番茄灰霉病生防菌的分離鑒定·發酵條件優化及其防治效果

關鍵詞灰葡萄孢；銅綠假單胞菌；鑒定；發酵優化；生防

中圖分類號 文獻標識碼A

文章編號 0517-6611（2025）08-0133-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.08.028

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AbstractAbcoacte35withoodcotetagistBotrtsineresolatedfrozospresoiloftatoi tion rate was 5 1 . 6 7 % .Thestrain was identifiedasPseudomonas aeruginosa basedonmorphological and molecular biologyanalysis.Theoptimized cultural medium and fermentation conditions for strain 2135 resulted in an inhibition rate of 9 2 . 9 4 % .Thebiocontrol effect of different dilutedconcentratiosofferentationbrothontomatgayoldinitroandpotedpantsasevaluatedTesultsshowedtatteoalfer mentation broth hada biocontrol effect of 8 6 . 0 5 % on detached leaves and 7 5 . 5 3 % on potted plants.

Key WordsBotrytis cinerea；Pseudomonas aeruginosa；Identification；Fermentationoptimization；Control effect

番茄灰霉病是番茄生產上發生普遍且危害嚴重的一種病害。該病菌可對番茄的多個部位進行侵染危害，在番茄果實表面形成“花臉斑”，嚴重后果實被霉層覆蓋腐爛；在葉片上形成“V\"形斑或圓形斑，造成葉片脫落，還能引起植株莖稈腐爛[1]。番茄灰霉病在全國各地番茄種植地區廣泛流行，尤其是對高溫高濕的保護地番茄危害更加嚴重[2]。常常造成番茄植株死亡，直接減產20%～30%，甚至60%以上[3-4] 。

番茄灰霉病的防治方法主要有選育抗病品種、使用化學藥劑防治以及生物防治。由于選育品種時間較長等因素導致目前該病的抗性品種較少，而使用化學藥劑防治會出現環境污染、病原菌產生抗藥性等問題[5]。生物防治中的生防菌均篩選于自然界，對環境友好，對人類安全，因此生物防治成為當今病害防治的新方法和研究熱點[6-7]

菌株2135是從番茄根部周圍土壤中篩選到的1株細菌，研究發現，該細菌對番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）具有較強的抑制效果。筆者對菌株2135進行了形態學觀察、 DNA序列分析以及生理生化測定等研究，探索了該菌的發酵培養基組分以及發酵條件，并初步研究了其拮抗效果，為該菌株的進一步開發利用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤、植株選取及采集。在設施蔬菜種植區（ 番茄灰霉病發生嚴重的地塊取土，將番茄根際周圍 王層的王壤取出，上下翻動，混勻后裝入自封袋中。

選取番茄灰霉病發病植株及健康植株的根和莖，然后裝入自封袋中。1.1.2菌株。供試番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）由分離并保存。1.1.3培養基。LB培養基：蛋白陳 ，酵母粉 ，蒸餾水 ；PDA培養基：馬鈴薯 ，葡萄糖 ，瓊脂 ，蒸餾水 。1.1.4番茄品種。番茄品種“漢姆1699”，由赤峰和潤農業高新科技產業開發有限公司選育。

1.2 方法

1.2.1生防菌株分離。采用平板稀釋法對采集的土壤及番茄根莖中的生防菌進行分離。用無菌水對土壤進行梯度稀釋，配制稀釋到 的土壤懸浮液；將番茄根莖表面清洗干凈，選取內部組織置于研缽中，用磷酸緩沖液磨碎，用無菌水將研磨液配制成 的懸浮液。吸取土壤和根莖懸浮液上清液 ，分別涂布于LB培養基上。

將平板置于 培養箱中培養 ，選取菌落特征不同的單菌落，純化培養，觀察記錄各菌落特征。重復3次。1.2.2生防菌株篩選。采用平板對峙法對分離出的菌株進行番茄灰霉病菌的抑制作用測定。將活化培養7d的番茄灰霉病菌打成直徑 的菌餅，將菌餅置于PDA平板中央，在距離菌餅 處用滅菌針點接菌株2135，設不接菌株2135的PDA平板為對照，置于 培養箱中培養。重復3次。待對照平板灰霉菌長滿培養血時調查結果。

抑菌率 （對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑 × 1 0 0 %

1.2.3 生防菌株鑒定。

1.2.3.1培養性狀觀察。將活化后的菌株劃線培養于LB培養基上， 培養 ，根據《常見細菌系統鑒定手冊》[8]觀察記錄菌落顏色、形狀等特征。同時將不同菌株進行革蘭氏染色。

1.2.3.2分子生物學鑒定。菌株采用16SrDNA基因序列分析并對生防菌進行序列鑒定。菌株DNA的提取使用TS-INGKE植物DNA提取試劑盒（通用型）。采用通用引物27F（ -AGTTTGATCMTGGCTCAG- ）和1492R（ -GGTTAC-CTTGTTACGACTT- ）進行PCR擴增[9]。由擎科生物有限公司進行測序，比對采用MEGA7.0軟件，系統發育樹構建采用 Neighbor-Joining 法。

1.2.4發酵培養基及條件優化。

1.2.4.1發酵培養基組分優化。方法參照潘曉梅[0]，碳源分別為葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉。氮源分別為硝酸銨、氯化銨、尿素、硫酸銨和硝酸鈉。無機鹽分別為硫酸鎂、色氨酸、氯化錳、硫酸鐵、氯化鈣。將不同成分發酵液 裝入 滅菌三角瓶中，然后選取在LB培養基上培養 的菌株2135單菌落分別接人不同成分的發酵液中，每瓶接種一個單菌落。將發酵液置于 的振蕩培養箱中（ 培養 ，按 與PDA混合均勻后倒入培養皿。在各處理培養皿中接入番茄灰霉菌，3次重復。將培養皿置于 恒溫培養箱中，7d后調查結果。

1.2.4.2發酵條件優化。方法參照潘曉梅[10]，接種量分別為1 % 2 % . 5 % 和 10 % 。發酵時間為 ，每處理間隔 。搖床轉速為 ，每處理間隔 ；初始 為 ，每處理間隔0.5；溫度為 ，每處理間隔 次重復。

1.2.5 菌株發酵液對番茄灰霉病的生防效果評價。

1.2.5.1菌株發酵液對番茄離體葉灰霉病的生防效果。方法參照潘曉梅[10]，將濃度為 個 的番茄灰霉菌孢子懸浮液，分別與不同稀釋濃度的菌株發酵液以1：1體積混合均勻。每個培養皿中放置1片番茄葉，番茄葉下使用浸濕的濾紙進行保濕，在番茄葉主葉脈旁接人上述各混合液 次重復，置于 恒溫培養箱中，7d后調查結果。

防效 （對照組平均病斑直徑-處理組平均病斑直徑）/對照組平均病斑直徑 × 1 0 0 %

1.2.5.2菌株發酵液對盆栽番茄灰霉病的生防效果。選取苗齡 的番茄進行試驗，先在番茄葉片上噴灑菌株發酵液， 后再在噴灑過菌株發酵液的葉片上噴灑濃度為 1 × 個 的番茄灰霉菌孢子懸浮液。對照不噴灑菌株發酵液，直接噴灑番茄灰霉菌孢子懸浮液。每處理1株番茄，每株番茄處理5片真葉，3次重復。對照開始發病后，每隔 調查1次發病情況。分級標準：0級，無病斑；1級，病斑面積占葉面積 1 / 2 0 以下；2級，病斑面積占葉面積gt; 級，病斑面積占葉面積 gt; 1 / 6 ～ 1 / 3 ； 4 級，病斑面積占葉面積gt;13～12；5級，病斑面積占葉面積12 以上[1]

病情指數 = Σ （各級病葉數 × 相對級數值）/（調查總葉數×最高級數值） × 1 0 0

防治效果 （對照組病情指數-處理組病情指數）/對照組病情指數 × 1 0 0 %

2 結果與分析

2.1生防菌的篩選從赤峰市松山區初頭朗鎮、大廟鎮蔬菜種植園區共采集番茄根際土壤5份，采集番茄灰霉病發病番茄根和莖4份，共分離純化52株細菌。其中9株菌對番茄灰霉病菌的拮抗效果明顯（圖1），抑菌率可達 4 0 . 4 2 % ～5 1 . 6 7 % ，其中2135拮抗效果最明顯，抑菌率可達 5 1 . 6 7 % （表1），因此選取菌株2135作為番茄灰霉病菌的拮抗菌。

Fig.1Inhibition effects of different strains on mycelia against Botrytis cinerea

2.2 菌株2135的鑒定

2.2.1菌株2135的菌落形態。菌株2135在LB培養基上為黃綠色、圓形、光滑的菌落，菌落微隆起，革蘭氏陰性（圖2）。2.2.2菌株2135的分子鑒定。將菌株2135的16SrDNA基因片段序列提交至GenBank數據庫進行Blast比對，系統發育樹結果顯示，菌株2135與銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa聚在同一分支（圖3）。根據菌株2135的培養特征和16SrDNA基因序列分析，將菌株2135鑒定為銅綠假單胞菌 P.aeruginosa。

2.3發酵培養基組分的優化

2.3.1不同碳源發酵液對番茄灰霉菌抑菌率的影響。由圖4可知，發酵液中加入碳源后，番茄灰霉菌菌落直徑均顯著小于基礎LB培養基（ 。其中加入蔗糖后，菌株2135發酵液的抑制效果最好，對番茄灰霉病菌的抑菌率為 9 2 . 5 9 % ，其次為葡萄糖，因此菌株2135最佳發酵培養基碳源為蔗糖。2.3.2不同氮源發酵液對番茄灰霉菌抑菌率的影響。當氮源為LB、硫酸銨、硝酸銨和尿素時，番茄灰霉菌菌落差異不顯著（圖4），因此選擇LB、硫酸銨、硝酸銨和尿素作為氮源均可。

2.3.3不同無機鹽發酵液對番茄灰霉菌抑菌率的影響。當無機鹽為硫酸鎂時，番茄灰霉病菌的菌落直徑小于基礎LB培養基（圖4），因此應選擇硫酸鎂作為最佳無機鹽。

2.4發酵條件的優化

2.4.1接種量對菌株抗菌活性的影響。由圖5可知，當菌株2135的接種量為 10 % 時，番茄灰霉菌的菌落直徑顯著小于其他接種量的菌落直徑（ ），發酵液抑菌率最大，因此，發酵液接種量選擇 10 % 。

2.4.2發酵時間對菌株抗菌活性的影響。發酵培養 時，發酵液對番茄灰霉菌的抑菌率顯著高于其他處理（ ，為 9 2 . 9 4 % （圖5），因此，菌株2135最佳發酵時間為 。

2.4.3搖床轉速對菌株抗菌活性的影響。當搖床轉速為 時，發酵液對番茄灰霉菌的抑菌率顯著高于其他處理（ P lt; 0 . 0 5 ）（圖5），因此，菌株2135最佳搖床轉速為 。

2.4.4初始""對菌株抗菌活性的影響。當初始pH為 5 . 0 ～6.5時，發酵液對番茄灰霉菌的抑菌率顯著高于其他處理

1""（圖5），因此，菌株2135發酵液最佳初始pH為5.0～6.5。

2.4.5溫度對菌株抗菌活性的影響。當培養溫度為 2 6 ～ 時，發酵液對番茄灰霉菌的抑菌率顯著高于其他處理L （圖5），因此，菌株2135最佳發酵液培養溫度為

。

2.5 菌株2135對番茄灰霉病的生防效果

2.5.1菌株發酵液對番茄離體葉片灰霉病的生防效果。接種7d后，對照葉片番茄灰霉病平均病斑直徑為 ，菌株發酵液處理的葉片，菌株發酵液濃度越大，病斑越大（圖6）。發酵液原液防效達 8 4 . 5 0 % ，發酵液2倍稀釋液防效達7 6 . 7 4 % （表2）。

注：不同小寫字母表示差異顯著（ 。

2.5.2菌株發酵液對盆栽番茄灰霉病的生防效果。研究表明，菌株發酵液的稀釋濃度越小，盆栽番茄灰霉病的病情指數越小，防治效果越明顯（圖7）。菌株發酵液原液的防治效果為 7 5 . 5 3 % ， 2 倍稀釋液防效為 7 2 . 7 7 % ， 4 倍稀釋液防效降為 5 7 . 6 8 % ，且與原液和2倍稀釋液差異顯著（ "。

3結論與討論

該試驗從番茄根部周圍的土壤中篩選出1株對番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）具有顯著拮抗效果的細菌2135，并鑒定其為銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）。假單胞菌屬細菌是一類分布廣泛的微生物，近年來，假單胞菌防治病害的報道較多。黃藝爍等[12-14]分別研究了假單胞菌對番茄匍柄霉葉斑病、萵筍鏈格孢葉斑病、草莓炭疽病的防治作用。

該研究中的菌株2135對番茄灰霉病菌抑制效果良好，梁衛驅等[15報道了銅綠假單胞菌對豆角的促生、抗病效果，而鮮有關于銅綠假單胞菌防治番茄灰霉病的研究，因此該生防菌具有一定的開發潛力。

該研究中菌株2135的最適碳源為蔗糖，氮源為蛋白陳，這與魏靖宇等[16]報道的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerugi-nosa）最佳碳氮源一致。而吳翔等[17研究的銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）最適碳氮源為葡萄糖和谷氨酸，潘洪玉等[18]研究的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的最佳碳源為果糖，均與該研究結果不同。

王燕等[19]研究的Pseudomonasextremorientalis 最適pH為7.31，穆曉雅等[20]報道的菊苣假單胞菌（Pseudomonasci-chorii）最佳pH為7，而該研究菌株2135的最適pH為 5 . 0 ～ 6.0，說明酸性環境較適合菌株2135生長，與上述菌株不同。

通過對菌株發酵培養基以及發酵條件進行優化，菌株2135的無菌發酵液對番茄灰霉病菌的抑菌率可達 9 2 . 9 4 % 。無菌發酵液原液對番茄離體葉灰霉病的防效為 8 6 . 0 5 % ，對盆栽番茄灰霉病的防效為 7 5 . 5 3 % 。表明菌株2135抑制番茄灰霉病的效果明顯，具有良好的生物防治菌劑應用潛力。

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