草烏頭種子層積過程中內源激素變化和相關基因表達分析

Abstract：This study aimed to elucidate the regulatory mechanisms underlying seed dormancy release in Aconitum kusnezofii Reichb.by monitoring embryo-to-endosperm length ratio （embryo rate）and quantifying endogenous hormone levels and expression of related genes at key stratification stages.The embryo rate exhibited a “slow-rapid-slow” pattern： remaining stable at 23.31% from day O to 14，sharply increasing to 90.91% by day 42，followed by radicle elongation （0.75cm at day 49） and cotyledon emergence at day 54. Hormone analysis showed a significant decline in abscisic acid （ABA） content（46. 48% reduction compared to day O），while gibberellin A₃ （ GA₃^′ ），indole-3-acetic acid（IAA），methyl jasmonate（MeJA），and brassinosteroid（BR） increased by 34. 77% ， 60.71% ， 97.53% ，and 17.95% ，respectively. Zeatin riboside（ZR） content rose initially，and then declined.Ratios such as GA3/ABA and IAA/ABA significantly increased，indicating enhanced antagonism from growth-promoting hormones against ABA during dormancy release. Expresion analysis showed that key genes involved in hormone metabolism CYP7O7A2（ABA degradation）， KAO （GA biosyn thesis），and YUCCA（IAA biosynthesis） were significantly upregulated，consistent with hormonal changes. Collctively，the continuous decline in ABA content may serve as a key driver of dormancy release，while increased GA₃ ， IAA，MeJA，and BR levels may synergistically and antagonistically interact with ABA signaling to promote embryo development and seed germination.

Key words：Aconitum kusenezofii Reichb. ;Seed dormancy;Embryo-to-endosperm ratio;Hormone

草烏頭（AconitumkusnezoffiiReichb.）為毛茛科多年生草本，廣泛分布于我國東北、華北地區。傳統蒙醫藥中，草烏頭塊根、葉、花及芽等部位分開入藥。草烏頭的干燥塊根為重要特色蒙藥材，也是常用的中藥材，藥材名為草烏（AconitiKusnezoffiiRadix.），具有祛風除濕、溫經止痛功效，用于治療風寒濕痹、關節疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛等癥。干燥葉為蒙（中）藥材，藥材名為草烏葉（AconitiKusnezoffiiFolium），具有清熱、解毒、止痛功效，用于治療熱病發熱、泄瀉腹痛、頭痛、牙痛等癥[1-2]。

草烏頭種子的休眠類型屬于形態和生理休眠，種皮吸水無障礙，胚體積小且形態未分化完全，自然條件下種子5個月才能解除休眠。研究表明，變溫處理和沙藏層積可以縮短草烏頭種子在自然條件下的休眠周期。在層積過程中，胚能夠生長并完成形態和生理后熟，使種子具備萌發條件，以 4^°C 與-5^°C 交替42d效果最佳，發芽率高達 90% 以上。為了進一步縮短休眠周期，一些生長調節劑和外源激素被用來打破草烏頭種子的休眠[3]

植物內源激素在調控植物生命活動中發揮著關鍵作用，尤其在種子休眠的建立、維持與解除過程中具有核心調節功能。其中，脫落酸（Abscisicacid，ABA）與赤霉素（Gibberellin，GA）被普遍認為是調控種子休眠與萌發的一對拮抗激素。ABA在種子成熟階段大量積累，作為主要的抑制因子，可通過抑制胚生長、促進休眠相關基因表達等機制防正早期萌發，其含量變化主要受生物合成與代謝平衡調控[4-5]。相對而言，赤霉素（特別是GA3），被視為解除種子休眠的重要激素，能夠促進胚發育、增強水解酶表達，并加速細胞分裂和伸長，從而啟動種子萌發過程[6]。除ABA與GA3外，多種生長促進類激素也被證明在種子休眠解除中發揮重要調控作用。生長素（Indole-3-aceticacid，IAA）不僅可促進胚軸細胞伸長，還可通過與ABA信號途徑互作調節休眠深度[7]；茉莉酸甲酯（Methyljasmonate，MeJA）可激活與胚萌動相關的信號通路[8；油菜素內酯（Brassinosteroid，BR）通過增強細胞活性和抗逆能力，被認為可降低種子對ABA的敏感性，間接促進萌發9；玉米素核苷（Zeatinriboside，ZR）作為一種細胞分裂素，在吸脹期與胚根伸長期能顯著促進細胞分裂，參與萌發啟動[10-1]。這些激素通常通過與ABA信號通路的協同或拮抗作用，共同參與種子從休眠狀態向萌發狀態的動態轉變。雖然乙烯（Ethylene，ET）、水楊酸（Salicylicacid，SA）等激素在特定脅迫條件下也可影響種子萌發，但其調控效果具有物種依賴性和間接性[12-13]。

目前，草烏頭的研究主要集中于栽培技術、生物堿含量及藥用成分分析等方面，關于其種子休眠與萌發機制的研究仍較為缺乏[14-15]。草烏頭種子具有較強的休眠特性，嚴重制約了其人工繁育效率與資源可持續利用。種子休眠的形成與解除受多種內源激素的精細調控，但其調節機制在草烏頭中尚不明確。因此，本研究以草烏頭種子為研究對象，聚焦ABA， GA₃ ，IAA，MeJA，BR與ZR六種內源激素，系統分析其在層積處理過程中的含量變化及相關基因表達模式，旨在揭示草烏頭種子休眠解除的激素調控機制，為其種子萌發機制解析與優質種苗繁育體系構建提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試草烏頭種子于2020年在自治區赤峰市巴林右旗賽罕烏拉自然保護區采集，并經農業大學草業學院王俊杰教授鑒定為草烏頭種子，凈度 94.23% ，千粒重 1.5247g ，含水量 9.20% 。

1.2種子休眠解除過程生理生化測定

1.2.1低溫沙藏層積處理方法選擇顆粒飽滿、大小均一、無病蟲害的凈度 90% 以上、發芽率 80% 以上種子，室溫下用清水浸泡 48h ，種子與沙王按1：3拌勻，濕度約為 15%～20% ，置于容器中封好。置于層積溫度一 5^°C 與 4^°C 每7d交替一次、相對濕度為 50% 的低溫培養箱中層積，層積42d，定期監測沙子濕度[3]。

1.2.2種子胚發育過程觀察及胚率層積過程中種子胚形態的形成是種子休眠解除的重要原因之一。因此，從Od開始，每7d隨機選取30粒種子，沿著種子中軸線縱切，露出胚和胚乳，在解剖鏡下觀察并測量種胚及胚乳的長度和寬度，計算胚率。

胚率 = 種胚長/胚乳長 ×100%

1.2.3種子休眠解除過程激素含量測定 根據

1.2.2的試驗結果，在層積第0d（CK）層積14d（種子吸漲）層積42d（種子露白）各階段，分別取新鮮種子樣品 1.0g （鮮重，FW），3次重復。激素含量用酶聯免疫試劑盒（ELISAkit）方法測定[16]。

1.3 qRT-PCR方法

根據實驗室未公布草烏頭種子休眠解除過程的轉錄組數據結合激素數據挑選出8個基因進行表達量分析。qRT-PCR反應體系和引物設計見表1和表2。

2 結果與分析

2.1草烏頭種子休眠解除過程胚率變化

種子的休眠和萌發是從靜態胚向動態胚的轉化，并且種子休眠解除過程從種子吸脹開始，以胚根突破種皮結束。本研究草烏頭種子在休眠解除過程中，草烏頭的胚率隨層積時間增加而逐漸增大（圖1）。第0d時種子胚率為 23.21% ;從0d到14d時，種子胚率沒有顯著差異（表3）。從14d開始，草烏頭種子胚率開始迅速升高，第28d種子胚率為60.67% ；在第42d達到 90.91% ，較第od升高了289. 34% 。從第42d開始，草烏頭種子開始露白；第49d時，草烏頭種子胚根長達到 0.75cm ，明顯看出子葉的形狀，子葉間開裂。第56d時，胚根長度

2.2草烏頭種子休眠解除過程內源激素變化

草烏頭種子中ABA含量在層積處理過程中呈持續下降趨勢（圖2）。休眠較深的草烏頭種子中ABA含量較高，為 75.55ng?g^-1FW 。在層積 42d ，ABA的含量顯著降低至 40.43ng?g^-1FW ，較層積Od低了 46.48% 。結果表明，成熟的草烏頭種子中ABA的含量較高，通過低溫層積處理后，ABA的含量逐漸降低。本研究結果表明，ABA在草烏頭種子中含量較高且在休眠解除過程中顯著下降，推測ABA在草烏頭種子休眠的維持與解除中發揮重要調控作用。

草烏頭種子中GA3含量在層積過程中呈“先升后降”趨勢（圖2）。休眠初期（0d），GA3含量較低，僅為 3.02ng?g^-1FW 。隨著層積時間延長，GA3含量逐漸上升，并在14d時達到峰值 4.07ng?g^-1FW ，較層積Od顯著提高 34.77% 。此后GA3含量略有下降。GA3含量在休眠解除關鍵階段的上升，表明其可能通過促進胚發育和細胞伸長等途徑，參與了草烏頭種子由休眠向萌發狀態的轉變過程。

在休眠解除過程中，草烏頭種子中生長素（IAA）的含量隨著層積時間的延長，呈現逐漸升高的變化趨勢（圖2）。層積0d種子中的IAA含量較

低，為 23.56ng?g^-1FW 。層積14d后，種子中的IAA含量顯著升高 （Plt;0.05） ，上升至33.93ng?g^-1FW ，上升了 44.03% 。當種子層積42d后，草烏頭種子的IAA含量達到最高，為 37.86ng?g^-1FW 較層積od高了 60.71% 。IAA含量的持續升高可能在草烏頭種子休眠解除過程中發揮了調控作用。

在休眠解除過程中，隨著層積時間的延長，草烏頭種子中的MeJA含量呈先增加后不變的趨勢（圖2）。成熟的草烏頭種子中的MeJA含量較低，為12.50ng?g^-1FW 。種子完成吸漲后，MeJA的含量顯著升高，為 25.55ng?g^-1FW ，較層積Od提高了104.43% 。當種子休眠解除時，MeJA含量為24.69ng?g^-1FW ，較層積0d上升了 97.53% 。本研究顯示，MeJA在草烏頭種子休眠解除過程中可能對種子萌發起到促進作用。

在休眠解除過程中，草烏頭種子中油菜素內酯（BR）的含量隨著層積時間的延長（圖2），呈現先不變后上升的變化趨勢。層積Od種子中的BR含量較低，為 2.73ng?g^-1FW 。隨著種子完成吸漲階段后，種子中的BR含量沒有顯著變化，為 2.63ng?g^-1FW 。當種子休眠解除時，層積42d草烏頭種子的BR含量出現顯著升高，為 3.22ng?g^-1FW ，較層積0d上升了 17.95% 。研究結果表明，低溫層積可能促進了BR的生物合成，BR在草烏頭種子休眠解除過程中可能發揮促進作用。

在休眠解除過程中，草烏頭種子中玉米素（ZR）的含量隨著層積時間的延長，呈現先升高后下降的變化趨勢（圖2）。層積Od種子中的ZR含量為3.14ng?g^-1FW 。層積14d中，種子中的ZR含量顯著上升，為 4.35ng?g^-1FW ，較層積Od上升了38.54% 。當種子休眠解除時，草烏頭種子的ZR含量出現顯著下降，為 2.80ng?g^-1FW ，較層積0d下降了 10.78% 。ZR含量的這種階段性變化可能與草烏頭種子休眠解除過程中的內源激素調控動態密切相關。

2.3草烏頭種子激素代謝關鍵基因相對表達量分析

依據實驗室獲得的草烏頭種子休眠解除過程轉錄組數據，選取與激素合成、代謝及信號轉導相關的代表性基因進行表達分析。涉及的基因包括：ABA通路中的NCED（合成）、CYP707A2（降解）與PP2C（信號抑制）；GA通路中的KAO（合成）、GA2ox （降解）與 DELLA （信號抑制）；IAA和CTK通路中的 YUCCA 與IPT（均為合成基因）。

隨著休眠解除的推進，ABA合成基因NCED表達上調，降解基因 CYP707A2 的表達量顯著上調，而ABA含量整體下降，表示其降低主要受降解增強所致。同時，ABA信號通路抑制因子 PP2C 表達量下調，反映出其信號活性減弱，說明ABA在該階段受合成-降解與信號調控的協同抑制（圖3）。GA合成基因 KAO 表達升高，降解酶 GA2ox 和信號抑制因子DELLA表達下降，表明GA信號活性增強。IAA與CTK合成基因YUCCA與 IPT 表達水平同步上調，表明其在萌發前期信號活性增強，可能協同調節胚軸伸長與細胞分裂。

激素含量變化與相關基因表達趨勢高度一致：ABA含量下降與CYP707A2上調、PP2C下調相符；GA，IAA，BR含量上升分別對應KAO，YUCCA，IPT 表達增強， DELLA 下調；ZR的階段性變化亦與IPT表達趨勢一致。整體結果顯示，草烏頭種子休眠解除過程中，激素水平與其代謝和信號關鍵基因的表達動態高度協調，反映出多激素協同調控的復合機制。

3討論

種子的休眠和萌發是從靜態胚向動態胚的過程。該過程中大分子營養物質經過各種酶轉化為可吸收的小分子營養物質。種子休眠解除以種子吸脹為起始，至胚根突破種皮結束。本研究中草烏頭種子在層積14d吸脹完成后開始進入快速生長，層積42d胚率最大并開始露白，56d后子葉出土，并且呈現出慢-快-慢的趨勢。可以把草烏頭種子休眠解除過程劃分為種子吸脹、種子胚率為最大胚率的50% 和種子露白三個時期。

在草烏頭種子休眠解除過程中，多種內源激素表現出特征性的動態變化。ABA含量持續下降， GA₃ IAA，MeJA和BR呈不同程度上升，ZR則呈現出先升后降的趨勢。盡管胚率整體持續增長，但激素的變化趨勢并不完全同步，表明不同激素可能在休眠解除的不同階段發揮分工明確的調控作用。ABA在吸脹前期維持較高水平，并在胚率快速上升階段顯著下降，提示其可能在初期休眠維持中發揮抑制作用。相比之下， GA₃ 與IAA等生長促進型激素的逐步上調，可能通過調節細胞分裂和伸長過程，參與激活萌發程序。ZR含量在吸脹期升高，可能與細胞活性提升和分裂增強有關，而后期的下降或與其功能階段性轉變有關?？傮w來看，這些結果表示草烏頭種子休眠解除可能受到多種激素信號的動態協調調控，但其具體機制尚有待進一步研究和功能驗證。

激素作為植物內部信號調節的重要因子，其合成、代謝途徑及相互作用在種子休眠解除過程中發揮關鍵作用。本研究發現，ABA作為典型的生長抑制性激素，其含量在休眠解除過程中顯著下降。ABA的生物合成主要依賴于類胡蘿卜素代謝途徑，其中 NCED（g_- 順式-環氧類胡蘿卜素裂解酶）是ABA合成途徑中的關鍵限速基因[1]，而ABA的分解失活受CYP707A（ABA8'-羥化酶）基因調控[18]本研究中，層積42d時ABA合成關鍵基因NCED與分解代謝關鍵基因 CYP707A 的表達量均明顯上升，結合ABA濃度顯著下降的結果，推測ABA合成速率低于分解速率，從而導致種子ABA水平持續降低，進而促進休眠解除。

在休眠解除過程過程中， GA₃ ，IAA和BR等促進生長的激素含量均顯著升高，協同促進了種子休眠解除。赤霉素（GA）是種子萌發的重要正調控因子，能夠削弱胚乳和胚根周圍組織、減弱機械屏障，促進胚根突破種皮[19-21]。本研究中，GA3含量呈現先上升后下降的變化趨勢，在種子露白時提高了 34.77% ，表明GA3合成在打破種子休眠中起到積極作用[22]。

IAA能夠促進胚細胞的伸長與分化，并在植物生長發育過程中與其他激素協同或拮抗[23-24]。本研究結果顯示，IAA含量在休眠解除各階段均顯著上升，露白階段達到最高水平，與云南重樓種子休眠解除期間IAA動態變化的研究結果一致25，進一步支持了IAA在草烏頭種子休眠解除中的促進作用。

油菜素內酯（BR）作為另一種重要的生長促進因子，在本研究中也表現出含量逐步升高的趨勢，與大豆種子萌發期間BR含量增加的研究結果26相吻合。已有研究表明，BR可通過調控植物細胞的伸長與分裂，促進種子或幼胚的生長發育[27-28]。因此，推測BR在草烏頭種子休眠解除過程中，可能通過調節細胞活動參與了萌發啟動的調控過程，但具體機制仍需進一步實驗證實。

此外，細胞分裂素（CTK）在種子萌發中的作用存在劑量效應及物種差異性[29-31]。本研究發現，休眠解除前期，草烏頭種子中ZR含量上升，有助于促進細胞分裂；而在休眠解除后期，ZR含量下降，適宜濃度的ZR有利于胚根伸長，為種子萌發提供條件。綜上所述，草烏頭種子在休眠解除過程中表現出典型的激素動態變化特征：ABA含量顯著下降， GA₃ IAA，BR等生長促進類激素持續升高，ZR含量則呈階段性波動。盡管各類激素的變化趨勢存在差異，但其在不同發育階段的時序性調控特征，提示內源激素可能通過相互作用形成調控網絡，協同參與草烏頭種子從休眠狀態向萌發狀態的轉變過程。然而，其具體的信號通路和調控機制仍有待通過進一步功能驗證與分子水平研究加以闡明。

4結論

本研究以草烏頭種子為材料，結合胚率變化、激素含量與關鍵基因表達，解析其休眠解除的調控機制。結果顯示，胚率呈“慢-快-慢\"變化，界定了休眠解除的關鍵階段。ABA含量持續下降， GA₃ ，IAA，MeJA和BR上升，ZR先升后降； NCED，CYP707A2 KAO ，YUCCA ，IPT等基因的表達趨勢與激素變化相一致。綜合分析表明，ABA的下降可能為解除休眠的主導信號， GA₃ ，IAA，MeJA和BR通過拮抗ABA、協同調節胚發育與萌發，共同介導休眠解除。研究揭示了草烏頭種子激素互作的階段性特征，為其休眠機制研究與種苗繁育提供理論支撐。

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（責任編輯閔芝智）