高性能豬脫細胞真皮基質敷料的制備方法與表征

中圖分類號：TB34 文獻標志碼：A

Preparation and characterization of high performance antibacterial porcine acellular dermal matrix dressings

YANG Bo1，WANG Kai1， YANG Guang1， MO Tianlu1， LIANG Fu1，CHEN Xiaohong2 （1.SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineeing，UniversityofShanghaiforSienceandTechnologyangha20093， China;2.SchoolofaterialsndChemistry，UniversityofhanghaiforcienceandTechnologyhanghai2o3，ina）

Abstract： Acellular dermal matrix has been used as a clinical wound dressing due to its ability to promote wound healing. However， similar products on the market have poor mechanical strength and lack antimicrobial properties. In this study， we improved the preparation process of porcine acelular dermal matrix（PADM） and incorporated quercetin （QCT） and poly-L-lysine （PLL） to fabricate an antimicrobial quercetin-poly-L-lysine-porcine acellular dermal matrix（QCT-PLL-PADM） dressing with enhanced performance. Fourier transform infrared spectrum analysis show that the samples retain the natural triple-helical structure of collagen after the addition of QCT and PLL. Differential scanning calorimetry and mechanical property analysis show that the QCT-PLL-PADM samples exhibit a 50% increase in thermal stability and a 90% improvement in mechanical properties compared to pure PADM. Moreover， QCT-PLL-PADM demonstrates excelent antimicrobial activity， with an antimicrobial rate exceeding 92% . Additionally， cellular compatibility analysis reveals that QCT-PLL-PADM promot cell adhesion and growth， with a relative growth rate of cells over 75% . Compared to commercial products， the mechanical strength of QCT-PLL-PADM is enhanced by 90%～110% ， and other properties are enhanced by 20%～40% . These results indicate that QCT-PLL-PADM can serve as an effective wound dressing and has potential applications in skin and oral tissue repair.

Keywords： porcine; acellular dermal matrix; dressing quercetin; poly-L-lysine

傷口敷料是一類用于創傷、燒傷、潰瘍等傷口覆蓋的醫用材料，主要作用是為傷口提供理想的恢復環境，加快傷口愈合[]。脫細胞真皮基質敷料具有良好的生物相容性、結構穩定性和豐富的生物活性成分，在促進皮膚修復和傷口愈合等領域有重要的應用價值[2。但脫細胞真皮基質并不具備抗菌性能，這限制了其進一步的應用。因此，對脫細胞真皮基質進行抗菌改性成為研究熱點。常用于脫細胞真皮基質的抗菌劑包括季銨鹽、金屬納米材料和天然抗菌材料等[3-5]。季銨鹽和金屬納米材料均具有抗菌譜廣和抑菌活性強等優點，常用作傷口敷料抗菌劑，但它們的生物相容性較差，需要對使用濃度進行嚴格控制。

本文使用豬皮制備豬脫細胞真皮基質（porcineacellulardermalmatrix，PADM）。PADM的主要成分為I型膠原蛋白，這使其具有良好的生物活性、低抗原性和生物相容性。Pabst等對PADM的分析結果表明，PADM具有良好的生物相容性，并且PADM允許周圍細胞攀附生長的同時自身慢慢降解吸收，最終由新生結締組織完全取代[]。但是，純脫細胞真皮基質容易被機械應力破壞或被體內膠原酶降解，并且不具備抗感染能力，這會導致愈合過程中出現問題[8-9]。因此，開發一種可以防止感染，同時促進傷口愈合的高性能脫細胞真皮基質十分必要。

槲皮素（quercetin，QCT）是一種類黃酮，以糖昔的形式存在于蔬菜和其他植物中，分子結構獨特，在4個位點只有一個額外的氧原子[10]，這種特殊結構使其具有一定的生物活性、抗菌作用和抗氧化性[-2]。聚賴氨酸（poly-L-lysine，PLL）是一種多肽類抗菌劑，該聚合物是通過賴氨酸殘基的 a -羧基和 ε? -氨基發生縮合反應而形成的酰胺鍵，可以與帶負電的物質產生靜電吸附作用[13]。PLL具有熱穩定性高、安全無毒、抗菌能力強、可生物降解和生物相容性好等優點[14]，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌等具有顯著的抑制效果，

目前，市面上的脫細胞真皮基質產品的機械強度與抗菌能力已無法滿足越來越高醫用需求。因此，本文使用了丙三醇縮水甘油醚（GPE）和QCT作為PADM的交聯劑，選擇QCT和PLL為PADM提供優異的機械性能和抗菌能力。對材料的熱穩定性、力學性能和抗菌性能等進行了評價，并比較了QCT-PLL-PADM與PADM的生物相容性。

材料與方法

1.1 材料

豬皮購自北京瑞健高科生物科技有限公司；GPE購自爭銳化工有限公司；氯化鈉、十二烷基苯磺酸鈉、胰蛋白酶、甘氨酸、三乙醇胺、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氯化銨、乙醇、溴化鉀、QCT和PLL等均購自國藥集團化學試劑有限公司；海奧口腔修復膜和蓋氏口腔修復膜購自口腔醫院。

1.2 儀器

恒溫培養搖床（THZ-100，一恒科學儀器有限公司）、離心機（TDL-80-2B，安亭科學儀器廠）、超聲機（XM-400ULF，小美超聲儀器（昆山）有限公司）、真空冷凍干燥機（SCIENTZ-25T，寧波新芝凍干設備股份有限公司）、烘箱（DFZ6030A，一恒科學儀器有限公司）、傅里葉紅外光譜儀（Nicoletisl0，ThermoFisher，美國）、差式掃描量熱儀（DSC-8000，PerkinElmer，美國）、掃描電子顯微鏡（JSM-IT500HR，JEOL，日本）、微電腦式拉力試驗機（TM2101-T5，濟南泰欽電氣有限公司）、紫外分光光度計（UV-VISUV5，METTLERTOLEDO，瑞士）、酶標儀（Infinite200PRO，TECAN，美國）。

1.3 方法

1.3.1 PADM樣品制備

a.將厚度為 0.4mm 的豬皮裁剪成 1.5mm×2mm （長 × 寬）的樣品，放置于離心管中，加人 10mL 質量分數為 0.5% 的 NaCl 溶液，設置離心機轉速為4000r/min ，離心 60min ，重復3次。

b.設置搖床溫度為 38^°C ，轉速為 200r/min 樣品放置于 50mL 質量分數為 0.4% 的十二烷基苯磺酸鈉溶液中，加入 和 5μL 脂肪醇聚乙烯醚，勻速轉動 60min 后，用去離子水沖洗，重復3次。

c.分別取 25mL10U/mL 的胰蛋白酶緩沖溶液和 20U/mL 的中性蛋白酶緩沖溶液混合，將樣品置入其中。設置搖床溫度為 28^°C ，轉速為 200r/min 勻速轉動 12h 后，用去離子水沖洗，再在質量分數為 2% 的 ΔNaOH 和質量分數為 2.5% 的 NaS 溶液中勻速轉動 60min 后，用去離子水沖洗。沖洗完成后，在質量分數為 2% 的 ΔNH₄Cl 溶液中轉動60min ，然后使用去離子水沖洗。

d.將樣品置于 5U/mL 的胰蛋白酶緩沖溶液中，設置搖床溫度為 32^°C ，轉速為 200r/min ，勻速轉動 60min 后，用去離子水沖洗，重復2次。

e.配置 pH 為10.5的 ΔNaHCO₃–NaOH 緩沖液，搖床設置同步驟 ，將樣品置于緩沖液中轉動 30min 后取出，設置搖床溫度為 35^°C ，轉速為 200r/min 將樣品置于 50mL 緩沖液中，加入 3mL GPE、0.5mL 三乙醇胺，勻速轉動 36h 。

f.在交聯液中添加 1.5g 甘氨酸，勻速轉動60min 后使用去離子水沖洗，設置搖床溫度為32% ，轉速為 200r/min ，將樣品置于質量分數為1% 的 NH₄Cl 溶液中轉動 60min ，然后用去離子水沖洗至廢液 pH 為7.5。設置搖床溫度為 35^°C ，將樣品置于質量分數為 1% 的甘氨酸溶液中勻速轉動 60min 后，用去離子水沖洗，初步制得PADM樣品。

1.3.2 QCT-PLL-PADM樣品制備

將 400mgQCT 溶解到 20mL 乙醇中，超聲處理 15min 得到均勻的溶液。將PADM加人到QCT溶液中，再分別加入質量分數為 0.1% 、0.3% 、 0.5% 、 0.7% 的PLL，在 37^°C 恒溫搖床中交聯 24h 。每個樣品用超純水洗滌5次，送至冷凍干燥機中凍干 ^12h 后，在 35^°C 、濕度 85% 的干燥箱中回軟6h[15]

1.3.3傅里葉變換紅外光譜測定

取 2mg 樣品與 100mg 溴化鉀研磨均勻，壓制成薄片。傅里葉紅外光譜采集過程中，保持室溫為 25^°C ，設置光譜儀掃描范圍為 400～4000cm^-1 、掃描速率為每光譜32次掃描。

1.3.4掃描電子顯微鏡觀察

將一定量的樣品噴金處理，置于掃描電子顯微鏡下，在 20kV 加速電壓條件下進行放大觀察。

1.3.5差示掃描量熱法測定

用差示掃描量熱儀測定樣品的熱變性溫度。將 5mg 樣品密封在鋁坩鍋中，以空坩鍋作為對照。參數設置：溫度范圍 10～120^°C ，加熱速率10^°C/min ，氮氣吹掃速率 20mL/min 。

1.3.6抗張強度及斷裂拉伸率測定

用拉力試驗機以 100mm/min 的速率測量矩形樣品的抗張強度和斷裂拉伸率。

1.3.7孔隙率測定

稱取樣品 1g （準確到 _0.0001g ，記為 m₁ 。將樣品割為小碎片，面積 1cm² 左右，投入 50mL 容量瓶中，往瓶中加人去離子水至刻度標線。用循環水真空泵將容量瓶內抽真空至樣品不會有氣泡冒出。對含有去離子水和樣品的容量瓶進行稱重，記質量為 m₂ 。再將樣品碎片取出，對剩余的含有去離子水的容量瓶稱重，質量記為 m₃ 。樣品的孔隙率 P 計算公式為

P=[（m₂-m₃-m₁）/（m₂-m₃）]×100%

每組進行3個平行實驗，最終結果為其平均值。

1.3.8水蒸氣透過率測定

將樣品放人生理鹽水中浸泡 30min ，量取10mL 的生理鹽水加入試管中，對裝有生理鹽水的試管稱重，質量記為 m₀ 。將試管口用樣品密封住，然后用線繩扎緊固定。將密封住的試管在（36±1） C 恒溫干燥箱中干燥， 24h 后稱重，質量記為m4。樣品的水蒸氣透過率 Wr計算公式為[16]

Wr=（m₀-m₄）/S

式中， s 為試管口的面積。每組進行3個平行實驗，最終結果為其平均值。

1.3.9抗菌性測定

將活化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于LB（Luria-Bertani）液體培養基中培養，在轉速 200r/min 、溫度 37% 的搖床中培養 12h ，在600nm 處測定菌液的光密度（opticaldensity，OD）值，之后與LB液體培養基進行混合，稀釋至OD值約為0.6，然后按 1：1000 比例繼續稀釋，稀釋至菌落計數約為 。將經高溫滅菌處理后的樣品加入到 3mL 稀釋后的菌液中，其中，不添加樣品的為空白對照組，在轉速 200r/min 、溫度 37^°C 、光照條件下的搖床中培養 24h ，測定600nm 處的OD值。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌來源于，由實驗室自行分離保存。抗菌率F計算公式為[17]

F=[（D₀-D₁）/D₀]×100%

式中， D₀，D₁ 分別為對照組、實驗組在 600nm 處的OD值。

1.3.10細胞相容性測定

使用人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2）作為模型細胞，通過CCK-8法測定并體外評估樣品的細胞毒性。將樣品切成 10mm×70mm 的矩形，置于 50mL 離心管中紫外滅菌 ^12h ，然后浸泡在9.3mL 細胞培養基中 24h ，得到提取物。根據樣品的厚度（根據《 ：ISO 10993-12： 2012? ）計算浸提比例為 6cm²/mL 。細胞培養基是補充有體積分數為 10% 的胎牛血清和體積分數為 1% 的DMEM（Dulbecco'smodified Eaglemedium）培養基。消化細胞培養瓶中的HK-2細胞，用完全培養基調整細胞至 1×10⁴ 個 /mL 后，吸取 100μL 細胞懸液鋪入96孔板中，置于 37^°C 、 CO₂ 體積分數為 5% 的恒溫培養箱中 24h 后，去除完全培養基，在每個孔中加入 100μL 浸泡提取液，同時做完全培養基空白對照組，置于 37^°C 、 CO₂ 體積分數為 5% 的恒溫培養箱中孵育1、3、 5d 。在每個時間點，于96孔板中每孔加入 10μL 的CCK-8試劑，孵育 2h 。在酶標儀檢測 492nm 波長下，測量樣品的OD值。人腎皮質/近曲小管上皮細胞來自市農業科學院保存。細胞相對增長率 R 計算公式為[18]

R=（D₂/D₃）×100%

式中， D₂ 、 D₃ 分別為樣品組、對照組在 492nm 處的OD值。

2 結果與分析

以豬皮為原料，對制備的PADM和QCT-PLL-PADM樣品進行一系列分析，部分結果與市面常用產品進行對比。

2.1 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜可以表征樣品的微觀結構，不同質量分數的PLL對QCT-PLL-PADM樣品的基團和微觀結構造成的影響如圖1所示。QCT-PLL-PADM樣品的光譜中并不存在QCT與PLL的特征峰，這表明QCT 和PLL與 PADM結合[19-20]。對于PADM樣品， 3410cm^-1 附近的峰為酰胺A，由 的拉伸振動和氫鍵產生[21]； 1650cm^-1 的峰為酰胺I，由 C=0 拉伸振動產生； 1545cm^-1 的峰為酰胺Ⅱ，由 的彎曲振動與 C-N 的拉伸振動產生。酰胺I和酰胺ⅡI主要表征膠原蛋白的二級結構[2-23]，酰胺 A存在說明膠原蛋白三螺旋結構保持穩定。由圖1可知，隨著PLL含量的增加，QCT-PLL-PADM樣品酰胺條帶特征峰并無削弱跡象，這表明QCT和PLL對膠原蛋白的特征性三螺旋結構并無影響[24-25]，膠原蛋白生物學特性結構保持完整，這與細胞相容性結果一致。

2.2 掃描電子顯微鏡分析

脫細胞真皮基質是由膠原分子、原纖維、纖維和纖維束組成的多層聚集體，膠原分子與纖維之間的化學鍵可以將膠原與纖維拉緊，使樣品結構略微收縮，變得更加致密。從圖2（a）的箭頭處可觀察到，PADM樣品中的膠原纖維束逐層堆疊并交織在一起形成網狀結構，這種結構可以提高樣品的抗拉伸能力，在傷口愈合過程中提供良好的支撐和結構支持，更好地促進組織重建。從圖 2（b）～（c） 的箭頭處可觀察到，PLL交聯后以顆粒狀形式附著在QCT-PLL-PADM樣品纖維間隙上，隨著PLL質量分數的增加，其附著量也隨之增加，這會對樣品的孔隙率造成一定影響。圖2（d）箭頭處表明，PLL在質量分數為 0.5% 時開始附著在樣品表面，這使得PLL更容易接觸并殺死細菌。圖2（e箭頭處表明，當PLL的質量分數升至0.7% 時，樣品表面的PLL顯著增加，這可能會覆蓋膠原蛋白表面的生物活性位點，導致樣品對細胞黏附能力下降，使得細胞增殖和遷移能力變弱[26-27]。

2.3 熱分析

樣品的熱分解過程可以通過差示掃描量熱法（differential scanningcalorimetry，DSC）檢測。對脫細胞真皮基質而言，溫度的升高會導致其結構發生變化，膠原蛋白中的氫鍵和一些弱鍵會發生斷裂，分子間作用力逐漸降低。溫度的升高會破壞膠原蛋白三螺旋結構，使樣品理化性質發生變化[28]，這不利于傷口愈合過程的順利進行。市面上的產品，如國內海奧口腔修復膜、國外蓋氏口腔生物膜的熱變性溫度在 45～52°C ，不具備較強的耐熱性。圖3和圖4表明，膠原蛋白的熱變性溫度相對較低，在 45^°C 左右，添加QCT與PLL后，QCT-PLL-PADM樣品的熱變性溫度顯著上升至67.9^°C 。這說明交聯后，樣品的結構更加穩定，樣品的耐熱性增加。并且，PLL質量分數過高時，會在樣品表面形成覆蓋物，這種表面改性也會提高樣品的耐熱性。樣品熱變性溫度的升高有利于保持膠原蛋白的生物相容性和理化性質，同時表明QCT與PLL發生有效交聯，

2.4 機械性能分析

抗張強度和斷裂拉伸率是材料力學性能的重要測試指標，通常用于表征材料抵抗外力的能力。膠原基生物醫用材料在臨床應用中應具有一定的柔韌性、抗張強度和抗撕裂性，以免對機體的傷口修復造成影響[2]。因此，調節膠原蛋白基生物材料的力學性能尤為重要。目前，脫細胞真皮基質的強度已經無法滿足一些生物醫學應用的臨床需求。

PLL質量分數對樣品機械性能的影響如圖5所示。隨著PLL質量分數的增加，樣品的抗張強度逐漸提升，在PLL質量分數為 0.5% 時，達到最大值 97.4MPa 。相較于市面上產品 40～50MPa 的抗張強度，性能提升較大。這說明了QCT、PLL和膠原蛋白分子形成了穩定的化學鍵，使膠原纖維排列得更加緊密，從而提高了抗張強度。當PLL質量分數為 0.7% 時，抗張強度下降，這可能是由于樣品中反應性基團的消耗以及纖維中PLL填充過多造成的，這可能會破壞膠原纖維的排列，使得部分結構剛性過強，導致應力集中，受到外力更容易發生斷裂。

對于需要保持張力的身體部位（如皮膚、硬腦膜、肌腱等），適當的斷裂拉伸率可以促進創傷組織恢復[29]。目前，市面上產品的斷裂伸長率通常在 112%～118% ，QCT-PLL-PADM的最大斷裂拉伸率為 117% 。QCT-PLL-PADM斷裂拉伸率表現為先增加后減小，增加說明形成的化學鍵為氫鍵。因為氫鍵可以使膠原纖維之間形成穩定的交織網絡，這種優化的組織結構使得膠原纖維能夠在受到外部拉伸力時，各個纖維之間相互支撐和配合，減少了斷裂的可能性，提高了斷裂拉伸率。隨著PLL質量分數從 0.5% 增加至 0.7% QCT-PLL-PADM的膠原纖維網絡變得更致密，形成更緊、更強的剛性結構，導致材料的斷裂拉伸率下降。纖維被過度拉伸時其以定向方式聚集，這使纖維更難變形，從而降低斷裂拉伸率。

2.5 孔隙率分析

脫細胞真皮基質通常具有較為緊密的結構，但由于缺乏必要的微孔結構，血管內皮細胞可能難以快速長入，不能為細胞的生長增殖提供良好的微環境，也不利于物質的交換，進而影響組織修復和重建[30]。大量的實驗研究也證實，合適的孔徑和較高的孔隙率能夠有效促進組織再生。理想的膠原材料應為三維纖維狀多孔結構，孔與孔之間相互貫通，孔隙率高于 80%^81] 。但過高的孔隙率也會導致材料機械性能下降，因此，需要根據具體的應用要求進行調整和優化。

PLL對樣品孔隙率的影響如圖6所示。隨著PLL質量分數的增加，樣品的孔隙率逐漸降低。這是因為更多的PLL會占據樣品的孔隙空間，使得孔隙變小。PLL分子較大，結合到樣品表面后會產生空間位阻效應，阻礙其他分子進入孔隙，導致孔隙率的降低。同時，交聯反應會使基質形成更加緊密的網絡結構，從而降低樣品的孔隙率。PLL質量分數低于 0.7% 時，樣品孔隙率仍然保持在 80% 以上，與市面上的產品相接近。

2.6 水蒸氣透過率分析

水蒸氣透過率是醫用敷料的一個重要指標。皮膚創面治療過程中，往往會有大量的傷口滲出液產生，若不能及時除去滲出液，會造成創面積液，從而影響傷口的恢復。但是，創面的恢復需要一個濕潤的有利環境，水蒸氣透過率不能太大，以免造成創面干燥。臨床上普遍認為，敷料的水蒸氣透過率應保持在創面蒸發率的 50% 左右，即2500 g/（m2-24 h）左右[16]

由圖7可知，隨著PLL質量分數的增加，樣品的水蒸氣透過率逐漸降低，在PLL質量分數為 0.5% 時，接近臨床標準 2500g/（m²?24h） 。降低原因是PLL分子鏈上的氨基與樣品發生靜電相互作用，填充了樣品的孔隙，形成了更致密的結構，該結構會降低樣品的透氣性和水分蒸發速率，從而有助于保持基質內部的水分。PLL具有較強的吸濕性，能夠起到物理阻隔的作用，減緩水分子的蒸發和流失，提高樣品的保濕能力。綜上，PLL的加入能有效降低樣品的水蒸氣透過率，改善其水蒸氣阻隔性能，

2.7 抗菌性分析

生物醫用材料應具有抗菌特性，以防止傷口感染。多肽抗菌劑PLL的抗菌性實驗結果如圖8所示，隨著PLL質量分數的增加，抗菌效果逐步提高，當PLL質量分數為 0.5% 時，抗菌率達到了最大值 92% 。PLL是一種陽離子多肽，可以通過靜電作用與細菌細胞膜表面的負電荷相互吸引，進而破壞細胞膜的完整性，致使細胞內容物泄露，最終殺死細菌。此外，通過破壞細菌生物膜的結構和功能，聚賴氨酸可以阻止細菌的附著和生長，從而減少細菌的繁殖和感染能力。在PLL質量分數較低時，其主要抗菌成分在PADM的間隙中通過氫鍵與膠原纖維交聯[32]，當質量分數達到 0.5% 時，抗菌成分開始交聯在QCT-PLL-PADM樣品表面，更容易與細菌接觸并將其殺死，從而提高樣品的抗菌能力。

2.8 細胞相容性分析

CCK-8法常用于檢測細胞體外存活和增殖，細胞的生長情況如圖9所示。細胞的光密度值增加，表明細胞正常增殖，且添加PLL樣品的光密度均高于純PADM，這說明PLL可以促進細胞的增殖及黏附。而隨著PLL質量分數的增加，光密度在第3天和第5天開始下降，這說明PLL質量分數過高時會出現相容性問題，導致細胞的增長速率下降。而由圖10可知，當PLL質量分數為0.5% 時，樣品的相對增長速率仍高于 75% ，說明細胞增殖速度并不會受到過分抑制。綜上可得，QCT和PLL的引入不會對脫細胞真皮基質的生物相容性產生不利影響。因此，綜合理化性質和細胞毒性試驗結果，樣品滿足生物材料對細胞相容性的要求。

3結論

本文對脫細胞真皮基質的制備工藝進行優化，并添加生物活性因子QCT和可降解抗菌劑PLL，制得的QCT-PLL-PADM樣品保持了膠原蛋白的天然三螺旋結構，同時具備較強的抗菌能力，且樣品的熱穩定性、機械強度和親水性全面提升。在PLL質量分數為 0.5% 時，QCT-PLL-PADM樣品的熱分解溫度上升到 70% ，抗張強度達到 97.4MPa ，拉伸斷裂率為 109% ，相較于市面上常用的產品，熱穩定性能提高了 20% ，機械強度提高了 90%～110% 。此外，樣品水蒸氣透過率和孔隙率符合臨床使用標準，且抑菌率達到了 92% 細胞相對增率在 75% 以上。這說明QCT-PLL-PADM具有良好的生物相容性，可在傷口修復和組織再生等方面進行應用。

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（編輯：董偉）