在原發(fā)性肝癌中的表達及ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

[摘要]"目的"探討hsa_circ_0023984在原發(fā)性肝癌（hepatic"celluler"cancer，HCC）及癌旁組織的表達與臨床意義，構(gòu)建內(nèi)源競爭性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。方法"下載并處理基因擴展綜合數(shù)據(jù)庫中GES97332數(shù)據(jù)集肝癌組織和癌旁組織樣本的circRNA表達譜，篩選差異表達circRNA。檢測34例肝癌患者組織中hsa_circ_0023984的表達情況，分析其與臨床病理特征間的關(guān)系。構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過基因本體論（gene"ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，KEGG）富集分析進一步了解其功能。結(jié)果"hsa_circ_0023984在腫瘤組織中較癌旁組織中低表達。hsa_circ_0023984表達水平與包膜情況有關(guān)（F=3.47，Plt;0.05）。共獲得3個靶向miRNAs，Hub基因為PARGC1、GNG4、WNT5A、CDK6、SP1、KRAS、GNAI3、NCOA3、PIK3R1、MAPK8。GO分析與KEGG分析表明hsa_circ_0023984的下游mRNAs可能參與癌癥通路與癌癥的膽堿代謝通路。結(jié)論"hsa_circ_0023984在HCC中高表達，hsa_circ_0023984的高表達可能與HCC惡性發(fā)展有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]"原發(fā)性肝癌；circRNA；hsa_circ_0023984

[中圖分類號]"R73""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.08.002

Expression"of"hsa_circ_0023984"in"hepatic"celluler"cancer"and"construction"of"the"ceRNA"network

QIN"Rusu1，2，"WU"Linghong1，3，"LIANG"Shanxiong4，"YANG"Li1，"HUANG"Tianren2

1.Department"of"Public"Health，"Guangxi"Medical"University，"Nanning"530021，"Guangxi，"China;"2.Department"of"Experimental"Research，"Affiliated"Tumor"Hospital"of"Guangxi"Medical"University，"Nanning"530021，"Guangxi，"China;"3.Department"of"Statistics，The"Fourth"Affiliated"Hospital"of"Guangxi"Medical"University/Liuzhou"Workers’"Hospital，"Liuzhou"545000，"Guangxi，"China;"4.Medical"Record"Department，"Affiliated"Tumor"Hospital"of"Guangxi"Medical"University，"Nanning"530021，"Guangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"the"expression"of"hsa"_"circ"_"0023984"in"hepatic"celluler"cancer（HCC）"and"its"adjacent"tissues"and"to"analyze"its"clinical"significance，"and"to"construct"an"endogenous"competitive"RNA"regulatory"network.nbsp;Methods"CircRNA"expression"profiles"of"cancer"tissue"and"adjacent"tissue"samples"from"GES97332"dataset"in"Gene"Expession"Omnibus"database"were"downloaded"and"circRNA"differential"expression"was"screened."The"expression"of"hsa_circ_0023984"was"detected"in"the"tissues"of"34"HCC"patients，"and"the"relationship"between"it"and"the"clinicopathological"features"was"analyzed."The"protein"interaction"network"was"constructed，"and"the"function"was"further"understood"by"gene"ontology（GO）"and"Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes"（KEGG）"enrichment"analysis."Results"The"expression"of"hsa_circ_"0023984"was"lower"in"tumor"tissues"than"in"adjacent"tissues."The"expression"level"of"hsa"_"circ"_"0023984"was"related"to"the"envelope"condition"（F=3.47，"Plt;0.05）."Three"targeted"miRNAs"were"obtained，"and"the"Hub"genes"were"PARGC1，"GNG"4，"WNT"5"A，"CDK"6，"SP"1，"KRAS，"GNAI"3，"NCOA3，"PIK3R1，"and"MAPK"8."GO"analysis"and"KEGG"analysis"indicated"that"downstream"mRNAs"of"hsa_circ_0023984"may"be"involved"in"cancer"pathways"and"the"choline"metabolism"pathway"in"cancer."Conclusion"High"expression"of"hsa_circ_0023984"in"primary"HCC，"and"high"expression"of"hsa"_"circ"_"0023984"may"be"related"to"the"malignant"development"of"primary"HCC.

[Key"words]"Hepatic"celluler"cancer;"circRNA;"hsa_circ_0023984

原發(fā)性肝癌（hepatic"celluler"cancer，HCC）是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤[1]。HCC早期癥狀不明顯，惡性程度高，易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，且常伴有門靜脈癌栓，大部分患者被診斷時已為晚期，預(yù)后較差，5年復(fù)發(fā)率達70%[2-3]。因此早發(fā)現(xiàn)、早治療是改善HCC患者預(yù)后的有效途徑。近年來，研究表明非編碼RNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中circRNA頗受關(guān)注。CircRNA廣泛存在于原核生物與真核生物細胞中，不受核酸外切酶和核糖核酸酶的影響，具有穩(wěn)定性。其結(jié)構(gòu)保守，序列穩(wěn)定，具有一定的組織特異性[4]。研究表明hsa_circRNA_"104348可直接靶向miR-187-3P，激活Wnt/β-catenin信號通路，從而影響HCC細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡[5-6]。本研究旨在探討hsa_circ_0023984在HCC及癌旁組織的表達與臨床意義，對預(yù)測的靶向mRNA進行功能和通路富集分析為HCC的早期診斷及靶向治療、改善預(yù)后提供新的科學(xué)依據(jù)。

1""資料與方法

1.1""CircRNA篩選

從基因擴展綜合（Gene"Expession"Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中下載GSE97332數(shù)據(jù)集（包括7組HCC患者腫瘤與癌旁組織circRNA的基因芯片數(shù)據(jù)）。使用GEO在線分析工具GEO2R分析GSE97332數(shù)據(jù)集的差異表達circRNA，并篩選circRNA。

1.2""組織中RNA的提取

本研究收集2021年5月至2024年6月期間在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的34例HCC患者的癌組織及距離腫瘤邊緣gt;3cm的癌旁組織，所有患者經(jīng)病理確診且術(shù)前未接受任何其他治療。采用Trizol法提取組織樣本中的總RNA，并通過NanoDrop2000微量分光光度計測定A260/280評價RNA純度。采用TAKARA試劑盒進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative"real-time"polymerase"chain"reaction，qRT-PCR）實驗。

1.3"""GO功能和KEGG通路富集分析

通過STRING在線工具，設(shè)置置信度得分gt;0.3，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein"interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。提取Hub基因，構(gòu)建circRNA-miRNA-"mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。采用DAVID數(shù)據(jù)對上述預(yù)測到的mRNAs進行基因本體論（gene"ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.4""統(tǒng)計學(xué)方法

采用R"4.4.1與SPSS"26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，計量資料以均數(shù)±標準差（"）表示，組間比較采用t檢驗。GraPhPad"Prism9軟件繪制hsa_circ_0023984在HCC及癌旁組織的表達圖。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用秩和檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""hsa_circ_0023984表達比較

GSE97332數(shù)據(jù)集共篩選出17個差異circRNAs，其中7個上調(diào)、10個下調(diào)，hsa_circ_0023984在GSE97332數(shù)據(jù)集中下調(diào)。qRT-PCR實驗結(jié)果顯示癌組織中hsa_circ_0023984的相對表達量為11.47±2.29，癌旁組織為12.86±2.41，與癌旁組織比較，HCC組織中hsa_circ_0023984顯著上升。

2.2""hsa_circ_0023984表達水平與腫瘤臨床病理的關(guān)系

單因素分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0023984表達與患者包膜情況相關(guān)，無包膜和不完整包膜、完整包膜間的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.479，Plt;0.05）。見表1。hsa_circ_0023984表達水平與患者有無肝硬化無關(guān)（Pgt;0.05）。

2.3""靶向miRNA及mRNA的預(yù)測

共預(yù)測出3個miRNA，分別為hsa-miR-1206、hsa-miR-198、hsa-miR-892b。通過這3個miRNA的mRNA靶向分子，預(yù)測出254個mRNA，其中hsa-miR-1206靶向35個mRNA，hsa-miR-198靶向121個mRNA，hsa-miR-892b靶向98個mRNA。

2.4""PPI網(wǎng)絡(luò)和ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在STRING網(wǎng)站對254個mRNA"構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)與circRNA-minRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，前10位Hub基因為PPARGC1、GNG4、WNT5A、CDK6、SP1、KRAS、GNAI3、NCOA3、PIK3R1、MAPK8，見圖1。

2.5""GO功能與KEGG通路富集分析

GO富集分析表明，分子功能主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等（Plt;0.05）。細胞組分主要富集在神經(jīng)元胞體、高爾基體、細胞質(zhì)、細胞膜等（Plt;0.05）；生物進程主要集中在細胞黏附、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、平滑肌細胞遷移、蛋白磷酸化等（Plt;0.05）。KEGG通路富集分析主要富集在癌癥通路、松弛素信號通路、內(nèi)分泌受阻通路及癌癥的膽堿代謝通路等（Plt;0.05）。

3""討論

本研究通過對GSE97332數(shù)據(jù)集進行分析，顯示hsa_circ_0023984較癌旁組織顯著低表達，而qRT-PCR結(jié)果顯示hsa_circ_002398在肝癌組織中顯著上調(diào)。考慮可能是樣本差異所致，測序樣本為7對組織，小樣本量容易受到個體差異的影響。雖然癌旁組織可能受腫瘤局部環(huán)境影響，導(dǎo)致基因表達變化，但考慮到正常組織難以獲取且circRNA具有較好的穩(wěn)定性和組織特異性，使用癌旁組織作為對照是合理的，仍需進一步驗證以確保結(jié)果的準確性和廣泛適用性。此外，男性患者在本研究中占比較高，可能與HCC在男性中更高的發(fā)病率及其相關(guān)危險因素（如酗酒、吸煙、肝炎病毒感染及性別差異）有關(guān)。研究表明hsa_circ_0023984在食管鱗狀癌組織和細胞系中顯著上調(diào)。hsa_circ_0023984過表達與食管鱗狀癌患者的晚期臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。研究顯示hsa_circ_0023984在嬰兒血管瘤也是高表達[8]。本研究在肝癌組織中hsa_circ_0023984表達上調(diào)，提示hsa_circ_0023984可能與HCC的發(fā)生有關(guān)。結(jié)合患者的臨床病理信息及實驗室檢查結(jié)果進行分析顯示，hsa_circ_0023984的表達與腫瘤的包膜存在差異，其中不完整包膜的表達量較高，而腫瘤無包膜的患者的hsa_circ_0023984表達量較低，與其余臨床病理特征無明顯關(guān)系。不完整包膜又稱假包膜，由于其邊界不清，腫瘤易浸潤發(fā)展，惡性發(fā)展及轉(zhuǎn)移程度大。本研究不完整包膜患者的hsa_circ_0023984表達量較高，提示hsa_circ_0023984的表達可能影響HCC的惡性進展。但腫瘤無包膜患者的表達量卻較低，可能是樣本過少導(dǎo)致。

circRNA可結(jié)合相應(yīng)的miRNA調(diào)節(jié)下游mRNA的表達，從而參與調(diào)控疾病的發(fā)生、發(fā)展。hsa_circ_"0023984通過海綿miR-1294調(diào)控食管鱗狀癌細胞增殖、遷移和侵襲[7]。本研究篩選出hsa-miR-1206、hsa-miR-198和hsa-miR-892b作為hsa_circ_0023984的潛在靶點。hsa-miR-1206已被證實在缺血再灌注中作為生物標志物，且通過吸附于circRNA-0043256上，抑制肺癌發(fā)生。hsa-miR-198在胰腺癌的診斷和預(yù)后中有潛在價值[9-11]。hsa-miR-892b被證實在順鉑處理的胃癌細胞中顯著下調(diào)，這表明它可能參與順鉑的抗癌作用通路[12]。這些miRNA在不同的癌癥研究中顯示出重要的生物標志物和潛在的治療靶點價值。本研究預(yù)測10個關(guān)鍵Hub基因，其中PPARGC1A、WNT5A、CDK6、SP1、KRAS、GNAI3等基因已被報道在HCC中具有重要作用。PPARGC1A在肝癌組織中的下調(diào)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)[13]；WNT5A可能通過β-catenin/E-"cadherin信號通路上調(diào)抑制肝癌細胞增殖和遷移[14]；CDK6的過表達已被證明與肝硬化引起的HCC發(fā)生和致癌作用有關(guān)[15]；SP1為miR-138的靶基因，miR-138可與"SP1基因的3’UTR結(jié)合，敲除SP1可抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲[16]；GNAI3在HCC中下調(diào)，且能抑制肝癌細胞遷移和侵襲[17]；NCOA3則促進HCC細胞生長和腫瘤進展[18]。KRAS是本次預(yù)測的10個基因排名第1位的基因，突變的KRAS可通過活性氧積累促進"mTOR激活，導(dǎo)致肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移[19-20]。因此結(jié)合以上預(yù)測結(jié)果，提出猜測hsa_circ_0023984可結(jié)合hsa-miR-"892b調(diào)控KRAS而影響肝癌的發(fā)生和發(fā)展，且可能與活性氧的產(chǎn)生有關(guān)。KEGG通路富集分析顯示254個mRNA涉及癌癥、松弛素信號通路、內(nèi)分泌抗藥性等多個與腫瘤發(fā)生相關(guān)的通路，這些通路在HCC、慢性腎病、乳腺癌和前列腺癌等疾病中也可能存在交叉[21-23]。提示這些疾病可能存在一定聯(lián)系，需要后續(xù)相關(guān)實驗進行驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0023984在HCC中高表達，并篩選出相關(guān)的miRNA及靶向mRNA，構(gòu)建circRNA-"miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而，本研究樣本量較小，且缺乏細胞和動物實驗的生物學(xué)功能驗證，未來需進一步實驗驗證。綜上，hsa_circ_"0023984在HCC中高表達，hsa_circ_0023984的高表達可能與HCC惡性發(fā)展有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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