基于生物信息學探索GAS2L3在肝癌中的表達與意義

Abstract：OjectiveTexloetexpressoofSiivrancnditsotetialhanmMeoseexpresioicf GAS2L3innorallivertisueandlivercancertisuewasdetectedbyR-PCR，andverfiedbyCancerGenomeAtlas（TCGA）databaseand integratedgeeexpressoabas（GEO）OCressaateeccacfiagossoflieaceKplae metodUddles liverancer.GEOdatabaseasusedtoverifythesurvivalrelatioship.AcolumngaphasconstructedusingGAS2L3andlinicalvariablesTe corelatonbetweenGAS2L3andimmuneinfiltratonwasanalyzedbyusingESTMATE，CIBERSORandTMERdatabasesResultsAfter bioinfortialsdalioitfdatprsfiicssaal tisuesnditspsasealaltolcaladldingofleaeUort diagnosisoflivercancryG3wasO27AtthmeeurvivalalyissodtatpatientsithgSL3dorrogod singleadultactorCOXalyissotathiglexpredGL3ouldesdepedentomarerfiveraerIdio GO，KEGGandGEicetntsgstedhatightodincearisiodeotellclenly enricdilliedexpsei immuneinflraociisediveedlaiinro withlowsurvivalatendiuneifiatioGLcaneusedsotetaomakendiuothaargetfoeacerois

Keywords：Liver cancer；GAS2L3；Bioinformatics；TCGAdatabase；GEO database

肝癌（livercancer）是全球第六大常見的癌癥和第四大癌癥死亡原因[1。該疾病預后較差，只有 5 % 210 % 的早期患者適合手術治療2。目前，關于該疾病發生、發展的分子機制尚不清楚，且缺乏腫瘤類型或者疾病階段的特異性標志物。生長阻滯特異性2（GAS2）蛋白家族由4個相關蛋白（GAS2、GAS2L1、GAS2L2和GAS2L3）組成，參與間期和生長阻滯細胞中肌動蛋白和微絲管的交聯。相較于其他3種蛋白基因，GAS2L3mRNA在靜息下的細胞中表達極低，當細胞重新進入細胞周期時，表達量上升，并在 期達到高峰3，且GAS2L3與細胞分裂、染色體分離和脫落有關。GAS2L3在多種腫瘤中表達異常。研究發現，在胃癌細胞與高細胞毒性-發射體免疫偶聯孵育后使得GAS2L3下調。另有研究報道，GAS2L3在晚期膠質癌中表達上調，并與臨床結果和免疫細胞浸潤相關。然而，GAS2L3在肝癌中的表達、功能以及與肝癌的病理分期和患者預后報道較少。基于此，本研究通過檢測AGS2L3在肝癌細胞中的表達情況，并利用生物信息學分析其與肝癌患者預后、免疫浸潤的相關性，以期為肝癌的診斷和治療提供新的靶點和策略。

1材料與方法

1.1qRT-PCR檢測細胞中GAS2L3基因的相對表達量

1.1.1細胞與試劑人正常肝細胞LO2和人肝癌細胞株 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胎牛血清、1640培養液和反轉錄試劑盒FastKingcDNADispellingRTSuperMix均購自天根生化科技有限公司，RNA提取試劑TRIzol購自碧云天物技術有限公司。GAS2L3和內參基因 β ？ -actin引物通過Primer3Plus在線網站設計并通過NCBI進行驗證最后由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.1.2細胞培養在 的 5 % 二氧化碳細胞培養箱中，用含有 1 5 % 胎牛血清的1640培養液培養人正常肝細胞LO2以及人肝癌細胞 。

1.1.3qRT-PCR收集上述培養后細胞，用Trizol試劑從細胞中分離總的RNA，稀釋到無酶水中，測量RNA濃度。使用FastKingcDNADispellingRTSu-perMix試劑將總RNA逆轉錄為cDNA，最后用Su-perRealPreMixColor（SYBRGreen）進行實時熒光定量PCR擴增檢測GAS2L3基因的表達量。GAS2L3以 β -actin為內參，PCR擴增條件為： ，共40個循環。以 值表示目的基因的相對表達量。

1.2GAS2L3表達水平和臨床數據收集從TCGA數據庫中（https：//cancergenome.nih.gov/）下載肝癌患者的GAS2L3的轉錄和表達數據以及相關的臨床數據（正常樣本：50例；腫瘤樣本：369例）。同時，從UCSC數據庫中下載GTEX數據庫中包含的正常肝組織的測序數據，并應用與TCGA相同的標準化。此外，GE0數據庫（GSE76427、GSE54236）也用于進一步驗證。

1.3GAS2L3表達水平分析利用TIMER數據庫對不同腫瘤中GAS2L3的表達水平進行分析，同時比較TCGA數據庫中GAS2L3基因在正常組織和肝癌組織中的表達差異，分析50例患者的癌旁組織和肝癌組織中GAS2L3的表達差異；利用GTEX數據庫GSE76427對GAS2L3的表達差異進行驗證。此外，通過人類蛋白表達圖譜數據庫（HPA）中的免疫組織化學抗體（HPA048593）分析正常肝組織和肝癌組織中GAS2L3蛋白表達程度。最后，利用ROC曲線驗證GAS2L3作為診斷標志物的可靠性。

1.4GAS2L3臨床相關性分析利用R語言將患者的TNM分期、病理學分級以及組織學分級與患者GAS2L3的表達數據進行合并，采用Kruskal-Wallis檢驗分析GAS2L3表達水平與患者臨床特征的關系，最后通過\"ggplot2\"和\"heatmap\"包進行數據的可視化。

1.5GAS2L3生存分析根據GAS2L3表達量的中位值將患者分為GAS2L3高表達組和低表達組，采用Kplan-Meier法進行生存分析。同時，將GSE54236以及GEPIA 在線分析（http：//gepia.cancer-pku.cn/）進一步驗證GAS2L3的表達對肝癌患者生存的影響。此外，利用ROC曲線驗證GAS2L3預測1、3、5年患者生存率的價值。

1.6GAS2L3獨立預后分析通過單因素和多因素COX回歸分析年齡、性別、組織學分級、病理分級、TNM分期及GAS2L3表達對肝癌患者預后的影響。利用\"survival\"和\"ggplot2\"包對COX回歸分析結果進行可視化。同時，利用Meta分析對預后進行驗證。1.7列線圖的構建與評價基于多變量分析結果，構建1、3、5年生存概率的個體預測列線圖。使用“RMS\"和\"survival\"包生成具有重要臨床特征和校準圖的列線圖。

1.8GAS2L3富集分析根據GAS2L3的表達量的中位值將患者分為GAS2L3高表達組和低表達組。利用\"limma”包對高低組進行差異分析，同時按照 以及 P lt; 0 . 0 5 條件篩選出差異基因，通過\"ClusterProfilter\"包對上述得到的差異基因進行GO及KEGG富集分析。此外，對GAS2L3基因進行GSEA 富集分析，選擇注釋的基因集（c2.cp.keggv7.4.symbols.gmt）作為參考集。將 P lt; 0 . 0 5 和FDRlt;0.05認為通路顯著富集。

1.9免疫微環境相關性分析以GAS2L3表達水平中位數為界，將患者分為高低兩組，利用R語言中“ESTIMATE\"包評價腫瘤微環境中免疫細胞和基質細胞的占比，通過CIBERSORT算法評估免疫細胞占比，并繪制小提琴圖。同時，運用TIMER數據庫分析GAS2L3表達水平與免疫細胞浸潤的相關性。

2結果

2.1GAS2L3在腫瘤中的表達與正常組織相比，GAS2L3在15種癌癥中呈高表達（ P lt; 0 . 0 5 ，見圖1A；根據非配對數據分析，肝癌組織中GAS2L3表達水平高于正常組織（圖1B）；為了進一步驗證GAS2L3的表達量，本研究聯合GTEX數據庫和GEO數據庫（GSE76427）分析發現，GAS2L3在肝癌中的表達高于正常組織（圖1C和1D）。同時，根據50對肝癌樣本和相鄰正常樣本的配對分析，肝癌組織中GAS2L3表達水平同樣高于癌旁組織（圖1E）。為了進一步驗證分析的準確性，采用qRT-PCR實驗驗證結果，結果顯示與正常的肝細胞LO2相比，肝癌細胞HepG2和Hep3B中GAS2L3表達水平顯著升高（圖1F）。此外，通過ROC曲線分析以驗證GAS2L3在區分肝癌組織和正常組織中的診斷療效，結果顯示ROC曲線下面積（AUC）為0.827，（圖1G）。最后根據HPA數據庫發現，肝癌組織中GAS2L3蛋白表達水平顯著高于正常肝組織（圖1H）。

注：A：GAS2L3在全癌中的表達；B：TCGA中GAS2L3在肝癌及正常組織中的表達；C：TCGA-TGEX中GAS2L3在肝癌及正常組織中的表達；D：GEO中GAS2L3在肝癌及正常組織中的表達；E：GAS2L3在同一患者的肝癌組織和正常組織中的表達；F：qRT-PCR檢測GAS2L3的相對表達量 ）；G：ROC曲線圖；H：GAS2L3蛋白在肝癌及正常組織中的表達。

注：A：GAS2L3在全癌中的表達；B：TCGA中GAS2L3在肝癌及正常組織中的表達；C：TCGA-TGEX中GAS2L3在肝癌及正常組織中的表達；D：GEO中GAS2L3在肝癌及正常組織中的表達；E：GAS2L3在同一患者的肝癌組織和正常組織中的表達；F：qRT-PCR檢測GAS2L3的相對表達量（ ）；G：ROC曲線圖；H：GAS2L3蛋白在肝癌及正常組織中的表達。

2.2GAS2L3與肝癌患者臨床特征的相關性從TC-GA數據庫中下載469例肝癌患者臨床病理信息（包括年齡、性別、臨床分期、組織學分級、TNM分期）和對應的GAS2L3表達數據進行分析，結果顯示GAS2L3的表達水平與組織學分級、臨床分期、T分期顯著相關，與N分期和M分期之間未發現統計學顯著關聯，見圖2A＼～2E。此外，按照GAS2L3表達量的中位值將患者分為高低組，GAS2L3高表達同樣與性別、組織學分級、臨床分期和T分期顯著相關，見圖2F。

2.3高、低GAS2L3表達組中肝癌患者的生存分析Ka-plan-Meier生存分析肝癌患者中GAS2L3表達和總生存期及無進展生存期，結果顯示與GAS2L3低表達患者相比，GAS2L3高表達患者總生存率更低（ ，見圖3A。與GAS2L3低表達患者相比，GAS2L3高表達患者無進展生存率同樣更低（ ，見圖 3 B 。同時，應用GEO數據庫（GSE54236）和GEPIA來驗證存活率，同樣得到GAS2L3高表達患者存活率顯著低于GAS2L3低表達組（ ，見圖3C、3D。最后，利用ROC曲線驗證1、3、5年生存率準確性，1、3、5年R0C曲線下面積分別為0.733、0.675和0.589，見圖3E。

2.4肝癌患者GAS2L3表達與預后的關系單因素COX回歸分析顯示，T分期 分期、臨床分期和GAS2L3表達與總生存期相關；多因素COX回歸分析顯示，只有GAS2L3表達與總生存期相關（ H R = 2.006， Plt;0 . 0 0 1 ），見圖4。

2.5列線圖的構建和驗證為提供預測肝癌患者預后的定量方法，基于COX分析構建了GAS2L3與相關臨床危險因素的列線圖，并隨機挑選一個患者判斷其1、3、5年的生存概率（圖5A）。為了檢驗列線圖的預測能力，通過預測模型的校準曲線對其進行評價，1、3、5年的校準曲線近似 基線（圖5B），表明該模型的實際生存期和預期生存期高度一致。

注：A：預測1年、3年和5年肝癌患者生存概率的列線圖；B：列線圖的校準曲線。

2.6基因的富集分析根據GAS2L3的中位表達值，檢測GAS2L3低表達組和高表達組之間差異表達基因（DEGs），并了解其生物學功能，結果顯示GSEA通路在神經活性配體-受體相互作用和嗅覺傳導高表達富集；在脂肪酸代謝和初級膽汁酸代謝低表達富集，見圖6A。同時，GO和KEGG分析顯示，前3個生物過程（BP）可能與細胞器裂變、核分裂和細胞周期有關；前3個細胞組分（CC）可能與突觸膜、轉運體復合物和跨膜轉運復合物有關；前3個分子功能（MF）可能與單原子離子通道活性、DNA結合轉錄激活子活性和GABA受體活性有關，見圖6B；KEGG主要富集于神經活性配體-受體相互作用、細胞周期和尼古丁成癮等通路，見圖6C。

2.7GAS2L3與腫瘤浸潤細胞相關性為了研究腫瘤微環境與GAS2L3表達水平之間的關系，基于ES-TIMATE算法計算每個肝癌樣本的ESTIMATE評分、基質評分和免疫評分，結果顯示按照GAS2L3表達中位值分為高低表達組，與高表達組相比，低表達組基質評分明顯升高（ Plt;0 . 0 5 ） ，免疫評分和ESTI-MATE評分雖無明顯差異，但其評分仍高于高表達組（圖7A）。接下來，通過CIBERSORT方法分析每個肝癌樣本和22個腫瘤浸潤免疫細胞的相對比例，結果顯示高表達組和低表達組之間免疫細胞浸潤有著顯著差異（圖7B）。根據TIMER方法分析表明，GAS2L3表達水平和M0巨噬細胞、T細胞、B細胞、樹突狀細胞以及 細胞浸潤水平呈正相關，與M2巨噬細胞、NK細胞以及單核細胞浸潤水平負相關（圖7C）。

注：A：代表性途徑中富集基因的GSEA功能分析；B：GAS2L3的GO富集分析；C：GAS2L3的KEGG分析。

注：A：ESTIMATE算法分析GAS2L3高表達組與低表達組的腫瘤微環境（ ）；B：GAS2L3高表達組與低表達組免疫細胞浸潤的比較（ ）；C：Lollipop顯示免疫浸潤與GAS2L3之間的相關性。

3討論

肝癌嚴重威脅人類的健康和生命，其具有發病率高、早期診斷率低、生存率低等特點。因此，鑒別肝癌的診斷和預后標志物至關重要。癌癥的診斷和預后標志物有許多類型，包括基因表達、組織學圖像和微生物以及腫瘤微環境，其中基因表達可能是研究最多的[8。GAS2家族在白血病、膠質瘤、肺腺癌和復發性結直腸癌中的機制已被探討。然而，關于GAS2L3在肝癌中的作用還沒有明確的研究報告。

本研究基于公共數據庫和gRT-PCR技術評估了GAS2L3在肝癌中的表達水平和預后價值，結果發現與正常肝組織相比，肝癌組織中的GAS2L3的表達水平顯著上調；同時利用ROC曲線分析了GAS2L3表達對肝癌的預測能力，發現GAS2L3對腫瘤和正常樣本的預后預測具有一定的準確性。此外，還發現GAS2L3高表達在肝癌患者中的預后較差，且單因素和多因素分析顯示GSA2L3高表達是肝癌患者的獨立危險因素，這些都揭示了GAS2L3表達水平的改變可能改善肝癌患者的預后。臨床病理特征顯示，GAS2L3的高表達與肝癌的臨床分期、分級以及T分期呈正相關。此外，本研究還創建了一個列線圖，直觀地顯示7個臨床病理變量（GAS2L3、年齡、性別、臨床分級、病理分期、T分期、N分期），校準曲線表明列線圖具有良好的預測能力，提示GAS2L3可能作為一個潛在的肝癌診斷標志物和預后指標。

為了進一步明確GAS2L3在肝癌中的生物學機制，本研究通過GO和KEGG富集分析發現，GAS2L3相關基因主要參與GABA受體活性、神經活性配體-受體相互作用、尼古丁成癮等方面，同時其也參與肝癌的細胞增殖的細胞周期過程。有研究表明，GABA受體在多個肝癌細胞系中上調，其可增強肝癌細胞的增殖能力；在癌癥中，神經活性配體-受體相互作用通路會被過度激活，并且與癌癥的免疫抑制相關，并被證實其與肺腺癌的預后和免疫治療反應相關[；尼古丁和煙草成癮可增加癌癥的發生幾率。此外，本研究進行了GASE富集分析，發現GAS2L3高表達組同樣富集在神經活性配體-受體相互作用通路上，但是其具體的信號通路還需實驗進一步驗證。研究表明[12，13]，腫瘤微環境對癌癥的發生、發展有重大的影響。然而，GAS2L3在肝癌腫瘤微環境中的功能尚未見報道。本研究采用3種不同的方法（ESTIMATE評分、CIBERSORT算法和TIMER分析）研究GAS2L3對肝癌中免疫細胞浸潤的影響，其中ESTIMATE評分顯示與GAS2L3高表達組相比較，GAS2L3低表達組的基質評分、免疫評分以及ESTIMATE評分更高，腫瘤純度更低，這表明GAS2L3的表達與腫瘤微環境中的免疫細胞浸潤和基質細胞相關。利用CIBERSORT算法進一步揭示了GAS2L3影響肝癌中22個腫瘤浸潤的淋巴細胞的比例，結果發現不同GAS2L3表達水平患者免疫浸潤比例有統計學差異。最后，通過TIMER方法得出GAS2L3的表達與巨噬細胞M0、樹突狀細胞以及 細胞呈正相關，與NK細胞和單核細胞呈負相關，這與CIBERSORT分析相符合。典型的樹突狀細胞的浸潤可幫助將腫瘤相關抗原呈遞給T細胞[14]。 細胞可以通過多種方式靶向腫瘤細胞或者直接通過細胞溶解機制消除腫瘤細胞，并且可以增加B細胞和細胞毒性T細胞反應的強度和質量[5]。GAS2L3還下調NK細胞浸潤，NK細胞可通過表達可溶性和膜結合的腫瘤壞死因子，進而激活死亡誘導配體，從而殺死腫瘤細胞，并且NK細胞在腫瘤免疫監視中也發揮著重要的作用。據報道7，巨噬細胞對腫瘤的發展具有雙重作用。M1巨噬細胞通過分泌促炎趨化因子參與抗原提呈，而M2巨噬細胞發揮抑制功能[18]。以上均表明GAS2L3可能通過參加細胞免疫和體液免疫在調節肝癌腫瘤微環境中發揮重要作用。然而，要證實GAS2L3與免疫細胞的關系還需更加直接的證據，如流式細胞術。

綜上所述，GAS2L3可能作為肝癌預后的潛在生物標志物和免疫治療靶點。但本研究仍存在一些局限性：本研究是根據公共數據庫獲得的數據進行研究，雖然通過了qRT-PCR技術及GEO、HPA數據庫中數據對GAS2L3的表達、生存、蛋白表達進行了驗證，但還需要進一步實驗來探索GAS2L3在肝癌進展和預后的分子機制。

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收稿日期：2024-03-02；修回日期：2024-03-14編輯/杜帆