利用新型含煙葉培養(yǎng)基鑒定津巴布韋煙草葉面優(yōu)勢(shì)微生物群落

關(guān)鍵詞煙草培養(yǎng)基；津巴布韋煙葉；宏基因組；優(yōu)勢(shì)微生物群落

中圖分類號(hào) 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào) 0517-6611（2025）08-0001-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.08.001

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

AbstractIndetetrentifytedominantmrorganssonthelaesofZmbabweantbacctobcoompoentsaoctatios （volume fractions） of 0 % 2 . 5 % 5 . 0 % and 1 0 . 0 % were added to simulate the microbial growth environment on the surface of tobacco leaves ， toscreentheoncetratooftbaccoeavessitableficoialgowthtoexploesiableobacocuemedmpreparatioodiiost analyzetheesipooffbctcatistatedf cificmicrorgansms.Thesultssowedthatorespeificmicrobalcommunitiescouldbeisolatedenthetbaccoleafculturemedimwas adjusted to at concentrations of 2 . 5 % and 5 . 0 % after sterilization.Metagenomic sequencing technology was used to determine the communitydistributionofmicrorgansmsontesufaceof tobaccoleavesin Zimbabwe.ItwasfoundtatBacilusadaighrelativeabundancin the culture medium at concentrations of 0 % ， 2 . 5 % and 5 . 0 % ，and after the addition of tobacco to the culture medium，Terribacillus became the dominant species.The genera with higher relative abundance on tobacco culture medium at concentrations of 2 . 5 % and 5 . 0 % included Piscibaillu，Amplsiohd，sofateof were identified，such as Bacillus species of the genus Bacillus，Bacillus veleis and Bacillus subtilis.

Key wordsTobacco-containing medium； Zimbabwean tobacco；Metagenomics；Dominant microbial community

煙草發(fā)酵是提升煙草品質(zhì)的重要過程，未發(fā)酵的煙葉具有刺激性氣味，而發(fā)酵會(huì)改善煙葉的香氣和口感，利于制成煙草產(chǎn)品[1]。微生物在煙葉發(fā)酵過程中對(duì)于形成獨(dú)特香味具有至關(guān)重要的作用。煙草發(fā)酵過程中的微生物種類較豐富，優(yōu)勢(shì)微生物有細(xì)菌、霉菌和放線菌，細(xì)菌數(shù)量最多，霉菌數(shù)量次之[2-3]。許多研究表明，微生物在煙葉表面的生長(zhǎng)加速了煙葉的發(fā)酵，并關(guān)聯(lián)著發(fā)酵的強(qiáng)度和質(zhì)量[4-6]。此外，不同產(chǎn)地的煙葉往往有不同的香氣，可能也是煙葉微生物種群間的交聯(lián)作用使得煙葉產(chǎn)生特殊增香氣味[7-9]。目前推測(cè)微生物促進(jìn)煙葉發(fā)酵的方式有： ① 微生物通過代謝煙葉中的致香物質(zhì)來改善煙葉香氣； ② 微生物自身合成分泌的酶可發(fā)酵分解煙葉中的大分子物質(zhì)； ③ 微生物的代謝產(chǎn)物激活了煙葉內(nèi)的酶系統(tǒng)，進(jìn)而使煙葉中的物質(zhì)組成發(fā)生變化[10-12]

津巴布韋煙葉是中式卷煙不可或缺的重要原料之一，具有油分足、香氣獨(dú)特飄逸、刺激性小等特點(diǎn)[13-14]。若能分離、鑒定、培養(yǎng)出特殊的增香微生物并將其添加于其他煙葉發(fā)酵過程，可顯著提高其他煙葉的增香效果，提升煙草的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，煙葉表面微生物的培養(yǎng)主要依賴于多種常規(guī)培養(yǎng)基，包括Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基[15]、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基[16-17]、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基[18]、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基[19等，這些培養(yǎng)基雖然能夠提供微生物生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如碳、氮、微量元素、無(wú)機(jī)鹽和水分等，但其營(yíng)養(yǎng)成分和理化性質(zhì)與煙葉表面的實(shí)際環(huán)境存在明顯差異。這種差異可能導(dǎo)致煙葉原始微生物群落的生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而影響微生物分離的特異性和代表性。為更好地模擬煙葉表面的微生態(tài)環(huán)境，研究者開發(fā)了基于煙末浸提液的培養(yǎng)基[10，20-22]，但這種液態(tài)培養(yǎng)方式與煙草實(shí)際生產(chǎn)中的固態(tài)發(fā)酵過程仍存在較大差異，難以完全再現(xiàn)自然狀態(tài)下的微生物生長(zhǎng)環(huán)境。該研究通過在LB固體培養(yǎng)基中加入破碎的煙草勻漿改良培養(yǎng)基配方，比較不同濃度煙草培養(yǎng)基及煙草培養(yǎng)基配制流程對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，更好地模擬煙草表面微生物生長(zhǎng)環(huán)境，分離獲得更為接近煙葉自然狀態(tài)中存在的微生物組分。此外，該試驗(yàn)還利用宏基因組測(cè)序技術(shù)，分析添加煙葉成分的培養(yǎng)基與未添加煙葉成分的培養(yǎng)基在微生物群落結(jié)構(gòu)上的差異，并通過分離鑒定獲得了優(yōu)勢(shì)菌株，為進(jìn)一步的增香種鑒定和增香物質(zhì)篩選提供數(shù)據(jù)支撐和材料。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試材。供試煙草品種為2019年的陳化津巴布韋煙葉#60L10，由廣東中煙工業(yè)有限公司提供

1.1.2主要試劑。胰蛋白肺（賽默飛，LP0042）；酵母提取物（賽默飛， ）；瓊脂粉（生工生物，A505255）；氯化鈉（生工生物，A501218）；十二烷基硫酸鈉（生工生物，A500228）。1.1.3主要儀器。Westinghouse西屋牌破壁料理機(jī)（WFB-A617）；恒溫培養(yǎng)箱（力辰科技公司，LICHENHHSH-L800）；恒溫?fù)u床（艾本德，AGI26）；PCR儀（賽默飛，LIFETechnolo-giesVeritiFast96）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1不同比例煙葉培養(yǎng)基的制備。除去陳化煙葉的莖脈組織，稱取相應(yīng)質(zhì)量的煙葉，加入對(duì)應(yīng)體積的蒸餾水，用破壁機(jī)均勻破碎，按比例加入LB固體培養(yǎng)基其他成分，混勻后進(jìn)行滅菌，滅菌前或者滅菌后調(diào)節(jié) 至7.0左右，搖勻，倒置平板。

1.2.2煙葉表面微生物的洗脫及培養(yǎng)。稱取 煙葉，用滅菌剪刀將其剪碎之后，置于 無(wú)菌蒸餾水中，加入0 . 1 % （即 ）的十二烷基硫酸鈉（SDS）均勻混合，于 的搖床中搖勻 ，得到菌原液[20]。采用平板涂布法進(jìn)行涂板，取菌原液 ，分3次（30、30、 ）均勻涂布，將培養(yǎng)皿置于 培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 統(tǒng)計(jì)各組的細(xì)菌菌落數(shù)量及種類。

1.2.3微生物基因組DNA的提取及宏基因組測(cè)序。收集培養(yǎng) 的各組菌落平板各9個(gè)，其中每3個(gè)平板富集的菌落為一個(gè)重復(fù)，每組各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。微生物基因組提取、PCR擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，簡(jiǎn)要過程如下：稱取 菌粉，用E.Z.N. Mag-BindSoilDNAKit提取試劑盒（OMEGA）進(jìn)行DNA提取，檢測(cè)DNA的濃度并進(jìn)行電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。進(jìn)一步利用Hieff NGS @MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumi-na試劑盒構(gòu)建二代測(cè)序文庫(kù)，并在華大DNBSEQ-T7平臺(tái)上完成測(cè)序分析。

1.2.4宏基因組數(shù)據(jù)分析。宏基因組數(shù)據(jù)分析由生工生物工程（上海）股份有限公司負(fù)責(zé)。使用 vegan進(jìn)行基因組多樣性分析。使用DIAMOND將基因集蛋白序列與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白同源性比對(duì)，得到功能注釋和同源物種信息，篩選條件為 。同時(shí)根據(jù)NCBI的微生物分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得基因的物種分類注釋信息，并在界（Kingdom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Fami-ly）、屬（Genus）、種（Species）各個(gè)分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)物種的相對(duì)豐度。使用DIAMOND將基因集蛋白序列與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到序列對(duì)應(yīng)的KEGGORTHOLOGY（KO）號(hào)，根據(jù)KO與Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)和Module數(shù)據(jù)庫(kù)的聯(lián)系得到序列的注釋信息。

1.2.5煙葉表面微生物的分離純化。挑取煙草培養(yǎng)基平板上具有不同形態(tài)特征（如菌落大小、顏色、邊緣清晰度、菌落是否黏稠等）的單菌落進(jìn)行平板劃線并培養(yǎng) ，觀察單菌落大小。

1.2.616SrDNA測(cè)序鑒定菌株。挑取針尖大小的單菌落于PCR 管中，加入 裂解液，利用PCR儀進(jìn)行裂解，程序?yàn)? 。裂解完成后，進(jìn)行16SrRNA片段的PCR擴(kuò)增，引物為16S-27F（ - AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG - ）和16S-1492R（ -TACGGCTACCTTGT-TACGACTT- ）。PCR反應(yīng)體系： T a q 酶（ ） 上下游引物（ 各 （ 模板（ ） 、 （ ）） ，單一條帶的PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.2.7菌株的序列分析與保種。對(duì)分離得到菌株的測(cè)序結(jié)果與NCBI Basic Local Alignment Search Tool數(shù)據(jù)庫(kù)中的16SrDNA基因信息進(jìn)行比對(duì)，確定其物種種類。對(duì)鑒定后的菌株進(jìn)行保種，選取各菌株加至 LB培養(yǎng)液中，在 搖床中培養(yǎng) 左右，將菌種置于甘油管中，于 冰箱中保存。

1.3數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel和GraphPad Prism軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包括不同濃度煙草培養(yǎng)基的菌落生長(zhǎng)狀況的對(duì)比、不同 調(diào)節(jié)情況下培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)狀況的對(duì)比、不同濃度煙草培養(yǎng)基的菌種富集情況對(duì)比。繪圖采用GraphPadPrism軟件以及Chiplot在線繪圖工具（https：//www.chiplot.online/）。

2 結(jié)果與分析

2.1不同濃度煙草培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果為評(píng)估不同濃度煙草培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，該研究通過菌落計(jì)數(shù)法對(duì)培養(yǎng)基表面微生物的生長(zhǎng)情況進(jìn)行定量分析。每個(gè)濃度的平板在滅菌后調(diào)pH至7.0左右，然后涂布等體積的煙葉菌原液，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng) 。結(jié)果顯示（圖1和表1），對(duì)照組培養(yǎng)基（ 0 % 煙草培養(yǎng)基）的菌落數(shù)量最高，達(dá)到 。隨著培養(yǎng)基中煙葉成分的增加，菌落數(shù)量明顯下降， 2 . 5 % 煙草培養(yǎng)基的菌落數(shù)量為50CFU， 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基的菌落數(shù)量進(jìn)一步減少至 。而當(dāng)煙草培養(yǎng)基濃度達(dá)到 1 0 . 0 % 時(shí)，培養(yǎng)基表面未觀察到無(wú)肉眼可見的菌落形成。這一現(xiàn)象可能歸因于以下2個(gè)因素： ① 高濃度煙草成分可能對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用； ② 隨著煙草添加量的增加，煙葉破碎程度不足導(dǎo)致培養(yǎng)基表面形貌粗糙化，影響菌液的均勻涂布。基于上述試驗(yàn)結(jié)果， 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基在保持良好表面形貌（有利于菌液均勻涂布）和適宜菌落數(shù)量（便于觀察和統(tǒng)計(jì)）方面表現(xiàn)出最佳平衡，因此被選定為后續(xù)試驗(yàn)的培養(yǎng)條件。

2.2培養(yǎng)基滅菌前后調(diào)節(jié) 對(duì)煙草培養(yǎng)基培養(yǎng)效果的影響在培養(yǎng)基優(yōu)化過程中，該研究考察了 調(diào)節(jié)時(shí)機(jī)（滅菌前或滅菌后）對(duì)培養(yǎng)效果的影響。為控制試驗(yàn)變量，采用0 % 煙草培養(yǎng)基作為對(duì)照，并在調(diào)節(jié)煙草培養(yǎng)基 的同時(shí)向培養(yǎng)基中加入等體積無(wú)菌水以排除操作干擾。培養(yǎng) 后，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示（圖2），在 0 % 煙草培養(yǎng)基中，滅菌前調(diào)節(jié) 組和滅菌后調(diào)節(jié) 組的菌落數(shù)量分別為99和105CFU，兩組間無(wú)顯著差異（ ）。但在含煙草成分的培養(yǎng)基中觀察到顯著差異， 2 . 5 % 煙草培養(yǎng)基滅菌前和滅菌后調(diào)節(jié)pH組的菌落數(shù)量分別為 $3 3 . 4 6 ～ ＼mathrm { C F U } ； 5 . 0 ＼%$ 煙草培養(yǎng)基中，滅菌前和滅菌后調(diào)節(jié) 組的菌落數(shù)量分別為25和36CFU。統(tǒng)計(jì)分析表明， 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基中，滅菌前后調(diào)節(jié) 對(duì)菌落數(shù)量的影響均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（ ）。上述結(jié)果表明，滅菌后調(diào)節(jié) 至7.0更有利于煙草表面微生物的生長(zhǎng)繁殖，可獲得更優(yōu)的培養(yǎng)效果。基于此，后續(xù)試驗(yàn)均采用滅菌后調(diào)節(jié) 至7.0的培養(yǎng)條件。

Fig.1Growth statusand morphologyof bacterial colonies onthesurface of diferentconcentration tobacco culture media

注： 0

2.3煙草表面微生物在屬和種水平上的豐度分析為整合各組重復(fù)間的所有菌落基因信息，將3次重復(fù)的測(cè)序結(jié)果整合，總共分為3組 （ 0 % ， 2 . 5 % ， 5 . 0 % ）。對(duì)測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，過濾后數(shù)據(jù)占樣本所有數(shù)據(jù)比例超過 9 9 % ，堿基質(zhì)量在Q20以上的比例超過 9 8 % ，堿基質(zhì)量在Q30以上的比例超過 94 % ，說明數(shù)據(jù)可靠，可用于后續(xù)分析。總體來看，3種培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的微生物基本為細(xì)菌，真菌的豐度很低，基本可以忽略不計(jì)，因此推測(cè)增香種大概率為細(xì)菌。該研究選取屬水平和種水平對(duì)不同濃度煙草培養(yǎng)基表面細(xì)菌微生物進(jìn)行分析。

圖3A展示了基于屬水平分類的各組培養(yǎng)基微生物群落相對(duì)豐度分布。通過比較3種不同濃度煙草培養(yǎng)基的微生物組成，可以觀察到明顯的群落結(jié)構(gòu)差異。從整體群落組成來看，芽孢桿菌屬（Bacilus）在3種煙草培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出最高的相對(duì)豐度，表明該屬微生物對(duì)培養(yǎng)基環(huán)境具有廣泛的適應(yīng)性。值得注意的是，對(duì)照組（ 0 % 煙草培養(yǎng)基）中相對(duì)豐度次高的類群為普里斯特氏菌屬（Priestia），而在 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基組中，土地芽孢桿菌屬（Terribacillus）取代普里斯特氏菌屬成為第二優(yōu)勢(shì)菌群。不同培養(yǎng)基上相對(duì)豐度第二高的屬的差異也說明煙草培養(yǎng)基具有較好的篩選作用，在一定程度上抑制了普里斯特氏菌屬菌種的生長(zhǎng)，更利于土地芽孢桿菌屬菌種的繁殖，因此土地芽孢桿菌屬中極大可能包含著增香種。而芽孢桿菌屬作為相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌群，即使添加了煙草成分依舊不會(huì)影響其生長(zhǎng)，其中必然存在著與煙草發(fā)酵密切相關(guān)的菌種，因此也可能從中找到增香種

圖3B是以種為分類單位展示了3種煙草培養(yǎng)基上各微生物的相對(duì)豐度。其中，沙福芽孢桿菌（Bacillussafensis）在0 % 煙草培養(yǎng)基中相對(duì)豐度最高，但隨著煙草成分的增加，其相對(duì)豐度不斷下降，在 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基中相對(duì)豐度已很少，說明煙草成分的加入反而使其生長(zhǎng)受到抑制。在培養(yǎng)基中添加煙草成分后相對(duì)豐度下降的菌種還有巨大普里斯特氏菌（Priestiamegaterium）短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）。未分類的芽孢桿菌（unclassifiedBacillusspecies）在各個(gè)培養(yǎng)基中的相對(duì)豐度則基本相同，說明煙草成分的加入不會(huì)影響它的生長(zhǎng)。而枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamylolique-faciens）和嗜鹽土地芽孢桿菌（Terribacillushalophilus）在煙草培養(yǎng)基上的相對(duì)豐度有明顯提升，說明它們更適應(yīng)煙草培養(yǎng)基環(huán)境。

除此之外，在 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基中，毛竹林土地芽孢桿菌（Terribacillusgoriensis）嗜糖土地芽孢桿菌（Terribacil-lussaccharophilus）、特基拉芽孢桿菌（Bacillustequilensis）、

7520-G土地芽孢桿菌（Terribacillussp.7520-G）得到了富集，相對(duì)豐度都有一定的上升，也是潛在的可培育優(yōu)勢(shì)種，其中可能也包含著使津巴布韋煙葉具有特殊香氣的增香種。

2.4煙草培養(yǎng)基特有微生物在屬和種水平上的數(shù)量分析通過宏基因組測(cè)序可探究煙草表面微生物的群落分布特征，發(fā)現(xiàn)并鑒定出其中相對(duì)豐度較高的微生物種類，并且可通過橫向比較不同濃度煙草培養(yǎng)基上微生物的群落分布狀況和優(yōu)勢(shì)種差異，為增香種的分離純化提供理論依據(jù)。如表2所示，宏基因組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分微生物種屬只存在于2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基，說明煙草培養(yǎng)基篩選培育出了部分不能在LB固體培養(yǎng)基上生存的津巴布韋煙葉表面微生物。其中在 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基上相對(duì)豐度較高的屬有魚芽孢桿菌屬（Piscibacillus）雙芽孢桿菌屬（Amphibacillus）、Margalitia等。并且 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基分別存在特有的微生物種屬。相比 2 . 5 % 煙草培養(yǎng)基， 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基特有的菌種更多。 2 . 5 % 煙草培養(yǎng)基中特有的微生物在屬水平上的個(gè)數(shù)為4個(gè)，而 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基特有菌種在屬水平上的個(gè)數(shù)可達(dá)44個(gè)（圖4）。但這些煙草培養(yǎng)基中特有菌種的相對(duì)豐度往往較低， 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基是否具有更高的群落多樣性仍需要更進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。

進(jìn)一步對(duì) 2 . 5 % 煙草培養(yǎng)基（ 2 . 5 % 組和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基（ 5 . 0 % 組）特有與對(duì)照組（ 0 % 煙草培養(yǎng)基）的菌種進(jìn)行分析。如表2所示， 2 . 5 % 組和 5 . 0 % 組共同特有的菌種包括Ba-cillaceae bacterium SAS-127 、Cohnella abietis、Oceanobacillus sp.Castelsardo等共57種。 2 . 5 % 組中特有的菌種有某種未分類的嗜鹽芽孢桿菌（unclassified Halobacillus species）泛酸枝芽胞桿菌（Virgibacilluspantothenticus）Alkalihalobacillusalcalo-philus等共33種。 5 . 0 % 組中特有的相對(duì)豐度較高的菌種有PenicilliumbrasilianumPenicilliumsubrubescensPenicilliumde-cumbens等共231種。因此，種水平上的結(jié)果與屬水平上的相似，同樣是 5 . 0 % 組存在更多特有菌種。但各組獨(dú)有的種相對(duì)豐度依舊不高，在 0 . 1 % 左右。

Fig.4Venn diagram of species number on diferent concentration tobaco media at genus （A）and species （B）levels

2.5煙草表面相對(duì)豐度較高微生物的分離鑒定通過宏基 因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，部分菌種在添加了煙葉成分的煙草培養(yǎng)

基中有更好的生長(zhǎng)狀況，而這些被煙草培養(yǎng)基成功富集的菌種也可能是潛在的增香種。盡管不是每種被富集的菌種都可以被培養(yǎng)，但是相對(duì)豐度高的富集菌種中也大概率存在增香種。為了進(jìn)一步鑒定具體的菌落種屬，從煙草培養(yǎng)基中挑取并分離純化出單菌落，再對(duì)單菌落進(jìn)行16SrDNA序列擴(kuò)增和測(cè)序分析。

表3顯示的是目前已分離純化并且鑒定出的菌種，一共有15種。其中包括了多種在3種培養(yǎng)基中都有較高相對(duì)豐度的菌種，如芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等。同時(shí)，也鑒定出了部分在煙草培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好、相對(duì)豐度較 0 % 組有所增加的細(xì)菌，如解淀粉芽孢桿菌和嗜鹽土地芽孢桿菌。而土地芽孢桿菌屬在煙草培養(yǎng)基上微生物群落中的相對(duì)豐度有明顯上升，也成功挑取鑒定出了4種土地芽孢桿菌屬的菌種。

3討論

上述研究表明，培養(yǎng)基中煙草成分的添加量在 2 . 5 % 和5 . 0 % 會(huì)有較好的培養(yǎng)效果，而添加量達(dá)到 1 0 . 0 % 時(shí)，在表面無(wú)法形成菌落；其原因可能是添加煙草成分會(huì)降低培養(yǎng)基pH（煙草的 普遍在 ，普通的LB 固體培養(yǎng)基 為7.0左右），最終導(dǎo)致 過低而不適宜微生物生長(zhǎng)。在滅菌后將培養(yǎng)基的 統(tǒng)一調(diào)至 7 . 0 ， 1 0 . 0 % 煙草培養(yǎng)基可能也會(huì)因煙葉破碎釋放出的有毒物質(zhì)濃度過高，從而抑制微生物的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出很不理想的菌落生長(zhǎng)效果。此外， 1 0 . 0 % 煙草培養(yǎng)基因加入煙草量過多，不能很好地將煙葉破壁成細(xì)小的顆粒，導(dǎo)致培養(yǎng)基表面凹凸不平，不利于菌液的涂布和菌落的生長(zhǎng)。總而言之，培養(yǎng)基中煙葉添加量在 2 . 5 % 和 5 . 0 % 是有較好的培養(yǎng)效果，但煙草濃度為 5 % ～ 1 0 % 的煙草培養(yǎng)基是否能培育出具有更高的多樣性群落還需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。對(duì)于培養(yǎng)基配制過程中因 調(diào)節(jié)操作在滅菌前還是滅菌后的順序產(chǎn)生的培養(yǎng)效果差異，可能是煙葉中的某些成分在高壓蒸汽滅菌過程中發(fā)生了反應(yīng)變化，導(dǎo)致原本調(diào)節(jié)至 的培養(yǎng)基pH又產(chǎn)生了變化，使得培養(yǎng)效果下降；另一種可能是預(yù)先將pH調(diào)至7.0，可能為煙草中某些成分的反應(yīng)提供了條件，在高溫作用下發(fā)生反應(yīng)，使得部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，最終的煙草培養(yǎng)基成分發(fā)生改變。而具體的原因需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證明。

宏基因組測(cè)序分析結(jié)果顯示，在3種不同濃度煙草培養(yǎng)基中，芽孢桿菌屬（Bacillus）均為相對(duì)豐度最高的菌屬，這一發(fā)現(xiàn)與韓錦峰等[3和邱立友等[2的研究結(jié)果一致。然而，在次優(yōu)勢(shì)菌屬方面，該研究結(jié)果與先前研究存在差異，在該研究中， 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基的次優(yōu)勢(shì)菌屬為土地芽孢桿菌屬（Terribacillus）， 0 % 煙草培養(yǎng)基的次優(yōu)勢(shì)菌屬為普里斯特氏菌屬（Priestia）；相比之下，韓錦峰等[3]和邱立友等[24]的研究中次優(yōu)勢(shì)菌屬為梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）或芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）。這種差異可能源于研究所用煙葉品種的不同，韓錦峰等使用的是河南省的NC89品種煙葉，邱立友使用的是來自不同產(chǎn)地的紅大、NC89和 也有研究表明，不同品種煙葉的表面微生物群落組成存在顯著差異[20，25]，這可能是導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的主要原因。上述結(jié)果均證明，使用津巴布韋煙草培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)于篩選煙葉表面特有微生物是可行的。此外，新型煙草培養(yǎng)基能夠篩選出某些在LB固體培養(yǎng)基上無(wú)法生存的菌種，但其相對(duì)豐度均不高。其中可能的原因有： ① 那些被篩選出的菌種在煙葉表面的含量較少，在煙葉發(fā)酵過程中作用較為有限；② 煙草培養(yǎng)基中煙葉成分的配比仍不夠理想，使得某些菌株在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢。值得注意的是， 5 . 0 % 組中前3個(gè)相對(duì)豐度較高的菌種皆為青霉菌屬的真菌，而不是細(xì)菌，且在界水平上 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基上生長(zhǎng)有古菌，表現(xiàn)出 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基上微生物種類的廣度，其中涵蓋的微生物種類較大。

該試驗(yàn)還對(duì)部分煙草表面微生物進(jìn)行了分離純化和鑒定操作，最終鑒定得到15種菌株。其中涵蓋了大部分的優(yōu)勢(shì)種和煙草培養(yǎng)基中的富集種，也可能包含煙草增香種。參考殷爽等[20的研究結(jié)果，該試驗(yàn)也分離得到了枯草芽孢桿菌，但大多數(shù)分離得到的菌種都不太相同，可能是因?yàn)闊熑~種類不同。雖然趙銘欽[\"]的研究結(jié)果中分離得到不少芽孢桿菌屬的菌種，但與該試驗(yàn)的分離結(jié)果相同的菌種也只有枯草芽孢桿菌。而使用同種津巴布韋煙葉且對(duì)煙葉表面微生物種進(jìn)行分離和鑒定的研究仍較少，因此無(wú)法參考比較。此外該試驗(yàn)篩選分離操作是在煙草培養(yǎng)基上進(jìn)行的，也會(huì)對(duì)菌種分離鑒定結(jié)果造成一定影響。試驗(yàn)結(jié)果中分離得到的菌種后續(xù)可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證其在煙葉物質(zhì)轉(zhuǎn)變中的作用，后續(xù)也應(yīng)分離出更多種類的煙葉表面微生物，并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵檢測(cè)嘗試找出增香種。總之，該研究結(jié)合宏基因組測(cè)序和微生物分離得到的不同組別的菌群分布差異和優(yōu)勢(shì)菌種可為后續(xù)煙草增香種的分離純化試驗(yàn)提供有力的數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

4結(jié)論

在LB固體培養(yǎng)基中添加濃度為 2 . 5 % 和 5 . 0 % 的煙草成分具有較好的微生物培養(yǎng)效果，在擁有良好的表面形貌的同時(shí)，有較好的菌落生長(zhǎng)狀況。將調(diào)節(jié) 步驟放至滅菌操作后制成的煙草培養(yǎng)基，比滅菌操作前調(diào)節(jié) 制成的煙草培養(yǎng)基有更好的培養(yǎng)效果。宏基因組測(cè)序結(jié)果也說明津巴布韋煙葉表面的微生物主要是細(xì)菌，優(yōu)勢(shì)屬為芽孢桿菌屬。此外，土地芽孢桿菌屬在煙草培養(yǎng)基上得到了富集。非煙草培養(yǎng)基和煙草培養(yǎng)基上菌群種類的差異說明煙草培養(yǎng)基具有一定的篩選作用，能篩選出部分LB固體培養(yǎng)基無(wú)法培養(yǎng)的菌種。進(jìn)一步通過單菌落分離純化和16SrDNA測(cè)序，鑒定出15種煙葉表面優(yōu)勢(shì)微生物，如芽孢桿菌屬的芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等。

參考文獻(xiàn)

[1]ZHAO MQ，WANGBX，LIFX，etal.Analysisof bacterial communitieson aging flue-cured tobacco leaves by 16S rDNA PCR-DGGE technology[J].Applied microbiology and biotechnology，2007，73（6）：1435-1440.

[2]舒明，樊虎，楊洋，等.廢煙葉提取液源尼古丁降解菌分離鑒定和特性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2017，44（5）：1028-1037.

[3］韓錦峰，朱大恒，劉衛(wèi)群，等.陳化發(fā)酵期間烤煙葉面微生物活性及其應(yīng)用研究[J].中國(guó)煙草科學(xué)，1997，18（4）：13-14.

[4］楊金奎，段焰青，陳春梅，等.醇化煙葉表面可培養(yǎng)微生物的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析[J].煙草科技，2008（11）：51-55.

[5]黃靜文，段焰青，者為，等.短小芽孢桿菌改善煙葉品質(zhì)的研究[J].煙草科技，2010（8）：61-64.

[6]REIDJJ，MCKINSTRYDW，HALEYDE.The fermentation of cigar-leaftobacco[J].Science，1937，86（2235） ：404.

[7]于會(huì)喜，王毅，馬永凱，等.發(fā)酵煙葉表面微生物的多樣性及其應(yīng)用現(xiàn)狀[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13（10）：59-60，70.

[8］周瑾，李雪梅，許傳坤，等.利用微生物發(fā)酵改良烤煙碎片品質(zhì)的研究[J].煙草科技，2002（6） ：3-5.

[9]賈蓓蕾，魏濤，黃申，等.α-胡蘿卜素降解產(chǎn)香菌株的分離、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（1）：34-39.

[10］趙銘欽.烤煙陳化的生理生化機(jī)制與葉面優(yōu)勢(shì)微生物的分離篩選及增香效應(yīng)[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[11]王穎，馬玲玲，呂欣，等.單一和復(fù)配微生物固態(tài)發(fā)酵對(duì)卷煙葉組主要化學(xué)成分的影響[J].煙草科技，2015，48（11）：47-52.

[12]于會(huì)喜，王毅，馬永凱，等.發(fā)酵煙葉表面微生物的多樣性及其應(yīng)用現(xiàn)狀[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13（10）：59-60，70.

[13]張相輝，關(guān)體青，陶冶，等.津巴布韋煙葉游離態(tài)和結(jié)合態(tài)特征香氣成分的識(shí)別與分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2021，34（1）：45-51.

[14]吳麒昊，姚力文，普仕林，等.HS-SPME-GC-MS分析津巴布韋煙草提取物主要揮發(fā)性香氣成分[J].香料香精化妝品，2023（3）：57-65.

[15]李洪林，萬(wàn)秀清，顏培強(qiáng)，等.熒光假單胞桿菌G20-9拮抗煙草赤星病菌研究[J].煙草科技，2008（4）：56-59.

[16]張振遠(yuǎn)，滕環(huán)瑜，潘影，等.不同濃度吐溫-80對(duì)煙草葉面微生物洗脫效果的影響[J].煙草科技，2023，56（12）：7-13.

[17］吳光麗，孫瑋宏，董高峰，等.云南復(fù)烤煙葉不同地點(diǎn)醇化過程中可培養(yǎng)真菌種群分析[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2018，39（3）：66-72.

[18］陳小敏，林影，梁書利.煙葉表面微生物群落結(jié)構(gòu)鑒定及其產(chǎn)酶分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016，35（7）：1760-1766.

[19]馮印印，李斌，楊洋，等.煙草青枯病菌拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定和抑菌機(jī)制研究[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2021，37（2）：331-339.

[20]殷爽，孫萬(wàn)萬(wàn)，王毅，等.陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系的高效分離及增殖技術(shù)研究[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2020，41（2）：59-65.

[21]邱立友，趙銘欽，岳雪梅，等.自然發(fā)酵烤煙葉面微生物區(qū)系的分離鑒定[J].煙草科技，2000，33（3）：14-17.

[22]陳澤斌，夏振遠(yuǎn)，雷麗萍，等.煙草內(nèi)生細(xì)菌種群特征分析[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2014，20（3）：102-107.

[23]BRUNNEMANNKD，HOFFMANND.ThepH of tobacco smoke[J].Foodand cosmetics toxicology，1974，12（1） ：115-124.

[24]邱立友，趙銘欽，岳雪梅，等.烤煙發(fā)酵高效菌株的篩選[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，34（3）：232-235.

[25]周家喜，喻理飛，張健，等.煙葉陳化過程細(xì)菌群落演替特征[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2018，38（21） ：7739-7748.