鴿源大腸桿菌的分離鑒定·耐藥性及致病性分析

關鍵詞鴿；大腸桿菌；分離鑒定；耐藥性；致病性中圖分類號S858.39文獻標識碼A文章編號 0517-6611（2025）08-0070-06doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.08.015

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AbstractObetie]TopovidereferencefortheprevetioandcontrolofEscherichcolidiseaseandliicalmedicationinpigeobd ingMethod]oadaldctealttgsitalo tinganddetectionofsistaegensandviulencegensResulteesulssowdtatorofschericcoliwasisolaterote livertissueofdeasedpigeonsonestrainfroteanalswabofdarealpgeonsdoestrainfromtheeadebropigeongaed E coli-SWEclodt drugs.The resistance genes of T E M ， a a c C 2 ， a a c C 4 ， q n r A ， s u l 1 ， s u l 2 ， f l o R ， and tetA could be detected.Three strains of Escherichia coli could kill mice，the virulence genes fyuA and irp2 were detected in E .coli-SW and E.coli-FX，while no virulence genes were detected in E.coli-SP.[Conclusion]Thresolatedasofeccoliveuplegsistaedrtainptogeciyodingfereefore and research of Escherichia coli disease of pigeons in the local area.

Key Words Pigeon；Escherichia coli；Isolation and identification；Drug resistance；Pathogenicity

大腸桿菌（Escherichiacoli）是一種廣泛分布于自然界、人類和動物的革蘭氏陰性人獸共患病原菌，它不僅嚴重危害畜禽養殖業發展，還可以通過污染的蔬菜、飲水、動物源產品及其他食品導致食源性疾病的發生，從而威脅人類健康和公共衛生安全[1-2]；此外，大腸桿菌多重耐藥情況嚴峻，這些耐藥菌株和耐藥基因可以通過環境和食物鏈引起公共衛生安全問題[3-4]。由大腸桿菌導致的禽大腸桿菌病可引起禽類的多系統混合感染，感染肉鴿后可引起精神沉郁、食欲減退和腹瀉等臨床癥狀，通常伴有敗血癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎和腹膜炎等病理變化。此外，它還會導致胚胎死亡，并對乳鴿和童鴿造成更為嚴重的臨床癥狀[5-7]。大腸桿菌還會與其他病原混合感染[7-10]，由此導致疾病的復雜性并增加病鴿的死亡率，給肉鴿養殖業造成巨大的經濟損失。

廣西某肉鴿養殖場出現青年鴿零星發病，駐場技術人員臨床診斷疑為大腸桿菌感染，且死胚鴿蛋有所增加。基于此，該研究確定引起肉鴿死亡的病原菌，并進一步對分離菌株進行耐藥性和致病性分析，以期為肉鴿養殖中大腸桿菌病的防控和臨床用藥提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料。廣西某肉鴿場送檢的病死鴿、腹瀉病鴿和死胚鴿蛋。

1.1.2主要試劑。標準DL2O00DNAMarker，購自寶日醫生物技術（北京）有限公司； 2 × RapidTaqMasterMix，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；LB瓊脂、LB肉湯、麥康凱瓊脂、大腸埃希氏菌干制生化鑒定試劑盒等，購自北京陸橋技術股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；抗菌藥物藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3主要儀器。PCR擴增儀、凝膠電泳成像儀，購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；凝膠電泳儀，購自北京君意東方電泳設備有限公司。

1.1.4試驗動物。昆明小鼠（KM小鼠），體質量 ，購自長沙市天勤生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1病料處理。廣西某肉鴿場送檢的病死鴿4只、腹瀉病鴿1只，死胚鴿蛋若干個。對送檢的病死鴿進行剖檢，無菌采集肝、腎、脾、肺等組織；對腹瀉病鴿采集肛拭子備用；死胚鴿蛋取尿囊液備用。

1.2.2細菌分離。分別將病死鴿肝臟組織樣品、腹瀉鴿肛拭子、死胚尿囊液接種于麥康凱瓊脂，分離純化后對各菌株進行革蘭氏染色，觀察菌體形態。

1.2.3生化鑒定。將分離菌株接種大腸埃希氏菌干制生化鑒定試劑， 培養 后，記錄各生化反應結果。

1.2.4細菌16SrRNA基因擴增和測序。根據細菌基因組提取試劑盒說明書提取各菌株基因組DNA，合成用于擴增細菌16SrRNA的引物（ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- ，R： -GGTTACCTTGTTACGACTT ，擴增片段大小約為

）。以提取的細菌DNA為模板分別擴增16SrRNA基因片段并送至北京擎科生物科技股份有限公司進行測序，測序序列通過在線工具BLAST進行比對分析。

1.2.5藥敏試驗。針對大腸桿菌，采用6類18種抗菌藥物進行藥物敏感性試驗。將細菌菌液分別在LB平板上涂布后，貼上藥敏紙片，置于 恒溫培養箱培養 ，測量抑菌圈直徑，判定細菌對藥物的敏感性。

1.2.6細菌耐藥基因檢測。參考文獻合成相關耐藥基因引物（表1），包括氨基糖苷類耐藥基因aacC2和 內酰胺類耐藥基因TEM和 C T X 、喹諾酮類耐藥基因qnrA和 、四環素類耐藥基因tetA和tetB、磺胺類耐藥基因 sul1和sul2、氯霉素類耐藥基因 。以提取的細菌DNA 為模板進行耐藥基因PCR擴增和電泳檢測。

1.2.7動物致病性試驗。各菌株劃線接種于LB瓊脂，挑取單菌落接種于LB培養基培養 ，分別通過平板計數法進行活菌計數，將各菌液濃度調至 cfu/mL備用。取KM小鼠隨機分為試驗組和對照組，其中試驗組腹腔注射菌液 ，對照組腹腔注射LB肉湯 ，觀察小鼠的發病和死亡情況。

1.2.8細菌毒力基因檢測。參考文獻合成大腸桿菌7種毒力基因引物（表2），包括fyuA和irp2基因（耶爾森菌強毒力島HPI）papA和 papC基因（P菌毛）afa基因（黏附素）[13]ler和eaeA基因（腸細胞脫落位點毒力島LEE）[14]，以提取的細菌DNA為模板進行毒力基因的PCR擴增和電泳檢測。

2 結果與分析

2.1剖檢結果對病死鴿進行剖檢，可見心臟覆有黃色纖維素性滲出物（圖1）。

2.2細菌分離純化將病樣接種麥康凱瓊脂，結果分別從3只病死鴿心、肝組織中分離到3株細菌，從腹瀉鴿肛拭子、死胚尿囊液中各分離出1株優勢細菌，5株細菌在麥康凱瓊脂平板均長出桃紅色菌落（圖2A）。對分離菌株進行革蘭氏染色鏡檢，結果5株細菌均呈長短不一、兩端鈍圓的革蘭陰性桿菌（圖2B）。

2.3生化試驗將5株分離菌株接種大腸埃希氏菌生化鑒定試劑，結果顯示，5株細菌靛基質、MR、VP和西蒙氏檸檬酸鹽項目的反應結果分別為陽性、陽性、陰性、陰性，符合大腸桿菌的生化特性。

2.416SrRNA基因擴增與序列分析擴增細菌16SrRNA基因，結果擴增到約 的特異性條帶（圖3）。測序序列通過GenBank數據庫進行BLAST同源性比對分析，發現從病死鴿心、肝組織分離到的3株細菌16SrRNA基因序列一致，判斷它們在遺傳進化上親緣關系一致，選擇其中1株菌株進行后續研究。從病死鴿肝組織、腹瀉鴿肛拭子、死胚尿囊液分離的細菌之間16SrRNA基因序列同源性為9 8 . 8 7 % ～ 9 9 . 5 8 % ，并分別與GenBank數據庫中多株大腸桿菌如PP157583、CP055251、CP046396同源性為 100 % 、 9 9 . 9 3 % ！100 % 。結合分離菌株的菌落和菌體形態、生化鑒定結果可注：A.麥康凱培養基；B.革蘭氏染色鏡檢（ 1 0 0 0 × 。Note：A.Maconkeyagar；B.Gram stainmicroscopy（ 1 0 0 0 × ）知，從病死鴿、腹瀉鴿、死胚分離的細菌為大腸桿菌，分別命 名為

2.5藥敏試驗用18種常見藥物對3株大腸桿菌進行藥敏試驗，由表3可知，3株大腸桿菌對頭孢他啶、頭孢曲松、阿米卡星敏感，對其他15種藥物均耐藥，表明大腸桿菌存在嚴重的多重耐藥情況。

注：M.DL200ODNAMarker；1.E.coli-SW；2.E.coli-FX；3.E.coli-SP.

2.6耐藥基因檢測對分離的3株大腸桿菌進行耐藥基因檢測，結果表明， 和 檢測到TEM、CTX、aacC2、aacC4、qnrA、sul1、floR、tetA耐藥基因，未檢出qnrB、sul2、tetB耐藥基因（圖4A），而 檢測到TEM、 耐藥基因，未檢測到 qnrB、sul2、tetB耐藥基因（圖4B），表明分離的3株大腸桿菌攜帶較為廣譜的耐藥基因，與藥敏試驗結果相符。

2.7動物致病性試驗分別將3株大腸桿菌接種試驗組小鼠，結果 組小鼠接種后出現精神沉郁、扎堆不動、食欲廢絕、肌肉震顫等癥狀，并于接種 內全部死亡；E.coli-SP組小鼠接種后精神沉郁，接種后 內死亡1只，其余小鼠后期逐漸恢復。

從死亡小鼠的肝臟中能分離到病原菌，其菌落形態及生化鑒定結果與接種菌株一致，表明分離的3株大腸桿菌具有一定的致病性，且E.coli-SW、E.coli-FX致病力強于E.coli-SP。

2.8毒力基因檢測對分離的3株大腸桿菌進行毒力基因檢測，結果表明，E.coli-SW和 檢測到fyuA和irp2毒力基因，而E.coli-SP未檢測到毒力基因（圖5）。

3結論與討論

近年來，隨著政策的扶持和社會資本的投入，肉鴿產業得到了迅速發展。然而，肉鴿規模化養殖的同時也伴隨著疾病的發生。近年來，有關肉鴿大腸桿菌病的報道呈上升趨勢[5-6，15-16]，與其他病原混合感染引起肉鴿發病的報道更是屢見不鮮[7-10]，鴿病的多樣性和復雜性，給肉鴿養殖業造成巨大經濟損失。該試驗從肉鴿場病樣中分離到3株致病菌，通過菌體觀察、生化鑒定和16SrRNA測序分析，確定3株病原菌均為大腸桿菌，分別命名為 SP，3株大腸桿菌之間16SrRNA基因序列同源性為 9 8 . 8 7 % ～9 9 . 5 8 % 。動物致病性試驗證實，3株分離菌株對小白鼠具有一定致病性，應該引起獸醫工作者、養殖企業和養殖戶對大腸桿菌病的重視，如果不加以控制，一旦在鴿群流行并導致疾病的發生，將會給養殖場造成巨大的經濟損失。

毒力因子對大腸桿菌的致病性息息相關，大腸桿菌主要毒力因子有耶爾森菌強毒力島（HPI） 菌毛、腸細胞脫落位點毒力島（LEE）、攝鐵系統、溫度敏感性血凝素（Tsh）、溶血素（hlyF）、侵襲素和空泡毒素[17]。該試驗通過檢測fyuA和irp2基因（耶爾森菌強毒力島HPI）papA和papC基因（P菌毛）ler和eaeA基因（腸細胞脫落位點毒力島LEE）和afa基因（黏附素）7個毒力基因來評估3株大腸桿菌的致病力，結果E.coli-SW和E.coli-FX檢測到fyuA和irp2毒力基因，而E.coli-SP未檢測到毒力基因。動物致病性試驗結果顯示，分離的3株大腸桿菌均具有一定致病性，且 FX致病性強于 ，這可能與E.coli-SW、E.coli-FX攜帶fyuA和irp2毒力基因有關，相關致病機制需要進一步研究。此外，雖然E.coli-SP毒力較弱，但其可能與鴿胚孵化率降低有關，應該引起重視。

目前，畜禽養殖環境中大腸桿菌耐藥情況嚴重[4，18]，鴿是大腸桿菌耐藥菌株的常見攜帶者之一[10，19]。該試驗對分離菌株進行藥敏試驗和耐藥基因檢測，結果表明，3株大腸桿菌對頭孢他啶、頭孢曲松、阿米卡星敏感，對其他15種藥物均耐藥，同時檢測到 β -內酰胺類耐藥基因TEM、氨基糖苷類耐藥基因aacC2和aacC4、喹諾酮類耐藥基因qnrA、磺胺類耐藥基因 s u l 1 、氯霉素類耐藥基因floR、四環素類耐藥基因tetA，表明分離的大腸桿菌存在嚴重的多重耐藥情況，與王洪彬等[14]和沈欣悅等[6報道的鴿源大腸桿菌的多重耐藥結果一致，但楊文儀等[報道的鴿源大腸桿菌對阿莫西林、氧氟沙星和諾氟沙星敏感，對氨芐西林、頭孢呋辛、新霉素等表現為中介，耐藥情況較為良好，這可能與菌株來源有關。此外，分離菌株雖然攜帶氨基糖苷類耐藥基因aaaC2和aaaC4，但對阿米卡星敏感，這可能是由于耐藥基因與耐藥譜之間關系較為復雜，導致二者的結果不能達到一一對應，出現菌株對某類藥物耐藥卻未檢測到相關耐藥基因或檢測到了耐藥基因卻對藥物敏感的現象，也可能與菌株存在其他氨基糖昔類耐藥基因或其他耐藥機制有關[20]；另外，阿米卡星是卡那霉素的半合成衍生物，對氨基糖苷類鈍化酶具有一定穩定性，其耐藥率遠低于其他氨基糖苷類藥物[21]。由此可知，多種原因導致了分離菌株雖然攜帶相關氨基糖苷類耐藥基因卻對阿米卡星敏感的現象。

細菌耐藥與大量抗生素的使用有關，因此在鴿群發生細菌性疾病時，應通過藥敏試驗篩選敏感藥物，該肉鴿養殖場應科學合理地使用頭孢他啶、頭孢曲松等第三代頭孢菌素或者阿米卡星進行防治。使用養殖場分離的病原菌制備的滅活疫苗是一種行之有效的預防措施，對于常見細菌病具有防控作用[22]；積極尋找一些中藥、益生菌、抗菌肽、微量元素、植物提取物以及復合添加劑等抗生素替代品用于鴿群的預防保健[23]，有報道應用乳酸桿菌可以預防由大腸桿菌導致的鴿腹瀉，是一種有效的抗生素替代品[24]；加強生物安全防控和日常管理工作，改善養殖環境，重視鴿病的預防和凈化工作，防止或減少多種病原混合感染的發生，避免造成更大的經濟損失。

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