辣椒葉斑病病原鑒定及其對殺菌劑的敏感性

摘要 為明確辣椒葉斑病病原菌種類并篩選高效防治藥劑，采用組織分離法分離病原菌，基于病原菌致病性、形態(tài)和分子生物學(xué)特征確定其分類地位，采用菌絲生長抑制法測定病原菌對殺菌劑的敏感性。分離獲得形態(tài)特征一致的17個(gè)菌株。在PDA培養(yǎng)基上，菌落灰綠色，分生孢子器暗褐色、球形或扁球形，直徑為72.50～158.80μm。分生孢子無色、透明，橢圓、圓柱形，單孢或雙孢，大小為（3.15～7.84）m×（1. 58～3.45）μm。基于rDNA-ITS、LSU、RPB2和TUB2基因序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，病原菌與Stagonosporopsis pogostemonis單獨(dú)聚成一支。15%咪鮮胺微乳劑和10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對病原菌有較好的抑制作用，ECso在0.2～0.4 mg／L之間。研究結(jié)果可為辣椒葉斑病的防治提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 辣椒；葉斑；病原鑒定；藥劑敏感性

中圖分類號：S 436.418 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2024136

辣椒Capsicum annuum L.是重要的蔬菜和調(diào)味品，中國是辣椒生產(chǎn)、出口大國，辣椒年產(chǎn)量占世界1／3左右，位居世界第一。廣東是冬季北運(yùn)辣椒的重要生產(chǎn)地，每年種植面積達(dá)9.92萬hm²，是發(fā)展特色農(nóng)業(yè)的主要支柱產(chǎn)業(yè)，但由于廣東高溫高濕的氣候環(huán)境，易發(fā)生各種葉斑病，影響辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)。

炭疽病是發(fā)生最為普遍的辣椒葉斑病，現(xiàn)報(bào)道有20多種炭疽菌可侵染辣椒[3-4]，危害我國辣椒的主要有膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、球炭疽菌C.coccodes、尖孢炭疽菌C.acutatum、平頭炭疽菌C.truncatum和黑色炭疽菌C.nigrum。其他辣椒真菌性葉斑病病原菌有茄匍柄霉Stem-phylium solani、番茄匍柄霉S.lyco persici、鏈格孢Alternaria alternata、辣椒色鏈格孢A.cap-sicicola、芹菜尾孢Cercospora apii、辣椒尾孢C.capsici、辣椒葉點(diǎn)霉Phyllosticta capsici、尖孢枝孢Cladosporium oxysporum、新月彎孢Curvularia lunata和多主棒孢Corynespora cas-siicola等，可見辣椒葉斑病病原菌種類復(fù)雜。當(dāng)氣候適合或田間管理粗放，葉斑病在辣椒產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生。因田間癥狀相似，種植戶常無法對癥下藥，多使用廣譜類殺菌劑進(jìn)行防治，防效不理想，造成亂用農(nóng)藥，任意增加農(nóng)藥品種、盲目加大用藥量或施藥次數(shù)的現(xiàn)象比較普遍。

2021年-2023年在廣東韶關(guān)的南雄和始興發(fā)現(xiàn)一種辣椒葉斑病，局部危害嚴(yán)重，現(xiàn)對其病原菌種類進(jìn)行鑒定，測定病原菌對常用殺菌劑的敏感性，以期為該葉斑病的田間診斷和防治提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

辣椒病害樣本：采自廣東省韶關(guān)市南雄和始興辣椒種植區(qū)。供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液（PDB），玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）。室內(nèi)抑菌試驗(yàn)供試藥劑及其生產(chǎn)廠家見表1。

1.2病原菌的分離純化

2021年6月-2023年6月在廣東韶關(guān)市南雄（114.33°E，25.14°N）和始興（114.08°E，24.78°N）采集辣椒葉斑病樣本，觀察記錄葉斑病田間癥狀并拍照。采用組織分離法對患病葉片進(jìn)行病原菌分離和純化，接種到PDA平板上培養(yǎng)成熟，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3致病性測定

活體接種試驗(yàn)：取在PDA上培養(yǎng)8d的分離菌株，用無菌水制備5×10⁶個(gè)／mL的孢子懸浮液。取生長期一致的辣椒苗，吸取100μL孢子懸浮液無傷滴接在葉片上，接種5株辣椒，每株2片葉，以無菌水作對照。離體接種試驗(yàn)：剪取辣椒葉片、果實(shí)和枝條，吸取100μL孢子懸浮液無傷滴接在辣椒葉片、果實(shí)上，刺傷滴接在枝條上。每處理10個(gè)樣本，以無菌水為對照。將所有處理均小心置于26℃、相對濕度90%的人工氣候箱中，若液滴滑脫，及時(shí)補(bǔ)加。每日觀察樣本發(fā)病情況，出現(xiàn)明顯癥狀后進(jìn)行病原菌再分離、純化。

1.4病原菌形態(tài)觀察

將菌株接種到PDA和CMA平板上，26℃黑暗培養(yǎng)，觀察記錄菌落形態(tài)和顏色變化。培養(yǎng)8d后制片，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、孢子、分生孢子器等形態(tài)，測量孢子、分生孢子器大小。

1.5病原菌的分子生物學(xué)鑒定

隨機(jī)選取4個(gè)菌株接種于PDB培養(yǎng)液，26℃、150r／min振蕩培養(yǎng)3d，收集菌絲，用真菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取病菌基因組DNA。用特異引物（表2）進(jìn)行PCR，擴(kuò)增rDNA-ITS、LSU、RPB2和TUB2基因的部分序列。20μL反應(yīng)體系：100ng／μL DNA模板1μL，50μmol／L正、反向引物各1μL，2×PCRMix預(yù)混液8.5μL，ddH20 8.5μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，瓊脂凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增出的序列送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測得的序列提交至NCBI，獲得序列登錄號。同時(shí)在NCBI上做BLAST比對，提取GenBank中近似種的序列，用MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列比對后拼接。采用鄰接法，構(gòu)建基于rDNA-ITS、LSU、RPB2和TUB2序列的多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定菌株的分類地位，系統(tǒng)發(fā)育樹各個(gè)分支的支持強(qiáng)度通過1000次重復(fù)自展檢驗(yàn)數(shù)值進(jìn)行評估。

1.6病原菌對殺菌劑敏感性測定

采用菌絲生長抑制法，經(jīng)預(yù)備試驗(yàn)，將供試藥劑稀釋，取1mL藥液加入99 mL PDA培養(yǎng)基（45℃）中，最終殺菌劑有效成分處理濃度見表1。每100 mL培養(yǎng)基平均倒入5個(gè)平皿，制成含藥平板，接入供試菌株菌絲塊（直徑6 mm），3次重復(fù)，以加無菌水為對照，26 0C培養(yǎng)5d，用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0計(jì)算相關(guān)參數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1病害田間發(fā)病癥狀

初期，葉片上出現(xiàn)褐色水漬狀小斑點(diǎn)（圖1a）。環(huán)境條件適宜時(shí)，小點(diǎn)迅速擴(kuò)大為灰白色橢圓、梭形或不規(guī)則形病斑，病健交界處明顯，為褐色線紋，有時(shí)病斑上有輪紋（圖1b）。多個(gè)病斑可聯(lián)合成大斑（圖1c），嚴(yán)重時(shí)辣椒葉片上密布病斑，造成葉片部分或整片枯死，引起大量落葉。該病主要危害葉片，老葉和嫩葉均可受害（圖1d），也可侵染枝條（圖1e）、果柄、果萼（圖1f）和果實(shí)等部位。多雨、高濕環(huán)境，病害發(fā)展較快。

在廣東韶關(guān)南雄，辣椒葉片4月開始發(fā)病，管理粗放的辣椒田塊，發(fā)病率高達(dá)40%以上，隨著病害發(fā)展，下部葉片干枯卷曲。當(dāng)病菌侵染辣椒果柄和果萼時(shí)，辣椒果實(shí)多表現(xiàn)為畸形，難以繼續(xù)生長。嚴(yán)重時(shí)，部分辣椒果實(shí)脫落，損失較大。

2.2菌株分離及致病性測定

自廣東韶關(guān)南雄、始興采集辣椒病害樣本8個(gè)，采用組織分離法，得到了17株培養(yǎng)形態(tài)和顯微形態(tài)相似的真菌菌株。隨機(jī)選擇菌株SGL-2、SGL-5、SGL-9和SGL-13作為供試菌株進(jìn)行試驗(yàn)。

4株菌株孢子懸浮液接種活體辣椒后3～5d，葉片均出現(xiàn)褐色水漬狀病斑（圖2b），后發(fā)展為灰白色病斑，病健交界處褐色，與田間癥狀相似，葉片發(fā)病率達(dá)100%，對照均不發(fā)病。無傷接種辣椒離體葉片和果實(shí)，也均產(chǎn)生灰白色病斑（圖2c～d）。針刺接種枝條時(shí)，部分枝條可產(chǎn)生褐斑，但不明顯（圖2e），3次重復(fù)的發(fā)病率為40.00%、40.00%和60.00%。表明該分離菌株對辣椒葉片、果實(shí)的致病力較強(qiáng)，但對枝條的致病性較弱。從病斑上再分離獲得的菌株與接種菌株形態(tài)一致，符合柯赫氏法則。

2.3病原菌形態(tài)特征

4株供試菌株在PDA和CMA上形態(tài)相似，26℃培養(yǎng)，生長速度在6.40～6.80 mm/d之間。在PDA上，菌落初為灰白色，后轉(zhuǎn)為灰綠色（圖3a），背面墨綠色（圖3b），菌絲絨狀，菌落厚。在PDA上可產(chǎn)生分生孢子器，暗褐色，球形或扁球形，直徑為72.50～158.80μm（n=50，圖3c）。分生孢子單孢或雙孢，無色、透明，橢圓形、圓柱形，兩端鈍，大小為（3.15～7.84） μm×（1.58～3.45）μm（n=50，圖3d）。在PDA和CMA培養(yǎng)基上均未見有性態(tài)子囊殼產(chǎn)生。

2.4病原菌的分子生物學(xué)鑒定

以SGL-2、SGL-5、SGL-9和SGL-13為供試菌株，用特異性引物擴(kuò)增其rDNA-ITS、LSU、RPB2和TUB2的部分序列并測序，分別獲得489、331、596 bp和1327 bp的基因序列，將序列提交至Gen-Bank，獲得基因登錄號，具體見表3。同時(shí)在Gen-Bank上進(jìn)行序列匹配分析，供試菌株的ITS、LSU、RPB2和TUB2序列與Stagonosporopsis pogoste-monis菌株TYJ-SP1和TYJ-SP2的對應(yīng)基因序列一致性達(dá)到99.79%～100%。選用其近源相關(guān)序列，聯(lián)合4個(gè)基因片段構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類分析結(jié)果顯示（圖4），4株供試菌株與S.pogostemonis的4個(gè)菌株單獨(dú)聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果，將該辣椒葉斑病原菌鑒定為Stagonosporopsis pogoste-monis。

2.5病原菌對殺菌劑敏感性測定

以菌株SGL-2和SGL-9為供試菌株，測定不同殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制效果。由表4可見，10種殺菌劑對辣椒葉斑病菌菌絲生長均有一定的抑制作用，其中15%咪鮮胺ME的抑制作用最強(qiáng)，對菌株SGL-2和SGL-9的ECo為0.282mg／L和0.293mg／L。其次是10%苯醚甲環(huán)唑WG，對兩個(gè)菌株的ECso分別為0.303 mg／L和0.387mg／L。另外，廣譜殺菌劑80%多菌靈WP對病原菌也有很好的抑制效果，EC₅₀分別為2.279mg／L和2.451 mg／L。但其他廣譜殺菌劑75%百菌清WP和70%甲基硫菌靈WP則對病原菌的毒力較差，尤其是70%甲基硫菌靈WP對2個(gè)菌株的ECso均大于1000 mg／L。

3結(jié)論與討論

2021年至2023年，在廣東省韶關(guān)南雄和始興發(fā)現(xiàn)辣椒葉斑病局部危害嚴(yán)重，分離純化病原菌，經(jīng)致病性測定、病菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)觀察，同時(shí)基于rDNA-ITS、LSU、RPB2和TUB2基因序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定病原菌為Stagonosporopsis pogostemonis。Stagonosporopsis屬是一類重要的植物病原真菌，其中S.cucurbitacearum，主要侵染各種瓜類引起蔓枯病，危害嚴(yán)重。而屬內(nèi)其他種多侵染植物引起典型葉斑病，如S.vannaccii，S.caricae，S.heliopsidis等。S.pogostemonis同樣可引起葉斑病，已報(bào)道該菌可侵染廣藿香Pog-ostemon cablin和羽衣甘藍(lán)Brassica oleracea var.botrytis。本文是國內(nèi)S.pogostemonis侵染辣椒引起葉斑病的首次報(bào)道，該病在廣東韶關(guān)南雄和始興管理粗放的辣椒田塊發(fā)生嚴(yán)重，發(fā)病率高達(dá)40%以上。當(dāng)病原菌侵染辣椒果柄和果萼時(shí)，產(chǎn)生畸形果，部分辣椒果實(shí)脫落，損失較大。該病菌致病力較強(qiáng)，無需傷口，可直接侵入辣椒葉片和果實(shí)，造成病斑，表明病原菌孢子可通過雨水濺射、灌溉水漫灌等傳播到健康植株，環(huán)境條件適宜時(shí)，連片為害。

對Stagonosporopsis屬真菌環(huán)境友好的生物菌劑開發(fā)尚處于實(shí)驗(yàn)室階段，無法大規(guī)模田間應(yīng)用，現(xiàn)階段仍以化學(xué)防治為主。為有效防治病害，測定10種常用殺菌劑對辣椒葉斑病菌的毒力，其中15%咪鮮胺ME和10%苯醚甲環(huán)唑WG的抑菌作用最強(qiáng)，ECso在0.2～0.4 mg／L。陳悅等報(bào)道同屬真菌S.cucurbitacearum對450g／L咪鮮胺EW和10%苯醚甲環(huán)唑WG等16種殺菌劑表現(xiàn)出較高的敏感性，ECso lt;20.0 mg／L。占爽等的研究也表明450g／L咪鮮胺EC和37%苯醚甲環(huán)唑WP對S.cucurbitacearum的EC₅₀均小于10 mg／L。杜公福等報(bào)道10%苯醚甲環(huán)唑WG對S.cucurbitacearum的EC₅₀為1.3933 mg／L，可見咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)Χ喾N作物上Stagonosporopsis屬真菌有較好的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)辣椒葉斑病原菌S.pog-ostemonis對廣譜性殺菌劑80%多菌靈WP較敏感，對兩個(gè)菌株的EC為2.279 mg／L和2.451mg／L，這在針對Stagonosporopsis屬真菌的藥劑篩選中，未見報(bào)道。百菌清和甲基硫菌靈也是廣譜型殺菌劑，常用于各種葉斑病的防治，研究顯示辣椒上的S.pogostemonis對這2種藥劑不敏感，尤其是70%甲基硫菌靈WP對病原菌的EC₅₀大于1000mg／L，因此，不建議用這2種藥劑防治該葉斑病。辣椒葉斑病菌對咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和多菌靈敏感，其中多菌靈價(jià)格相對便宜，成本較低，是性價(jià)比較高的防治藥劑，下一步將進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)來驗(yàn)證咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和多菌靈的田間防治效果，以期為該病害的防控推薦有效藥劑。