SOD分離純化實驗關鍵影響因素探究

摘"要：SOD分離純化實驗是生物工程下游技術的重要設計性實驗，目的在于培養生物工程專業學生構建實驗思路的能力。其中各種實驗因素的變化會造成分離純化效果的不同，為深入探究分離純化效果與實驗因素的關系，根據其工藝步驟選擇存在影響可能性的單因素作為實驗變量進行探究，發現材料培養時間、硫酸銨飽和度、透析溫度、濃縮溫度、層析洗脫速度等均可明顯影響純化的兩個關鍵指標（P＜0.05），可確定為能夠明顯影響實驗結果的關鍵變量。預期根據實驗關鍵條件變化所引起的結果變化的可能原因及機制，對進一步優化SOD分離純化條件提出新的方案。

關鍵詞：分離純化；設計性實驗；關鍵變量；SOD

中圖分類號：Q332

高校實驗教學體系將實驗類型分為示范性實驗、綜合性實驗和設計性實驗三種［13］。其中，設計性實驗是學生在教師的引導下，根據實驗目的設計實驗技術路線和與支撐實驗技術路線的相關聯的具體實驗，目的是培養學生圍繞實現研究目標構建實驗思路的能力，通過設計多因素多水平實驗方法，并在實驗完成后進行數據分析，以確定實驗目標是否實現、實驗方案是否合理、工藝是否優化等［46］。其教學基本思路是：確定實驗目的，通過理論分析或前期實驗找出影響實驗目的實現的主要變量，從單因素變量水平進而組合多因素不同水平上，研究不同變量及其組合變化對研究結果的影響，通過對實驗結果的分析確定關鍵變量及各變量的優化組合［79］。

活性蛋白的分離純化作為生物工程下游技術的核心內容，分離純化的效果與多種實驗因素密切相關，探究活性蛋白分離純化效果與各種實驗因素變化的關系是設計性實驗的經典內容［1011］。超氧化物歧化酶（SOD）在生物體內的主要作用是通過清除超氧陰離子自由基從而實現抗氧化，廣泛應用于保健食品、化妝品以及藥物的開發，具有非常重要的應用價值。SOD的分離純化工藝一般包括：材料破碎、固液分離、分步沉淀、除鹽濃縮、層析純化等技術環節，其中材料狀態、緩沖液種類、固液分離工藝、分步沉淀條件、除鹽濃縮方法、層析填料、層板流動相、洗脫方式等均能夠顯著影響分離純化的效果［1214］。

通過設計這些變量及其在不同水平上的組合條件，研究不同組合條件下分離純化效果；通過對比分析明確影響SOD分離純化效果的相關因素，并確定關鍵變量及最佳分離純化工藝是SOD分離純化工藝研究的基本目標［1213］。因此，本文通過分組實驗確定關鍵變量，并對關鍵變量的不同水平范圍做出了合理的界定，也通過前期講解促進教學過程中學生對于工藝流程和實驗目的的理解。

1"SOD分離純化實驗設計

1.1"實驗材料

新鮮綠豆種子清洗干凈，用蒸餾水浸泡24h，以胚根剛剛突破種皮的綠豆為實驗材料。

1.2"SOD粗分離實驗基本過程

（1）材料破碎及固液分離：每組稱取30g綠豆材料，洗滌，蒸餾水浸泡過夜，倒去浸泡的水，加入300mL蒸餾水液，家用勻漿機勻漿，二層紗布過濾勻漿，得過濾，濾液在3000rpm、4℃條件下離心10min，得上清液。取少量清液進行SOD活性及蛋白質含量測量，計算材料中SOD總活性單位及比活性單位（U/mg"Pr）。

（2）硫酸銨分級分離：由（1）所得清液測量其總體積，緩慢加入硫酸銨至35%飽和度（比例為19.4g/100mL），5℃靜置1h至沉淀分層明顯，離心，去沉淀，得清液。測量所得清液體積，緩慢加入硫酸銨至65%飽和度（比例為18.4g/100mL），加入硫酸銨過程充分攪拌，5℃靜置1h至分層澄清，離心除去清液，得沉淀，進行透析除鹽。

（3）透析除鹽：透析袋預處理，用含10g/L"Na2CO3和1mmol/L"EDTA的溶液煮沸30min，蒸餾水洗滌并浸泡于5℃蒸餾水中備用。由（2）所得沉淀裝入透析袋，放置蒸餾水中透析24"h，每隔8h更換一次蒸餾水。

（4）樣品濃縮：透析后溶液用濾紙過濾（或離心）得清液，重新裝入透析袋中用PEG6000包埋進行濃縮。

1.3"SOD精制分離實驗基本過程

本實驗精制分離采用凝膠過濾層析法［12，1516］，選擇葡聚糖凝膠Sephadex"G75進行層析分離。其原理是利用凝膠的網狀結構根據分子大小進行分離的一種方法，含有大小不同分子的樣品進入層析柱后，較大的分子不能通過孔道擴散進入凝膠珠體內部，較小的分子可以通過部分孔道，更小的分子可通過任意孔道擴散進入珠體內部，從而使得小分子移動最慢，中等分子次之，不同數量級別的分子按先后順序流出層析柱，從而達到分離的目的。基本操作過程如下。

（1）葡聚糖的預處理。水中膨化：每組稱量5g"Sephadex"G75凝膠，放入100℃水浴中3h，浸泡過程中輕柔攪拌，并傾去懸浮小顆粒，水浴后常溫放置。膨化處理后，通過抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。

（2）裝柱。先向柱內加滿洗脫劑，檢查是否漏水；再打開出液口，排出里面的氣泡，特別是要排出床底支持物上的氣泡。關閉出液口，使柱中洗脫劑的體積約占總柱體積的15%。調節有利于裝柱的凝膠漿稀稠度，適當稀釋。將一根直徑稍小的玻璃棒插入層析柱底部，沿玻璃棒將膠漿徐徐注入柱內，一次性裝完，流動相以1mL/min的流速進行柱的平衡處理，洗脫體積達到柱床體積2倍時平衡完成。

（3）加樣。樣品濃縮液過濾后得清液加樣，加樣體積約為凝膠柱床體積的1%～5%（V/V），加樣應加于柱表面中心，避免沿柱壁加入。

（4）洗脫。流動相為pH值為7.0，0.02mol/L磷酸緩沖液，采用1ml/min恒梯度洗脫，以每份2mL收集組分，收集液總體積為柱床總體積的1.2倍。

1.4"分離效果測量指標及表示方法

SOD分離純化效果的關鍵評價指標是活性得率及純化倍數，兩個指標的表示方式及SOD活性的測量方法如以下方面。

（1）SOD的活性得率：（本實驗步驟完成后產品總活力/本實驗步驟完成前材料總活力）×100%，表示為%。

（2）SOD純化倍數：完成本實驗步驟后產品SOD活力/該產品蛋白含量，表示為U/mg"Pr。

1.5"SOD活力測量方法［9］

25℃條件下，試管中加入3mL"50mmol/L、pH值為830的TricHCL緩沖液，加入一定量50mmol/L連苯三酚使自氧化速率的變化（325nm吸光值變化，ΔA）控制在007/min左右（具體加入量應每次測量前校正）。加入酶液后再測連苯三酚自氧化速率的變化（ΔA′），酶量的加入控制在使加樣后的ΔA′在0.035/min左右。加入酶提取液后如果在一分鐘時間內能抑制連苯三酚自氧化速率的一半，此時所加的酶量就為一個SOD的酶活性單位（unit，U）。

SOD酶活力（U）＝2×（ΔA-ΔA′）/ΔA。

2"SOD分離純化實驗關鍵變量分析

根據以上設計的分離純化實驗，選擇可能影響分離純化效果的實驗因素作為單因素變量，通過對單因素實驗的結果進行方差分析，以確定能夠明顯影響實驗結果的變量，其結果及方差分析如下表所示。從下表的結果可見，材料培養時間、硫酸銨飽和度、透析溫度、濃縮溫度、層析洗脫速度等均可明顯影響純化的兩個關鍵指標（P＜0.05），可確定為能夠明顯影響實驗結果的關鍵變量。而材料勻漿時間、硫酸銨沉淀時間、透析時間、濃縮時間、層析緩沖液種類和濃度等均對實驗結果沒有明顯影響，表明以上因素不是影響SOD分離純化效果的關鍵因素。

研究發現綠豆萌發時間和洗脫速度會影響到樣品的活性得率和提純得率，而郭靜婕等［17］發現在綠豆萌發過程中綠豆蛋白質含量逐步下降，不同洗脫方式會影響蛋白的分離純化，這正好互證了綠豆萌發過程中會對綠豆中的蛋白質含量造成影響，并且其抗氧化能力也會有所變化，洗脫方式會影響到收集的蛋白質含量和質量。

本次研究發現兩次硫酸銨飽和度都是影響純化指標的關鍵因素，與馬貴紅等［18］指出不同濃度的飽和硫酸銨對蛋白團聚有影響的結果形成一致。同時透析溫度和濃縮溫度對于純化指標有顯著差異，于聲波等［19］指出溫度容易影響膜通量，濃縮過程中的高通量基于高溫會導致體系總內能上升且分子受熱加快運動，因此，溫度對于實驗過程中的透析和濃縮都起到明顯作用。

在研究中，大部分與時間相關的變量、層析緩沖液種類和濃度都不造成顯著影響，原因可能在于蛋白自身理化性質的穩定性。

3"結論

根據實驗結果，通過對比不同實驗條件下各步驟純化倍數和提取得率，并對整個提取過程的總純化倍數和總提取得率進行比較，從而得出在實驗條件范圍內的最優提取條件。對比不同條件的實驗結果差異，并對差異原因進行分析，可進一步討論實驗關鍵條件變化所引起的結果變化的可能原因及機制，有助于進一步優化SOD分離純化條件并提出新的方案。

作為設計性實驗，本研究結果可進一步探究抗氧化能力強的富含蛋白質的綠豆育種方向，也可探究不同純化工藝對蛋白結構的影響，從而開發高質量蛋白產品或者其余利用價值，還能為蛋白基礎研究提供理論依據。因此，在設計性實驗教學中鼓勵學生自主探究實驗關鍵影響因素，既有利于學生深入了解實驗原理，也有助于科學工藝改進，還能優化課程設計和科研設計，從而更有利于培育新工科人才。

參考文獻：

［1］羅麗，李志軍，張鑫，等.“雙一流”背景下農業水工程國家級實驗教學示范中心建設與實踐［J］.實驗室研究與探索，2022，41（12）：168171+187.

［2］夏希悅，楊鋒，劉蘇橋，等.地方高校寶石及材料工藝學專業實驗教學體系構建與實踐［J］.高教學刊，2023（12）：116118+123.

［3］史太波，童悅，阮宜杰，等.高校實驗教學管理系統的建設與應用［J］.實驗室科學，2021，24（6）：9299.

［4］肖軍安，劉志平.學科前沿導向的有機化學創新性實驗設計與實踐［J］.化工管理，2023（19）：2123.

［5］劉洪南，王東愛，劉美華，等.遠程線上參與性實驗教學模式的設計與實踐［J］.實驗室科學，2023，26（03）：8083.

［6］楊為家，辛月，申冬玲，等.基于創新能力培養的光電功能材料創新性實驗設計［J］.高教學刊，2023，9（18）：5154.

［7］滕睿.探究安培力影響因素實驗的改進設計［J］.實驗教學與儀器，2021，38（06）：2526

［8］俞麗珍，寧春花，左曉兵，等.設計性、研究性實驗教學探索與實踐［J］.實驗科學與技術，2017，15（01）：117119+127.

［9］楊廣武.基于染料敏化太陽能電池光電性能影響因素的研究設計性實驗設計［J］.實驗技術與管理，2018，35（11）：176180.

［10］付暢，劉玉芬，滿朝來，等.生物工程下游技術進階式實驗教學模式的教學效果評價［J］.創新創業理論研究與實踐，2023，6（04）：137140.

［11］胡志明，李金龍，惠宏襄.生物工程下游技術綜合性實驗［J］.實驗室研究與探索，2013，32（06）：312314.

［12］柯德森，雷德柱，江學斌，等.生物工程下游技術實驗手冊［M］.北京：高等教育出版社，2010：122129.

［13］柯德森，江學斌，王小蘭，等.生物制藥下游技術實驗手冊［M］.廣東：廣東人民出版社，2023：116123.

［14］王淑歌，王蕾，劉真真，等.維持性血透患者PTX3、SOD、FGF23水平與冠狀動脈鈣化的關系［J］.實驗與檢驗醫學，2022，40（5）：563566.

［15］陶清萍，曹誠，張部昌，等.利用凝膠過濾層析技術分離人源γ微管環形復合物［J］.軍事醫學，2016，40（07）：545548.

［16］史玉敏，蔡俊，邱雁臨，等.凝膠過濾層析精制還原型谷胱甘肽的研究［J］.化學與生物工程，2008，25（09）：5557+160.

［17］郭靜婕，趙琤，陸燕飛，等.綠豆萌發過程中蛋白質的變化及分離純化研究［J］.食品工業，2022（10）：169172.

［18］馬貴紅，賴龍昕，李蝶，等.飽和硫酸銨純化重組日本囊對蝦鐵蛋白［J］.食品與發酵工業，2022，48（16）：138143.

［19］于聲波，白茹，劉宇，等.正滲透膜濃縮技術對熱敏性蛋白質保留率的影響［J］.中國乳品工業，2023（7）：3540.

基金項目：廣東省教學質量與教學改革工程項目——生物制藥下游技術實驗教研室（粵高教函〔2023〕4號）；廣東省高等教育教學改革項目（生物科學設計性實驗的設計與創新）（粵高教函〔2021〕29號）；廣東省一流本科專業建設點（生物科學專業）（教高廳函〔2022〕14號）

作者簡介：黃敏晴（1992—"），女，漢族，廣東茂名人，碩士研究生，助理實驗師，研究方向：生物學教育。

*通信作者：柯德森（1966—"），男，漢族，廣東潮汕人，博士研究生，研究員，研究方向：生物科學及生物學教育。