性腫瘤發(fā)生時(shí)，腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等2多種促血管生成因子。這些因子能夠促進(jìn)血管新生，不僅為腫瘤細(xì)胞提供了氧氣及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，還為其發(fā)生與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1（PELP1）是雌激素受體共激活因子，在上皮性卵巢癌等多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，被證實(shí)在血管生成中發(fā)揮重要作用，但對(duì)于上皮性卵巢癌而言其在血管生成方面的調(diào)控作用尚待研究。研究表明，血管生成越活躍，腫瘤惡性程度往往越高，患者生存率越低。本研究將進(jìn)一步探索PELP1在上皮性卵巢癌血管生成方面的調(diào)控作用，尋找新的治療靶點(diǎn)，以提高卵巢癌患者的治療效果和生存率。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑本實(shí)驗(yàn)所采用的正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80、上皮性卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3、Hey均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由貴州醫(yī)科大學(xué)贈(zèng)送。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒及快速封閉液、轉(zhuǎn)膜液來(lái)源于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PELP一抗來(lái)源于美國(guó)Abcam公司，內(nèi)參一抗GAPDH、山羊抗兔二抗來(lái)源于美國(guó)博士德公司。TRIzol、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒來(lái)源于日本Takara公司，引物來(lái)源于上海生工生物工程有限公司。過(guò)表達(dá)PELP1慢病毒及陰性對(duì)照來(lái)源于上海吉?jiǎng)P公司。基質(zhì)膠來(lái)源于美國(guó)康寧公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)選取正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80，以及上皮性卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3、Hey。使用含1 0 . 0 0 % 血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)OVCAR-3、Hey細(xì)胞，使用含 1 0 . 0 0 % 血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)IOSE80細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度融合至 9 5 . 0 0 % 后，使用0 . 2 5 % 胰酶消化液進(jìn)行消化傳代。

1.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染設(shè)置Hey-Ctrl組為空白對(duì)照，Hey-OE-Vector組為陰性對(duì)照，Hey-OE-PELP1組為過(guò)表達(dá)組。將Hey細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度融合至 3 0 . 0 0 % ，將原有培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，并加入慢病毒（OE-PELP1）陰性對(duì)照慢病毒（OE-Vector）及促轉(zhuǎn)染試劑。待細(xì)胞培養(yǎng) 2 4 h 后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 4 8 h 后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。使用完全培養(yǎng)基將嘌呤霉素（ 稀釋至濃度為 ；將細(xì)胞原有培養(yǎng)基更換為上述培養(yǎng)基，培養(yǎng) 后完成穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選，繼續(xù)進(jìn)行傳代、凍存。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qRCR）選取正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80，上皮性卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3、Hey進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞密度融合至 9 0 % 左右，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，并測(cè)定RNA濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA，使用SYBERGreenRT-qPCR檢測(cè)盒檢測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。使用PCR擴(kuò)增儀器按預(yù)變性 $9 5 ＼mathrm { ～ ＼textcircled { ＼cdot } ～ } 3 0 ＼mathrm { ～ s ～ }$ ，變性 ，退火延伸 ，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)的條件進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.4WesternBlot（WB）RIPA裂解液用于裂解細(xì)胞，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒用于測(cè)定蛋白濃度。取相應(yīng)體積LoadingBuff緩沖液于蛋白懸液中， 煮沸 5 m i n 。定上樣量為 3 0 μ g ，取相應(yīng)體積蛋白樣品進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。隨后使用快速封閉液在常溫下封閉PVDF膜 3 0 m i n 。使用一抗孵育PVDF膜 后，TBST洗膜6次，每次 5 m i n 。再使用二抗在常溫下孵育 后，TBST洗膜6次，每次 5 m i n 。使用顯影儀進(jìn)行顯影和采圖。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）取標(biāo)本稀釋液0 . 8 m l 于標(biāo)準(zhǔn)品中，充分溶解后渦旋振蕩混勻（濃度為 ）。稀釋濃度為1000、500、250、125、6 2 . 5 、 3 1 . 2 5 、 1 5 . 6 、 0 （空白孔） ；空白孔加 1 0 0 μ l 稀釋液，其余孔中加入 1 0 0 μ l 上述濃度稀釋液， 避光孵育 9 0 m i n ；清洗5次；空白孔加 1 0 0 μ l 抗體稀釋液，其余孔各加入 1 0 0 μ l 抗體工作液， 避光孵育 ；清洗5次；空白孔加 1 0 0 μ l 酶結(jié)合物稀釋液，其余孔各加入 1 0 0 μ l 酶結(jié)合物工作液， 避光孵育 3 0 m i n ；清洗5次；各孔加入 1 0 0 μ l 顯色底物， 避光孵育 1 5 m i n ；各孔加入 1 0 0 μ l 反應(yīng)終止液，混勻后測(cè)量 值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，按上述步驟測(cè)定OE-Vector-CM組、OE-PELP1-CM組上清液（CM）中VEGFA濃度。

1.2.6Transwell共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)將HUVECs細(xì)胞加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，等量加入小室上室，下室中分別加入Hey-OE-Vector組、Hey-OE-PELP1組細(xì)胞上清液。在 的敷箱中培養(yǎng) 2 4 h ；棄去培養(yǎng)基，向每孔中加入 6 0 0 μ μ % 多聚甲醛后放置 1 5 m i n ，使用PBS洗3次，每次 5 m i n ；再使用0 . 1 0 % 結(jié)晶紫染色 1 0 m i n ；用棉簽去除到達(dá)Tran-swell小室下表面的細(xì)胞；PBS清洗小室3次，于室溫放至風(fēng)干；在熒光顯微鏡下觀察3個(gè)視野中的細(xì)胞并采圖。

1.2.7成管實(shí)驗(yàn)將24孔板置于冰上，取基質(zhì)膠 8 0 μ l 預(yù)涂到24孔板上，均勻涂抹24孔板后在 放置 待其凝固；消化HUVECs細(xì)胞，將細(xì)胞分為2等份后加入 1 5 m l 離心管離心；棄細(xì)胞上清液，于每個(gè)離心管中加入相應(yīng)組的細(xì)胞上清液進(jìn)行重懸，于24孔板各個(gè)孔中加入 1 m l 細(xì)胞懸液；在 的敷箱中孵育 ；在熒光顯微鏡下觀察3個(gè)視野中的細(xì)胞并采圖。

1.3觀察指標(biāo)比較正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80、上 皮性卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3、Hey中PELP1表達(dá)水 平；Hey-Ctrl 組、Hey-OE-Vector組及Hey-OE

PELP1組中PELP1表達(dá)水平；OE-Vector-CM組及OE-PELP1-CM組細(xì)胞上清液中VEGFA濃度；OE-Vector-CM組及OE-PELP1-CM組細(xì)胞上清液共培養(yǎng)下臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量及成管節(jié)點(diǎn)數(shù)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPadPrism9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在比較數(shù)據(jù)時(shí)，采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)及采用單因素方差分析。以 Plt;0 . 0 5 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PELP1相對(duì)表達(dá)水平RT-qPCR結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3、Hey中PELP1表達(dá)水平分別為（ 、 ，均高于正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80細(xì)胞的 ；WB結(jié)果顯示，OVCAR-3、Hey細(xì)胞中PELP1表達(dá)水平分別為中 （ 0 . 9 7 ± 0 . 0 0 ） 、 ，均高于IOSE80細(xì)胞的（ 0 . 3 6±0 . 0 0 ） ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P lt; 0 . 0 5 ） ，見(jiàn)圖1。2.2PELP1過(guò)表達(dá)水平 WB 結(jié)果顯示，Hey-OE-PELP1組PELP1表達(dá)水平為（ ，高于Hey-Ctrl組的 及Hey-OE-Vector組的0 ），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Plt;0 . 0 5 ） ，見(jiàn)圖2。2.3OE-Vetor-CM組、OE-PELP1-CM組細(xì)胞上清液中VEGFA濃度ELISA結(jié)果顯示，OE-PELP1-CM組中VEGFA濃度為（ （ 4 3 5 . 4 6±6 6 6 . 8 3 ） p g / m l ，高于OE-Vector-CM組的 （ 5 1 4 . 0 0±7 7 7 . 8 2 ） p g / m l ，，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Plt;0 . 0 5 ） ，見(jiàn)圖3，證明過(guò)表達(dá)PELP1促進(jìn)VEGFA的分泌。

2.4HUVECs細(xì)胞在條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)下遷移情況共培養(yǎng)結(jié)果顯示，OE-PELP1-CM組遷移細(xì)胞的數(shù)量為（ 個(gè)，高于OE-Vector-CM組遷移細(xì)胞的 個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ （ P lt; 0 . 0 5 ） ，見(jiàn)圖4。

注： （204

2.5HUVECs細(xì)胞在條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)下成管情況 成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OE-PELP1-CM組成管節(jié)點(diǎn)數(shù) 量為（ （ 1 7 8 . 0 0 ± 1 2 7 . 0 0 ） 個(gè)，高于OE-Vector-CM組的 （ 個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ . Plt;0 . 0 5 ） 1， 見(jiàn)圖5。

注： 。

注： 。

3討論

上皮性卵巢癌是惡性程度最高的婦科惡性腫瘤，在其發(fā)生過(guò)程中，多種生物學(xué)過(guò)程，如增殖轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、免疫浸潤(rùn)、鉑類耐藥等均與血管生成密切相關(guān)[8-10。腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌多種促血管生成因子，這些因子能夠刺激周?chē)M織中血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，并最終形成新血管網(wǎng)絡(luò)I]。新生血管為上皮性腫瘤提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使腫瘤快速增殖和轉(zhuǎn)移。PELP1定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核[12]，參與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞骨架和表觀遺傳重塑等過(guò)程[13，14]。同時(shí)有研究表明[15]，PELP1在調(diào)控血管生成方面具有潛力。上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展基于癌細(xì)胞快速增殖伴隨血管生成，因此研究上皮性卵巢癌中血管生成機(jī)制對(duì)于理解該疾病發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

既往研究證實(shí)4，在上皮性卵巢癌組織中PELP1表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，上皮性卵巢癌細(xì)胞中PELP1表達(dá)高于正常卵巢上皮細(xì)胞，證實(shí)其與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。分析認(rèn)為癌變的生物學(xué)基礎(chǔ)是原癌基因激活及抑癌基因失活，原癌基因的作用通常是促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，抑制凋亡[7]。PELP1作為一種原癌基因[18]，在上皮性卵巢癌中異常激活，表明PELP1與細(xì)胞增殖凋亡等密切相關(guān)。同時(shí)本研究證實(shí)過(guò)表達(dá)PELP1后，PELP1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞VEGFA分泌增加，過(guò)表達(dá)PELP1組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后其遷移的細(xì)胞數(shù)量與成管節(jié)點(diǎn)數(shù)量增加，提示高水平PELP1通過(guò)促進(jìn)VEGFA分泌促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管生成。分析認(rèn)為腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖需要激活血管生成以此保證充足的氧氣及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)[19]，PELP1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，必然伴隨著血管生成，VEGFA被證實(shí)是最強(qiáng)的促血管生成因子[0，高水平PELP1促進(jìn)VEGFA分泌，高水平VEGFA進(jìn)一步內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及血管生成，證實(shí)PELP1在血管生成中具有潛力。基于此，本研究驗(yàn)證了PELP1在調(diào)控上皮性卵巢癌血管生成方面發(fā)揮重要作用。由此可見(jiàn)，PELP1可以作為抑制上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的生物分子靶點(diǎn)。

綜上所述，在上皮性卵巢癌中PELP1表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)PELP1后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌VEGFA以此促進(jìn)血管生成。基于此，可以通過(guò)靶向抑制PELP1從而抑制其對(duì)血管生成的調(diào)控，為上皮性卵巢癌靶向治療提供新思路及理論基礎(chǔ)。

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收稿日期：2025-02-10；修回日期：2025-02-26

編輯/肖婷婷