白三葉抗旱種質(zhì)資源篩選及抗旱評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選

中圖分類號(hào)：S541.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2025）05-1510-13

Abstract：To identify white clover （Trifolium repens） germplasm resources with exceptional drought resistance and to select efective indicators for evaluating this trait，the present study was conducted using 11O T.repens germplasm resources from natural distributions in Sichuan and other regions，along with the nationally recognized cultivars‘Haifa’and‘Goethe’as test materials.Under natural drought conditions in the field，a prelimi nary evaluation of drought resistance Was performed by observing the differences in phenotypic indices of the test materials.In controlled indoor conditions，the weighted subordinate function method was employed to assess the drought resistance of the initially screened materials by examining changes in the cross-sectional structure of the leaf blades and various physiological parameters.Correlation and principal component analyses were utilized to evaluate thecontribution rate of each index，which facilitated the identification of suitable indicators for assessing the drought resistance of white clover.The results indicated a close relationship between the mor phological characteristics of white clover materials and their drought tolerance，as revealed by cluster analysis. The comprehensive evaluation identified materials Tr210 ，TrlO3，and TrO83 as having strong drought toler ance，while TrO08 and Tr033 exhibited poor drought tolerance. Among the 26 evaluation indices，16 effective indices were ultimately selected，comprising 4 phenotypic indices，8 physiological indices，and 4 leaf micro structure indices.This study provides a theoretical foundation and material basis for the evaluation of droughttolerant germplasm resources，as wellas for the selection and breeding of drought-resistant varieties of white clover.

Key words： Trifolicem repens;Drought resistance;Drought resistance index;Comprehensive evaluation

干旱會(huì)導(dǎo)致植物的正常生長發(fā)育受到嚴(yán)重限制，已成為當(dāng)前全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的最大非生物脅迫之一[1]。我國北方干旱和半旱區(qū)分布廣泛，南方季節(jié)性干旱發(fā)生頻繁，且淡水資源匱乏，缺水問題突出，給草牧業(yè)的生產(chǎn)利用帶來了嚴(yán)重危害。不同品種（或種質(zhì)資源）對干旱脅迫的耐受能力差異較大，選用耐旱型植物（或品種）是對抗干旱環(huán)境對植物生長產(chǎn)生不利影響的有效途徑。

白三葉（Trifoliumrepens）是世界上重要的多年生豆科牧草，為草地畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家及我國大部分地區(qū)建立人工混播草地的重要草種，亦是國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的優(yōu)良草坪地被植物，具有觀賞價(jià)值高、適應(yīng)范圍廣、覆蓋地表及固氮能力強(qiáng)，養(yǎng)護(hù)需求低等特點(diǎn)。然而，白三葉系匍匐生長型植物，根系分布淺， 80% 的根系主要分布在土壤 20cm 左右的表層，從深層土壤中吸收水分的能力弱[2]。在白三葉與多年生黑麥草、鴨茅等禾草的混播草地系統(tǒng)中，降水量減為正常需求的 40% 時(shí)，減產(chǎn)達(dá) 70% 以上，在混播草地中的比例會(huì)降至 3% 以下3。隨全球氣候變化加劇，持續(xù)干旱或季節(jié)性干旱發(fā)生頻繁，干旱脅迫已成為制約白三葉生長及產(chǎn)量穩(wěn)定的重要非生物逆境因子[4]。白三葉為異源四倍體植物，具自交不親和特性，因此，具有高度雜和的遺傳組成特性，并且種群內(nèi)和種群間具有復(fù)雜的遺傳變異。此外，白三葉具有分布區(qū)域廣泛，適應(yīng)生境多元化的特點(diǎn)。因此，白三葉種質(zhì)資源收集與遺傳多樣性研究對于品種改良和育種具有重要意義。近年來國內(nèi)學(xué)者對白三葉種質(zhì)資源的調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在我國西南地區(qū)白三葉種質(zhì)資源十分豐富，其分布的氣候、土壤類型多樣，蘊(yùn)藏優(yōu)良耐旱型白三葉種質(zhì)資源的可能性較大，但是發(fā)掘利用不足[5-6]。然而，目前對白三葉抗旱性鑒定與評(píng)價(jià)的相關(guān)研究主要集中于抗旱表型選擇、抗旱生理機(jī)制解析等方面，缺乏白三葉種質(zhì)資源耐旱性篩選和耐旱性指標(biāo)評(píng)價(jià)的研究[7-9]。因此，系統(tǒng)開展白三葉種質(zhì)資源抗旱性的鑒定評(píng)價(jià)，篩選出一批抗旱性優(yōu)良的白三葉種質(zhì)并且建立有效的評(píng)價(jià)指標(biāo)和方法體系，對于挖掘抗旱的白三葉種質(zhì)資源具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究以110份白三葉種質(zhì)資源以及2份國審品種為試驗(yàn)材料，在田間自然干旱脅迫條件下對供試材料的抗旱性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，并在室內(nèi)控水條件下對抗旱性進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定，并篩選白三葉抗旱性評(píng)價(jià)的有效指標(biāo)，旨在為白三葉抗旱性鑒定以及育種提供理論依據(jù)和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為采集于四川、重慶、貴州等地自然分布的110份白三葉種質(zhì)資源以及國審品種‘Haifa'‘Goethe’，供試材料均種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地白三葉資源圃中。供試材料詳細(xì)信息如表1所示。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1田間自然干旱條件下對白三葉種質(zhì)的抗旱性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)白三葉種質(zhì)資源于2020年種植于資源圃中。在2022年春季干旱期間（3月2日—3月31日）進(jìn)行田間觀測。觀測期間氣溫趨于平穩(wěn)，在試驗(yàn)開始前5d及試驗(yàn)過程中均未出現(xiàn)有效降雨。試驗(yàn)期間對田間供試材料受到干旱脅迫的表型癥狀進(jìn)行觀察，每隔5d觀察一次，并每隔7d測定一次田間土壤持水量。當(dāng)各小區(qū)田間土壤持水量下降至 35% 時(shí)測定供試材料的表型指標(biāo)。使用游標(biāo)卡尺測量葉柄直徑；用直尺測量葉層自然高度和葉柄長度；取白三葉植株主枝復(fù)葉的中間葉，用葉面積測定儀（AM300，UK）測量植株葉面積。對于匍匐莖密度的測定，以磅繩分出 10cm×10cm 的小樣方網(wǎng)，將此樣方網(wǎng)放于不同測定區(qū)域地面上，調(diào)查樣方中匍匐莖個(gè)數(shù)。使用重量法測定離體葉片失水率，取鮮葉片稱重，置于空氣中 ^18h 后再稱重，計(jì)算單位重量葉片在單位時(shí)間內(nèi)的失水量。

1.2.2室內(nèi)控水條件下鑒定抗旱/敏感材料室內(nèi)控制實(shí)驗(yàn)所用材料均采集于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地白三葉資源圃。剪取白三葉相近大小的基部莖段，每個(gè)莖段含3個(gè)生長點(diǎn)，放置于長16.4cm ，寬 13.3cm ，高 5.6cm 的白色塑料盆中土培，使用沙土（河沙和土按1：1混勻），每盆稱重1kg ，每份材料5個(gè)重復(fù)。在第20d時(shí)修剪一次，待其長勢基本一致時(shí)進(jìn)行脅迫處理，脅迫前及脅迫至第14d和28d時(shí)測定相關(guān)指標(biāo)，之后澆水至飽和，恢復(fù)7d后再測定一次指標(biāo)。為了測定PSII的光化學(xué)效率 （F_v/F_m） 和光合性能指數(shù)（ PI_ABS） ，使用葉綠素?zé)晒鉁y定儀（PocketPEA，Hansatech，Norfolk，UnitedKingdom）進(jìn)行測定。將單層葉片放入葉室中進(jìn)行 20min 暗適應(yīng)，然后記錄 F_v/F_m 和 PI_ABS 。采用便攜式式光合測定儀（CIRAS-3，PPsystem，Amesbury，MA，USA）測定光合參數(shù)。相對含水量（RelativeWaterContent，RWC）按照公式：

RWC=[（FW-DW）/（TW-DW）]×100% 進(jìn)行測定。

式中： FW，DW 和 TW 分別表示鮮重（g）干重（g）和飽和重量 。

1.2.3PEG模擬干旱條件下比較抗旱/敏感白三葉的解剖結(jié)構(gòu)及抗旱生理差異剪取白三葉相近大小的基部莖段，使用1倍霍格蘭營養(yǎng)液在方形小白盆中培養(yǎng)，每5d更換一次營養(yǎng)液。在第2Od時(shí)修剪一次，待其長勢基本一致時(shí)使用濃度為 17% PEG-6000模擬干旱脅迫至第10d時(shí)取樣進(jìn)行測定葉片橫切結(jié)構(gòu)參數(shù)和生理參數(shù)。采用石蠟切片方法進(jìn)行制片觀察葉片結(jié)構(gòu)[11]。然后使用生物顯微鏡觀察并拍照，用測微尺測量葉片厚度、上表皮細(xì)胞厚度、下表皮細(xì)胞厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度，計(jì)算葉片組織緊密度、葉片結(jié)構(gòu)疏松度、柵海比。每個(gè)切片10個(gè)視野，取平均值。對于葉綠素含量，將葉片浸泡在 15mL 二甲基亞砜中 48h ，并使用分光光度計(jì)（Spectronic Instruments，Rochester，NY，USA）檢測645和 663nm 處的吸光度[12]。相對電導(dǎo)率（Relativeelectrical，EL）測定參照Blum等[3的方法；為了測定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，向 0.5mL 的粗酶液中加入 1mL 的反應(yīng)液， 95^°C 水浴 30min ，在冰浴上快速冷卻至室溫，搖晃試管以防止氣泡的產(chǎn)生。10000轉(zhuǎn)下離心 10min ，取上清液在 532nm 和600nm 處測定吸光值，計(jì)算MDA含量。使用蘇州科銘生物科技有限公司總抗氧化能力（FRAP法）試劑盒（FRAP-1-G）進(jìn)行總抗氧化能力的測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel2021和Origin2019對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與作圖，利用SPSS22對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、主成分分析和相關(guān)性分析，通過單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)估計(jì)不同處理之間的顯著差異 （Plt;0.05） 。參照郝俊峰等[14的方法，采用加權(quán)數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對110份白三葉資源進(jìn)行抗旱性綜合評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1110份白三葉在田間自然干旱條件下的抗旱性評(píng)價(jià)

當(dāng)自然干旱脅迫至各小區(qū)的田間土壤持水量下降為 35% 時(shí)，對110份白三葉種質(zhì)資源的5個(gè)表型指標(biāo)及葉片失水率進(jìn)行測定，并且以此為依據(jù)使用平均法對110份白三葉種質(zhì)的抗旱性進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建樹狀聚類圖。結(jié)果顯示，不同材料可明顯劃分為4個(gè)類群（圖1）。第1類群包括22份材料，葉柄長度和葉柄直徑分別為 10.52cm，0.82mm ，葉面積和葉層自然高度分別為 3.31cm² 和 9.23cm ，匍匐莖密度為845個(gè) ?m^-2 ，離體葉片失水速率為0.0049g?h^-1. ，表現(xiàn)出植株低矮、葉小型、匍匐莖密度小，且離體葉片失水速率高，表明該類群耐旱性較弱。第2類包括38份材料，葉柄長度為13.59cm ，葉面積為 4.83cm² ，葉柄直徑和葉層自然高度最高，分別為 1.23mm ，12. 84cm ，匍匐莖密度和離體葉片失水速率為892個(gè)， ?m^-2 和 0.0029g?h^-1 ，表現(xiàn)為植株較高，中到大型葉片，抗旱能力較強(qiáng)。第3類群包括17份材料，葉柄直徑、匍匐莖密度和離體葉片失水速率分別為 1.03mm.1239 個(gè) ?m^-2 和 0.0030g?h^-1 葉柄長度和葉面積最大，分別為 16.38cm，6.04cm² 表現(xiàn)為植株高大并且為大葉型、抗旱能力較強(qiáng)。第4類群包括33份材料，葉柄長度和葉柄直徑分別為10.78cm，0.89mm ，葉面積和葉層自然高度分別為3.39cm² 和 12.15cm ，其中，匍匐莖密度為1362個(gè) ?m^-2 在四個(gè)類群中最高，表明該類群繁殖能力最強(qiáng)。離體葉片失水速率最低，為 0.0025g?h^-1 ，表現(xiàn)為植株較高，葉片中到大葉型，抗旱能力強(qiáng)。基于抗旱性初步評(píng)價(jià)，選擇抗旱性較好的20份材料與對干旱較敏感的1O份材料，并且以國審品種‘Haifa'‘Goethe'作為對照，在室內(nèi)控水條件下進(jìn)一步對初篩白三葉種質(zhì)資源的抗旱性進(jìn)行鑒定。

2.2干旱條件下32份白三葉的脅迫表型及生理指標(biāo)變化

30份白三葉種質(zhì)資源以及兩份白三葉國審品種在干旱條件下表型發(fā)生明顯變化（圖2）。表型變化表明干旱脅迫導(dǎo)致白三葉葉片萎蔫和失綠。其中 Tr083 ，Tr103， Tr210 以及對照材料‘Haifa'萎蔫程度較輕；材料 Tr033 和 Tr009 嚴(yán)重萎蔫， Tr008 已經(jīng)全部枯死。

在干旱脅迫下，各材料的葉片相對含水量、光化學(xué)效率和光化學(xué)性能指數(shù)均顯著降低，而電導(dǎo)率顯著升高（表2-5）。干旱脅迫28d后，材料Tr083，Tr103， Tr210 仍保持較高的相對含水量，而材料Tr008 已完全枯死。復(fù)水7d后，各材料均有所恢復(fù)，相對含水量提高，而 Tr008 未能恢復(fù)（表2）。干旱脅迫導(dǎo)致白三葉葉片的電導(dǎo)率升高，在復(fù)水7d后減小。其中，材料 Tr083，Tr103，Tr210 電導(dǎo)率升高幅度較小。32份白三葉種質(zhì)資源的 F_v/F_m 和PI_ABS 如表3，表4所示，正常條件下，各種質(zhì)資源的F_v/F_m 在 0.73～0.83 之間， PI_ABS 在 2.3～4.2 之間。干旱脅迫導(dǎo)致大部分材料的 F_v/F_m 和 PI_ABS 顯著降低，但材料TrO83，Tr103， Tr210 的 F_v/F_m 和 PI_ABS 降幅較小，而 Tr027 ， Tr023 Tr024 的 F_v/F_m 降幅最高達(dá) 15% Tr008 ，Tr010， Tr033 的 PI_ABS 降幅最大顯著高于對照。復(fù)水后，材料 Tr004 ， Tr008 ， Tr024 ，Tr033 并未恢復(fù)，其他均有恢復(fù)。

2.332份白三葉種質(zhì)資源抗旱性綜合評(píng)價(jià)

以相對含水量、相對電導(dǎo)率、光化學(xué)效率、光化學(xué)性能指數(shù)這4個(gè)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)依據(jù)，運(yùn)用隸屬函數(shù)法對32份白三葉種質(zhì)資源抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)（圖3），根據(jù)綜合評(píng)價(jià)D值，32份白三葉種質(zhì)資源抗旱性排序結(jié)果如下： Tr210gt; Tr083gt;Tr103gt;Tr074gt; Tr087gt;Tr028gt;Tr053gt;Tr037gt;Tr079gt;Tr054gt; Tr070gt;Tr136gt;Tr012 gt; Tr010gt;Tr009gt;Tr089gt; Tr016gt;Tr088gt;Tr134gt;Haifagt;Tr116 gt; Tr137gt;Goethegt;Tr017 gt; Tr039 gt; Tr023 gt; Tr130gt;Tr009gt;1 Γr024gt;Tr004gt;Tr010gt;Tr033gt;Tr00ξ 3。其中，Tr210種質(zhì)資源的綜合評(píng)價(jià)D值為 0.97，Tr083 和 Tr103 次之，分別為0.96和 種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)最低，為0.00，其次為 Tr033 和Tr010，分別為0.54和0.64。

2.4PEG模擬干旱條件下抗旱/敏感白三葉材料的解剖結(jié)構(gòu)及生理特性

為了進(jìn)一步探究不同白三葉種質(zhì)資源抗旱性差異的結(jié)構(gòu)及生理特性，以3份抗旱性較強(qiáng)（Tr083，Tr103，Tr210），2份對干旱敏感（Tr008，Tr033）以及國審品種‘Haifa'為供試材料，比較分析干旱脅迫下供試材料的解剖結(jié)構(gòu)及光合特性與抗氧化能力。2.4.1 模擬干旱脅迫下白三葉葉片橫切解剖參數(shù)分析表型變化表明，在 17% PEG-6000模擬干旱脅迫下10d后導(dǎo)致白三葉出現(xiàn)不同程度的萎蔫和失綠（圖4）。 Tr008 和 Tr033 比 Tr083 ，Tr103，Tr210 遭受更嚴(yán)重的損傷。不同的白三葉種質(zhì)資源葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)的基本組成相同，由上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮組成（圖5A）。在正常條件下，上下表皮細(xì)胞排列整齊、緊密；柵欄組織在上表皮下面，均由一層排列較緊密的長柱型細(xì)胞構(gòu)成；在柵欄組織與下表皮之間的海綿組織，由排列

疏松且形狀不規(guī)則的細(xì)胞組成。如圖5B所示，在干旱脅迫下，葉片厚度、葉片柵欄組織和海綿組織均變薄，材料 Tr008 最為明顯，并且出現(xiàn)表皮細(xì)胞溶解，柵欄組織和海綿組織無規(guī)則排布。TrO33，Tr083，Tr103 柵欄組織進(jìn)一步溶解，形成氣腔。

柵欄組織和海綿組織越發(fā)達(dá)，表明植物葉片越厚，防止水分過量蒸騰，有利于增強(qiáng)植物的抗旱能力。供試的6份白三葉種質(zhì)的葉片結(jié)構(gòu)特征參數(shù)存在一定的差別（表6）：正常條件下，各材料的葉片厚度在 150～ 210μm 之間，其中 Tr008 葉片厚度為 150.29μm ，顯著低于其他材料 （Plt;0.05） ;柵欄組織在 55～85μm 之間，其中 Tr008 Tr033 顯著低于其他材料 （Plt;0.05） ，而Tr033， Tr083 Tr103 之間差異不顯著；海綿組織厚度在 之間， Tr103 顯著高于其他材料 （Plt; 0.05），而其他材料之間差異不顯著。在干旱脅迫下，柵欄組織厚度，海綿組織厚度，葉片緊密度和葉片疏松度均降低，而 Tr210 的柵海比高于對照。其中，Tr103的柵欄組織厚度和海綿組織厚度分別為86.43μm 和 88.64μm ;葉片厚度為 192.86μm ，顯著高于其他材料 （Plt;0.05） ： Tr210 Tr083 Tr103 的葉片緊實(shí)度三者之間無顯著差異，而顯著高于 Tr008 Tr033 和國審品種‘Haifa' （Plt;0.05） 。

2.4.2干旱脅迫下白三葉植株的光合能力和抗氧化能力差異正常條件下，不同材料之間的光合參數(shù)無顯著差異（圖6）。干旱脅迫導(dǎo)致各個(gè)材料的光合參數(shù)均降低。但是， Tr103 的凈光合速率、胞間二氧化碳濃度、蒸騰速率、水分利用效率顯著高于其他材料（ ?Plt;0.05） （圖6），而材料 Tr008 和 Tr033 的光合參數(shù)指標(biāo)均低于其他材料。當(dāng)遭受干旱脅迫時(shí)， Tr210 ，Tr103， Tr083 的葉綠素含量保持在平均水平，但 Tr008，Tr033 的葉綠素含量顯著下降 Plt; 0.05）。正常條件下，6份供試材料之間丙二醛（Malondialdehydecontent，MDA）、總抗氧化能力無顯著差異。干旱脅迫導(dǎo)致各個(gè)材料MDA的含量呈上升趨勢。其中，材料TrO83的MDA含量顯著低于其他材料，并且材料TrO08， Tr033 的MDA含量最高。總抗氧化能力表明，材料Tr2lO，Trl03，Tr083 顯著高于 Tr008 Tr033 和國審品種‘Haifa’，具有更強(qiáng)的耐旱性 。

2.5干旱脅迫下白三葉種質(zhì)資源各指標(biāo)的相關(guān)性分析及評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選

相關(guān)性分析表明（圖7）：15個(gè)指標(biāo)之間存在極顯著相關(guān)性，8個(gè)指標(biāo)之間相關(guān)性顯著，而離體葉片失水速率、上表皮厚度、下表皮厚度這3個(gè)指標(biāo)與其他指標(biāo)均無相關(guān)性。因此選擇具有相關(guān)性的23個(gè)指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步的主成分分析。為了評(píng)估干旱脅迫對白三葉的損傷，對測定的各項(xiàng)形態(tài)及生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。圖7b顯示，PC1和PC2分別解釋了總體方差的 78.7% 和 11.3% ，累計(jì)為 90% ，具有很好的代表性，可作為白三葉耐旱性評(píng)價(jià)的綜合指標(biāo)。在PC1成分中，丙二醛含量，上表皮厚度以及電導(dǎo)率呈現(xiàn)高度負(fù)相關(guān)，其余指標(biāo)呈現(xiàn)高度正相關(guān)。并且葉柄長度、葉面積、相對含水量、相對電導(dǎo)率、總抗氧化能力、凈光合速率、蒸騰速率、水分利用效率、葉綠素含量和柵海比載荷較大。在PC2成分中，上表皮厚度、葉片疏松度、葉柄長度、總抗氧化能力、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度呈現(xiàn)高度正相關(guān)。通過對各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析與主成分分析，篩選出4個(gè)形態(tài)指標(biāo)（葉柄長度、葉面積、葉柄直徑、葉層自然高度）、8個(gè)生理指標(biāo)（相對含水量、相對電導(dǎo)率、葉綠素含量、總抗氧化能力、丙二醛含量、凈光合速率、蒸騰速率、水分利用效率）和4個(gè)葉片顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)（葉片總厚度、海綿組織厚度、葉片疏松度、柵海比）作為抗旱性評(píng)價(jià)的有效指標(biāo)。

圖332份白三葉種質(zhì)資源抗旱性綜合評(píng)價(jià)

3討論

干旱脅迫被認(rèn)為是影響植物生長發(fā)育、限制作物產(chǎn)量的非生物脅迫之一[15]。植物在長期進(jìn)化過程中形成了很多不同的抗旱策略以適應(yīng)環(huán)境。其中，葉片是植物暴露在地面上最多的器官，是其進(jìn)化過程中可塑性最大的營養(yǎng)器官，在干旱環(huán)境下，通常會(huì)形成多種抗旱適應(yīng)形態(tài)，最能反映植物對干旱生境的適應(yīng)能力[16]。研究表明，在對受到干旱脅迫的白三葉的根系和葉片表型分析發(fā)現(xiàn)，白三葉的葉片比根系對干旱更為敏感，且功能葉是干旱的敏感部位，新生葉比功能葉具有更強(qiáng)的耐旱能力[17]。劉軍等[18研究表明，紫花苜蓿受到水分脅迫時(shí)，其株高、莖粗和干草產(chǎn)量都會(huì)隨之減小。郭穎等19研究表明，隨著干旱脅迫程度加劇，4種鄉(xiāng)土禾草的株高生長和單葉葉面積受到嚴(yán)重抑制。本試驗(yàn)在田間自然干旱初篩時(shí)，以葉面積、葉柄長度、葉柄直徑、葉層自然高度、匍匐莖密度這5項(xiàng)表型指標(biāo)和離體葉片失水速率作為主要參考指標(biāo)，對白三葉耐旱性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。田間觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)田間土壤含水量在 35% 左右時(shí)，大部分白三葉生長受到抑制，葉片出現(xiàn)萎蔫，并且出現(xiàn)葉片黃化、生物量減少的現(xiàn)象，并且110份材料的葉片形態(tài)與離體葉片失水速率存在顯著差異。本研究表明，隨著干旱程度的加劇，白三葉的葉面積、葉柄長度、葉柄直徑、葉層自然高度、匍匐莖密度受到嚴(yán)重抑制，并且耐旱性較強(qiáng)的材料葉面積、葉柄長度、葉柄直徑、葉層自然高度、匍匐莖密度整體大于耐旱性較弱的材料，受到抑制程度較輕。這與Bissuel-Belaygue等人[20]研究結(jié)果一致。

植物的抗旱主要通過形態(tài)變化和多種復(fù)雜的生理過程共同調(diào)節(jié)對缺水條件的適應(yīng)[21-22]。在植物中，干旱引起的氣孔閉合以保持水分導(dǎo)致光合作用速率降低。因此，在保水性和植物生長之間取得良好的平衡非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，大豆植株在中度干旱期間葉片相對含水量升高，然后隨著持續(xù)干旱葉片相對含水量逐漸下降[23]。本研究中，在自然干旱28d的情況下， Tr083 ，Tr103，Tr210材料的RWC降幅很小，而 Tr033 Tr008 材料在自然干旱下降幅較大，不同白三葉材料在干旱脅迫下RWC的下降幅度差異較大，表明抗旱性強(qiáng)的材料具有更好的保水性。氣孔變化對干旱脅迫非常敏感，輕微缺水會(huì)導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度降低，使得胞間二氧化碳濃度降低并減緩葉片中積累的光合產(chǎn)物的輸出，從而對光合作用產(chǎn)生抑制反饋24。此外，PIABS是PSII最大光化學(xué)效率和激活光化學(xué)反應(yīng)中心總數(shù)的關(guān)鍵指標(biāo)，反映了脅迫條件下葉綠體的健康狀況[25]。崔維佳等[26]研究表明，當(dāng)冬小麥?zhǔn)艿礁珊得{迫時(shí)，光合性能顯著下降，隨著干旱程度加劇下降越多，當(dāng)受到重度干旱脅迫時(shí)凈光合速率可降低 50% 以上。本研究表明，在干旱脅迫下，對于干旱敏感的材料Tr008 和 Tr033 的光合參數(shù)和葉綠素含量顯著低于其他材料，與先前的研究結(jié)果一致2。此外，植物對干旱脅迫的敏感性或耐受性可能與伴隨干旱的氧化應(yīng)激能力有關(guān)2。因此分析抗氧化系統(tǒng)的成分對于篩選抗旱性強(qiáng)的種質(zhì)資源至關(guān)重要。研究表明，非生物脅迫下植物體內(nèi)的ROS會(huì)大量積累，這會(huì)給細(xì)胞造成氧化傷害，損傷細(xì)胞的生理生化功能[28]。MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，MDA的積累代表了細(xì)胞膜的氧化損傷程度[29]。張一龍等[30]研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤含水量降低、干旱脅迫加劇，狗牙根MDA呈升高趨勢。本研究結(jié)果表明，在干旱脅迫下，不同白三葉材料的MDA含量均呈上升趨勢，且Tr083，Tr103， Tr210 這3個(gè)抗旱型材料的上升幅度顯著小于對照品種和兩個(gè)敏感型材料（ Tr008 和 Tr033 ），說明抗旱性強(qiáng)的白三葉材料可能通過減少ROS的積累緩解膜質(zhì)過氧化來抵御干旱脅迫，從而減少體內(nèi)的MDA含量[31]。Vaseva等[32]對不同抗旱能力的白三葉品種中的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Per-oxidase，POD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）同工酶進(jìn)行分析，結(jié)果表明白三葉不同品種在抗氧化方面存在差異。在本研究中，白三葉的總抗氧化能力在干旱脅迫下降低，而Tr1O3的總抗氧化能力降幅顯著低于對照及其他材料， Tr008 的總抗氧化能力降幅最大，說明材料Tr103的抗旱性強(qiáng)于 Tr008 ，這可能是因?yàn)門r103具有更高的抗氧化能力，減少干旱脅迫造成的氧化損傷，從而具有更強(qiáng)的耐旱性。

眾多學(xué)者對植物葉片解剖結(jié)構(gòu)與抗逆性方面做了大量研究，認(rèn)為植物葉片越厚，其儲(chǔ)水能力就越強(qiáng)，有利于防止水分過分蒸騰[33]。因此，葉片厚度通常被視為衡量植物抗旱能力的一個(gè)重要指標(biāo)[34]。張德巧等[35]也認(rèn)為葉片厚度、上表皮厚度可以作為葉片抗旱性解剖結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究表明，與正常條件相比，各材料在干旱脅迫下葉片厚度均變薄，但是其中Tr103在干旱脅迫下的葉片厚度顯著大于對照，而 Tr008 的葉片厚度最小。常英俏等36研究表明，柵欄組織越厚，細(xì)胞越小，排列越緊密，植物的光能利用率越高。植物葉片柵欄組織越發(fā)達(dá)表示其抗旱能力越高。柵海比提高可提高植物的光合效率，而光合效率的提高可能是植物可抵御干旱脅迫的一個(gè)重要原因[37]。葉片越厚、柵欄組織厚度越大、柵欄組織結(jié)構(gòu)緊實(shí)度越大、柵海比越高，植物的抗旱性越強(qiáng)，反之則抗旱性越差[38-39]。本試驗(yàn)表明，干旱脅迫下，不同材料的柵欄組織厚度在 21.63～73.26μm 之間，其中Tr103最大， Tr008 最小，葉片結(jié)構(gòu)緊密度在 22.46～39.68% 之間， Tr083 最大， Tr008 最小， Tr103 的柵欄組織、海綿厚度和柵海比都最大，葉片疏松度越大，葉片抗旱性越差。

植物抗旱性受到多種外界因素影響以及多種生理機(jī)制調(diào)控，使用單項(xiàng)指標(biāo)鑒定作物的抗旱性強(qiáng)弱具有片面性，因此抗旱性材料的篩選需要多種指標(biāo)進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在玉米、大豆、高梁、綠豆等植物抗旱性鑒定以及抗旱指標(biāo)篩選方面做了大量研究[40-42]。在抗旱指標(biāo)方面，根據(jù)不同發(fā)育時(shí)期，所選用的指標(biāo)不盡相同。王焱等通過綜合評(píng)價(jià)值D值和加權(quán)抗旱系數(shù)WDC值作為抗旱綜合評(píng)價(jià)方法，結(jié)合相關(guān)分析、灰色關(guān)聯(lián)及逐步回歸分析，將根長、發(fā)芽率和活力指數(shù)作為對干旱脅迫的敏感指標(biāo)，并在59份材料中篩選得到了3份極強(qiáng)抗旱型種質(zhì)[43]。張燦軍等[44]研究表明，在小麥抗旱性鑒定中，應(yīng)從小麥發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)、根系形態(tài)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)和產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)等方面，選取多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行抗旱綜合評(píng)價(jià)。然而在白三葉種質(zhì)資源抗旱指標(biāo)篩選方面報(bào)道較少。在本試驗(yàn)中，主成分分析表明，生理響應(yīng)指標(biāo)、生長相關(guān)指標(biāo)和葉片橫切參數(shù)指標(biāo)具有較高的貢獻(xiàn)率，代表性好。相關(guān)分析表明，形態(tài)指標(biāo)（葉柄長度、葉面積、葉柄直徑、葉層自然高度）;生理指標(biāo)（相對含水量、相對電導(dǎo)率、葉綠素含量、總抗氧化能力、丙二醛含量、凈光合速率、蒸騰速率、水分利用效率）；葉片顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)（葉片總厚度、海綿組織厚度、葉片疏松度、柵海比）相關(guān)性高，可作為白三葉耐旱性評(píng)價(jià)的綜合指標(biāo)。李怡等45對54份羊草種質(zhì)資源抗旱性綜合評(píng)價(jià)中表明，株高、葉長、葉寬、葉片數(shù)、分?jǐn)?shù)、生物量等形態(tài)指標(biāo)測定簡單易行，試驗(yàn)結(jié)果直觀可靠，具有代表性。

4結(jié)論

本研究通過田間自然干旱條件初篩以及室內(nèi)控水條件下復(fù)篩，對110份白三葉種質(zhì)資源抗旱性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，不同種質(zhì)之間耐旱性差異較大，其中Tr210，Tr103， Tr083 具有較強(qiáng)耐旱性，耐旱表型優(yōu)于常用國審品種‘Haifa’和‘Goethe'; Tr008 ，Tr033耐旱性較差。通過對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析與主成分分析，篩選出葉層自然高度，葉面積，葉柄長度及直徑4個(gè)形態(tài)指標(biāo)，相對含水量、水分利用效率、相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、總抗氧化能力、葉綠素含量、凈光合速率、蒸騰速率8個(gè)生理指標(biāo)和葉片總厚度、海綿組織厚度、葉片疏松度、柵海比4個(gè)葉片顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)，作為白三葉抗旱性評(píng)價(jià)的有效指標(biāo)。研究結(jié)果可為白三葉耐旱品種選育提供理論依據(jù)和材料基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯劉婷婷）