巨噬細胞M2標志物CD163和MRC1在急性髓性白血病中的預后分析

DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2025.07.001 文章編號：1006-1959（2025）07-0001-09

Abstract：ObectiTvestigaetfofteexprsiooftmoasoatedmacoM（-TAs）markersCDndote survivalandprognosisofacutemyeloidleukemia（AML）MethodsPan-canceranalysisofCD163andMRC1wasperformedbyTCGAand UALCAN.TAEplerdealeapdl prognosisfCD16andMRClinAMLTheSCHdatabasewasusedtoaalyzeCD163andMRC1atthesinglecellevel.ResultsTheepreion fMRC1wasoeglatedinosortissusndteexpressoofC63inotissssgertantatintsss BysearchingCGAGEUNKaplaeeroedlcabssdhathali withhighexpressonofC16adC1wasshorethanthatoflwexpressongoupichwasaigiskfactorandeieeas statistically significant .InthesinglecelldatasetAML_GSE116256，it was found thatCD163 was mainlyexpressed inmononuclear macropgespdoseldaltdsu TAMswasverifdyellplaleatioduoeseCocusioompadihalttrolstitsa highexpressofCD163andMRC1，andatientswithghM2TAMsinfiltrtionaveaoorprogosisCD63ndMRC1wereprelarily demonstrated as potential prognostic indicators in AML.

Keywords：Acute myeloid leukemia；M2-tumor-associated macrophages；CD163；MRC1

急性髓性白血病（acutemyeloid leukemia，AML）是一種異質性血液系統疾病。盡管對白血病發生機制的了解不斷加深，治療策略也取得了進展，但AML患者預后仍然較差2。近年來，腫瘤免疫治療已經在多種腫瘤治療中顯示出顯著的療效，然而當前大多數腫瘤的免疫治療并未顯示出客觀的抗腫瘤效果，缺乏對這些腫瘤免疫浸潤景觀的了解可能是免疫治療失敗的原因之一[3]。腫瘤微環境（tumormicro-environment，TME）是腫瘤細胞產生和生活的內環境，具有異質性，由多種細胞類型組成4。血液中的單核細胞在各種趨化因子和細胞因子的作用下募集到腫瘤細胞周圍，從而成為腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）。作為 TME的重要組成部分，TAMs影響腫瘤生長、免疫調節、轉移和化療耐藥。為響應微環境的變化，TAMs可以極化為腫瘤相關巨噬細胞M2（M2-tumor-associ-atedmacrophages，M2-TAMs）。M2-TAMs受IL4和

IL13極化，可分泌ARG1、基質金屬蛋白酶、TGF- 、IL-10和其他抑制免疫、血管再生與組織修復的細胞因子。當TAMs發生極化時，M2-TAMs蛋白標志物主要為 CD163 和甘露糖受體（mannose receptor，MRC1）。CD163是I型膜蛋白，其表達限于單核細胞和巨噬細胞系。MRC1是一種 的跨膜蛋白，屬于模式識別受體組，別名CD206，主要在組織巨噬細胞中表達，在先天性和適應性免疫反應中發揮作用8。盡管巨噬細胞可有效殺傷腫瘤細胞，但在惡性腫瘤患者體內，M2-TAMs在腫瘤的生長、轉移及復發等方面均發揮十分重要的作用。然而，惡性腫瘤患者體內TAMs極化為M2-TAMs的詳細機制未完全闡明，不同類型腫瘤可能通過不同方式極化巨噬細胞，因此關于TAMs極化的詳細機制仍有待進一步研究[9-12]。大量研究表明[13-16]，M2-TAMs在腫瘤中的高表達與患者的不良預后有相關性，例如在上皮性卵巢癌、胰腺癌、髓母細胞瘤、乳腺癌中M2-TAMs的增多預示著不良的預后。但AML中的表達及預后作用尚未有明確研究，需進一步探討。基于此，本研究以M2-TAMs蛋白標志物CD163和MRC1為研究對象，通過TCGA、TARGET、GEPIA2、UALCAN、TISCH、Kaplan-MeierPlotter和Oncolnc多個數據庫進行分析，探討CD163和MRC1在AML中表達預后及相關調控機制，以期了解M2-TAMs在AML中的極化作用機制，為研究AML的發生發展機制、分子靶向治療提供思路。

1材料與方法

1.1數據下載 從TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）獲取33種mRNA表達譜數據。使用perl語言讀取人類基因組注釋文件，將Ensemblid轉換為基因名字。并計算MRC1和CD163在33種腫瘤與癌旁組織中表達量。使用R軟件包\"ggpubr\"可視化結果。從TARGET（https：//ocg.cancer.gov/）中獲取AML的轉錄組分析數據和臨床注釋。使用\"limma\"包計算MRC1和CD163差異表達量，通過\"ggplot2\"和\"ggpubr\"包可視化結果。本研究納入的所有Microarray和RNA-seq數據均進行了歸一化和 轉換。

1.2TCGA數據庫中MRC1和CD163泛癌分析使用R語言處理TCGA中33種腫瘤轉錄組數據，分析CD163和MRC1在33種TCGA癌型中腫瘤組織與鄰近正常對照之間的表達差異。通過R軟件包ggpubr\"包可視化結果。

1.3MRC1和CD163差異表達與生存分析GEPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）：用于TCGA和GTEx數據庫中的腫瘤和正常組織之間的大規模表達譜分析和交互分析，對于某些正常樣本較少或沒有正常樣本的癌癥類型，使用GEPIA2的“表達分析\"模塊，在\"匹配TCGA與 G T E x 數據\"的設置下，評估和比較腫瘤組織與其配對的GTEx數據庫正常對照之間表達。CD163和MRC1在AML中差異表達分析：設定ILogFCICutoff -valueCutoff ，Jitter S i z e=0 . 0 4 選擇TCGA聯合GTEx數據庫，共包括173腫瘤樣本和70正常樣本。CD163和MRC1在AML中生存預后分析：依次輸入M2-TAMs標志基因CD163和MRC1蛋白。GroupCutoff設定Cutoff-High （ % ） = 5 0 % ，Cutoff-Low （ % ） = 5 0 % 。設定Hazards Ratio（HR）和 9 5 % Confidence Interval，AxisUnits選擇Months，獲取生存分析結果。UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）：通過檢測CD163和MRC1在LAML原發腫瘤和正常組織中蛋白的表達水平與生存預后相關性，探討CD163和MRC1的表達對AML生存的影響。TARGET數據庫：使用R軟件包\"limma\"包計算AML中MRC1和CD163差異表達量，使用\"survival\"和\"survminer\"包對MRC1和CD163進行生存分析，通過\"ggplot2\"和“ggpubr\"\"可視化結果。通過Kaplan-MeierPlotter數據庫對MRC1和CD163在1608個AML樣本中進行生存預后分析。另利用Oncolnc（http：//www.on-colnc.org/），首先在首頁依次輸入MRC1和CD163，點Submit提交后，選擇LAML，YesPlease提交，將Cutoff值設定 （ 5 0 - 5 0 ） % ，輸出生存結果。

1.4誘導人單核白血病THP-1細胞極化為 M2 - TAMs鋪板 個THP-1細胞，加入 佛波脂（phorbolmyristate acetate，PMA）干預 誘導極化為MO，在PMA持續作用條件下，加入 2 0 n g / m l IL4和IL13繼續誘導 4 8 h 極化為M2-TAMs。

1.5免疫熒光檢測M0和M2蛋白標志物表達將細胞按組別要求誘導成M0或M2后，同時設置不誘導的對照組，去上清。自然晾干細胞樣本，浸入 4 % 的多聚甲醛固定液中 3 0 m i n 或至過夜，改善細胞的滲透性，PBS浸洗 。每張爬片滴加2滴 3 % 甲醇溶液，室溫（ 2 5 % ）封閉 1 0 m i n ，PBS浸洗3次；滴加即用型山羊血清 1 0 0 μ l ，室溫孵育 滴加一抗 1 0 0 μ l（ 1：2 0 0 稀釋）， ，濕盒孵育 2 h 。PBS浸洗3次；滴加相應TRITC（用于CD163和CD68）和FITC（用于MRC1）標記的二抗 （1：100稀釋）， ，避光孵育 ；PBS浸洗3次；每張片子滴加配制DAPI染液 1 0 0 μ l ，室溫避光放置 5 m i n ；用防萃滅封片膠封片；激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察細胞中M0和M2的表達情況。

1.6 統計學方法使用\"ggplot2\"包將數據呈現為箱線圖，并通過Wilcoxon秩和檢驗確定顯著性。卡方檢驗和Fisher精確檢驗用于評估兩個分類變量之間的關聯。通過斯皮爾曼相關分析以確定基因表達水平之間的關聯。對于生存分析，根據中位CD163和MRC1表達水平將AML患者分為高表達組和低表達組。使用\"survminer\"軟件包生成Kaplan-Meier生存曲線，并使用對數秩檢驗在組間進行比較。采用GraphPad_Prism_8.0.2.263_64位版軟件對功能實驗資料進行統計學分析， P lt; 0 . 0 5 為差異有統計學意義。

2結果

2.1MRC1和CD163在TCGA和UALCAN不同癌癥中的泛癌分析膀胱尿路上皮癌（bladderurothelialcarcinoma，BLCA）乳腺浸潤癌（breast invasive car-cinoma，BRCA）宮頸鱗癌和腺癌（cervical squamouscell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）、膽管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）結腸腺癌（colonadenocarcinoma，COAD）、腎嫌色細胞癌（kidneychromophobe，KICH）、腎乳頭狀細胞癌（kid-neyrenalpapillarycellcarcinoma，KIRP）、肝細胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）、肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤（pheochromocytoma and paragan-glioma，PCPG）、前列腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD）、直腸腺癌（rectumadenocarcinoma，READ）和子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）腫瘤組織中MRC1的表達低于正常組織，而在頭頸鱗狀細胞癌（head and neck squamous cellcarcinoma，NHSC）中MRC1的表達高于癌旁組織L （ Plt;0 . 0 5 ） ）。值得注意的是，本研究經過泛癌分析顯示，MRC1在大部分腫瘤組織中表達均下調，見圖1A。在CHOL、COAD、LIHC、肺腺癌（lung adenocar-cinoma，LUAD）LUSC、胰腺癌（pancreaticadenocar-cinoma，PAAD）、PCPG和READ腫瘤組織中CD163表達量低于癌旁組織，而在多形成性膠質細胞瘤（glioblastomamultiforme，GBM）、HNSC、腎透明細胞癌（kidneyrenalclearcell carcinoma，KIRC）KIRP、PRAD、胃癌（stomach adenocarcinoma，STAD）UCEC腫瘤組織CD163表達高于癌旁組織（ Plt;0 . 0 5 ） ，見圖1B。

2 . 2 A M L 中MRC1和CD163差異表達通過GEPIA和TARGET數據庫發現，MRC1和CD163在LAML中表達上調（ Plt;0 . 0 5 ） ，見圖2。

2.3CD163和MRC1在AML不同病理中表達CD163和MRC1表達與年齡、性別、人種、白血病8個亞型（MO-M7）、FLT3突變型白血病、PML/RARfusion和RAS基因突變型白血病顯著相關（ Plt;0 . 0 0 1 。MRC1在亞洲人群中表達比在白種人和非裔美國人中低（圖3A）。在白血病8個亞型中，MRC1表達量高低依次為 M6gt;M7gt;M0gt;M1gt;M4gt;M5gt;M2gt;M3 （圖3B）。FLT3突變型白血病中MRC1表達量高于非突變型（圖3C）。急性早幼粒細胞白血病中MRC1的表達高于非急性早幼粒細胞白血病（圖3D）。在AML不同年齡段，MRC1表達量高低依次為61＼～80歲 gt;8 1～1 0 0 歲gt;41＼～60歲 gt; 2 1～4 0 歲（圖3E）。此外，AML患者中，男性MRC1表達量高于女性（圖3F）。RAS基因突變型白血病MRC1表達低于非突變型（圖3G）。CD163在亞洲人群中表達比在白種人和非裔美國人中高（圖4A）。CD163在 M 0gt;M1gt;M2gt;M3gt;M4gt;M6gt;M7 中低表達，在M5中高表達（圖4B）。FLT3突變型白血病中CD163表達量低于非突變型（圖4C）。急性早幼粒細胞白血病中CD163的表達低于非急性早幼粒細胞白血病（圖4D）。在AML不同年齡段，CD163表達量高低依次為81＼～100歲 gt; 6 1～8 0 歲 gt; 4 1～6 0 歲 gt; 2 1～4 0 歲（圖4E）。AML患者中，男性CD163表達量高于女性（圖4F）。RAS基因突變型白血病MRC1表達低于非突變型（圖4G）。

2.4CD163和MRC1生存分析基于GEPIA（圖5A）、Kaplan-MeierPlotter（圖5B）、TARGET（圖5C）、UALCAN（圖5D）、和Oncoln（圖5E）驗證MRC1和CD163對AML生存的影響，結果顯示高表達組患者生存時間低于低表達組（ P lt; 0 . 0 5 ）。

注：A：GEPIA數據庫；B：TARGET數據庫。

2.5檢測誘導THP-1極化至M2后CD206和CD163表達THP-1經PMA和IL4/IL13誘導極化為M2后，細胞由懸浮式生長變成貼壁生長，由圓形變成不規則形態，體積進一步增大，細胞漿疏松，細胞核增大明顯，可見大量明顯細胞器，胞膜周圍可見少量突起（圖6A）。THP-1誘導極化至巨噬細胞M2后，免疫熒光結果顯示與THP-1相比CD136和MRC1在巨噬細胞M2表達均上調（ Plt;0 . 0 5 ） （圖6B），同時進一步證明誘導巨噬細胞M2極化成功。

3討論

本研究通過對TCGA、TARGET、GEPIA2、UAL-CAN、TISCH、Kaplan-MeierPlotter和Oncolnc數據庫中CD163和MRC1在AML中的差異表達和生存預后進行分析，使用perl和R語言輔助分析CD163和MRC1表達，結果顯示與健康對照組相比，AML患者CD163和MRC1表達均上調；生存分析結果表明，CD163和MRC1是AML患者總生存期的高風險預測因子。此外，本研究分析CD163和MRC1的差異表達與預后價值是在多個數據庫中同步分析驗證的，在評估預測性能時，CD163和MRC1表達被視為連續變量，從而提高了研究的統計效能。研究中還發現，CD163和MRC1對AML患者年齡、性別、人種、白血病8個亞型（M0-M7）FLT3突變、PML/RAR和RAS均有顯著影響，彌補了研究人群的回顧性和異質性的局限性問題，能夠更精準評估CD163和MRC1表達作為AML患者臨床結果的穩健預測因子，進一步表明M2-TAMs對AML患者的不良預后影響，與既往已發表的其他癌癥類型數據基本一致[10.1217]，提示M2-TAMs在AML中具有促進腫瘤生長的潛力。

本研究雖然初步表明了CD163和MRC1可作為M2-TAMs預后因子，但與不良預后影響之間的因果關系仍然有待商榷。首先，CD163和MRC1高表達可能是通過其它細胞因子調控其與相對應受體結合而導致，其不良預后影響可能通過與其相關的獨特基因表達來佐證，而對細胞增殖作用可能是由于細胞間的相互作用導致的。此外，CD163和MRC1高表達還可能僅反映M2-TAMs的優先富集，預后價值可歸因于浸潤M2-TAMs密度的主要潛在差異。并且M2-TAMs除了抑制免疫殺傷功能，還通過分泌IL10、TGF-Beta、趨化因子、VEGF等促進血管生長，以利于腫瘤的轉移[18-20]。研究發現[21.22]，CD163和MRC1的促轉移潛力可能使白血病細胞具有更強的侵襲能力和更廣泛的髓外浸潤，最終導致更差的患者預后。盡管有上述討論的證據，但CD163和MRC1高表達在AML發生中的作用仍有待確定。

總之，與健康對照組相比，AML患者CD163和MRC1呈高表達，并且M2浸潤高的患者預后較差，初步論證CD163和MRC1是AML中的一種潛在強預測指標，對AML患者生存產生不利影響，可用于改進現有的基于分子的風險分類方案和指導治療方案的選擇。

參考文獻：

[1]Dohner H，Wei AH，Lowenberg B.Towards precision medicine for AML[J].Nat Rev Clin Oncol，2021，18（9）：577-590.

[2]Ive YA，Hills RK，Simpson MA，et al.Assessment of Minimal ResidualDisease inStandard-Risk AMLJ].NEnglJMed，2016，374 （5）：422-433.

[3]Vanneman M，Dranoff G.Combining immunotherapy and targeted therapies in cancer treatment[].NatRev Cancer，2O12，12（4）： 237-251.

[4]Junttila MR，de Sauvage FJ.Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response[J].Nature，2013，501 （7467）：346-354.

[5]Mao X，Xu J，Wang W，et al.Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment： new findings and future perspectives[J].Mol Cancer， 2021，20（1）：131.

[6]Yang Q，Guo N，Zhou Y，etal.Therole of tumor-associated macrophages （TAMs） in tumor progression and relevant advance in targeted therapyD].Acta Pharm Sin B，2020，10（11）：2156-2170.

[7]WangY，YuJ，Luo Z，etalEngineeringEndogenous Tumor-AssociatedMacrophage-TargetedBiomimeticNano-RBC toReprogram Tumor Immunosuppressive Microenvironment for Enhanced Chemo-ImmunotherapyD]Adv Mater，2021，33（39）：e2103497.

[8]Wang J，Xu L，Xiang Z，et al.Microcystin-LR ameliorates pulmonary fibrosis via modulating C D2 0 6 （ + ） M2-like macrophage polarization[J].Cell Death Dis，2020，11（2）：136.

[9]Vasconcelos DP，Costa M，Amaral IF，et al.Modulation of the inflammatory response to chitosan through M2 macrophage polarization using pro-resolution mediators[].Biomaterials，2015，37： 116-123.

[10]TanJ，FanW，LiuT，etal.TREM2 （ + ） macrophages suppress C D 8 （ + ） T-cell infiltration after transarterial chemoembolisation in hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol，2023，79（1）：126-140.

[11]Kemp SB，Carpenter ES，Steele NG，et al.Apolipoprotein E Promotes Immune Suppression in Pancreatic Cancer through NF-kB-Mediated Production of CXCL1[J].Cancer Res，2021，81 （16）：4305-4318.

[12]Xiang X，Wang J，Lu D，etal.Targeting tumor-associated macrophages to synergize tumor immunotherapyD].Signal Transduct Target Ther，2021，6（1）：75.

[13]XiaY，Rao L，Yao H，etal.EngineeringMacrophagesfor Cancer ImmunotherapyandDrugDelivery DJ.AdvMater，2020， 32（40）：e2002054.

[14]Li C，Xu X，Wei S，et al.Tumor-associated macrophages： potential therapeutic strategies and future prospects in cancer []·J Immunother Cancer，2021，9（1）：e001341.

[15]Kumari N，Choi SH.Tumor-associated macrophages in cancer：recent advancements in cancer nanoimmunotherapies []·J Exp Clin Cancer Res，2022，41（1）：68.

[16]BaiR，Li Y，Jian L，et al.The hypoxia-driven crosstalk between tumor and tumor-associated macrophages：mechanisms andclinical treatment strategies[J].MolCancer，2O22，21（1）：177.

[17]Ngambenjawong C，Gustafson HH，Pun SH.Progress in tumor-associated macrophage （TAM）-targeted therapeutics[J].Adv Drug Deliv Rev，2017，114：206-221.

[18]Yang H，Zhang Q，Xu M，et al.CCL2-CCR2 axisrecruits tumor associated macrophages to induce immune evasion through PD-1 signaling in esophageal carcinogenesis[J].Mol Cancer，2020，19（1）：41.

[19]Geraldo LH，Xu Y，JacobL，etal.SLIT2/ROBO signaling in tumor-associated microglia and macrophages drives glioblastoma immunosuppression and vascular dysmorphia D].J Clin Invest， 2021，131（16）：e141083.

[20]Wang QW，Sun LH，Zhang Y，et al.MET overexpression contributes to STAT4-PD-L1 signaling activation asociated with tumor-associated，macrophages-mediated immunosuppression in primary glioblastomas [J].J Immunother Cancer，2021，9 （10）：e002451.

[21]MooreJA，MistryJ，HellmichC，etal.LC3-associatedphagocytosis in bone marrow macrophages suppresses acute myeloid leukemia progression through STING activation[].J Clin Invest， 2022，132（5）：e153157.

[22]Brauneck F，Fischer B，Witt M，et al.TIGIT blockade repolarizes AML-associated TIGIT M2 macrophages to an M1 phenotype and increases CD47 -mediated phagocytosis DJ·J Immunother Cancer，2022，10（12）：e004794.

收稿日期：2023-12-16：修回日期.2024-03-01

編輯/杜帆