5種殺菌劑對小麥矮腥黑粉菌的室內(nèi)毒力測定及盆栽防效

摘要 小麥矮腥黑穗病是危害程度大、防治難度高的對外檢疫性麥類黑穗病之一。為篩選出對其有效的殺菌劑，本研究通過瓊脂平板孢子萌芽法測定了5種殺菌劑原藥對小麥矮腥黑粉茵的毒力，再通過盆栽拌種試驗評估了5種原藥對應(yīng)的商品制劑對小麥矮腥黑穗病的防治效果。結(jié)果表明，5種殺菌劑對小麥矮腥黑粉菌均有毒力，其中咯菌腈和苯醚甲環(huán)唑毒力最強(qiáng)，EC₅₀為0.495 7μg／mL和0.652 9μg／mL。在盆栽拌種試驗中，5種藥劑均有一定防效，其中25g／L咯菌腈SC和30g/L苯醚甲環(huán)唑SC防治效果均顯著高于其余3種藥劑，防治效果分別為87.00%和85.42%。本研究為小麥矮腥黑穗病的化學(xué)防控提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 小麥矮腥黑粉菌；殺菌劑；毒力測定；防效評估

中圖分類號：S 482.2；S 435.121.44 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B DOI：10.16688／j.zwbh.2024226

由小麥矮腥黑粉菌Tilletia controversa Kuhn引起的小麥矮腥黑穗病是影響小麥生產(chǎn)安全最嚴(yán)重的麥類黑穗病害之一，也是國際檢疫性病害之一。該病害現(xiàn)主要分布于北緯300、南緯300以上的中緯度地帶，據(jù)歐洲和地中海植物保護(hù)組織（EPPO）報道，目前，該病害在世界上已有五大洲數(shù)十個國家和地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，我國尚未發(fā)現(xiàn)。在該病害流行年份，小麥的產(chǎn)量損失會達(dá)到50%～90%。該病菌在侵染小麥后，會導(dǎo)致小麥植株矮化，大約只有健康小麥的1／3～2/3的高度，分蘗明顯增多，籽粒變?yōu)楹谏`，具有劇毒刺鼻的三甲胺物質(zhì)，類似魚腥臭味，人類食用后存在中毒的風(fēng)險。

我國對該病菌的研究主要集中在監(jiān)測預(yù)警、分子檢測和功能探究等方面。雖然我國尚未發(fā)現(xiàn)該病害，但章正預(yù)測該病害入侵我國的可能性極高，通過小麥貿(mào)易傳人的可能性更高。魏淑秋等把該病害在我國可能定殖的地區(qū)劃分了5個區(qū)域，分別為極高危險區(qū)、高危險區(qū)、局部發(fā)生區(qū)、偶發(fā)區(qū)和低危險區(qū)。陳克等利用地理信息系統(tǒng)并結(jié)合氣象數(shù)據(jù)把該病害在中國冬麥區(qū)的定殖風(fēng)險劃分為4個等級，分別是高、中、低風(fēng)險區(qū)和基本不發(fā)生區(qū)。其中，高中風(fēng)險區(qū)約占全國冬麥區(qū)總面積的19.3%。Gao等成功開發(fā)出一對特異性引物用于檢測該病菌，隨后又開發(fā)出一種免疫熒光的方法，更加快捷和靈敏。綜上所述，我國被小麥矮腥黑穗病入侵的可能性極大，加強(qiáng)提升對小麥矮腥黑穗病的監(jiān)測和防治能力顯得尤為緊迫。

目前該病害最有效的防治手段是使用抗病品種，預(yù)防性措施主要為藥劑拌種。20世紀(jì)70年代，美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并標(biāo)記了一些抗腥黑穗基因（Bt0-Bt15），同時篩選出了一些抗病品種，其中，來自土耳其東部的‘PI178383’有明顯的抗病效果；化學(xué)防治方面，苯醚甲環(huán)唑種衣劑能有效抑制小麥矮腥黑粉菌，可以作為防治小麥矮腥黑穗病的藥劑。本研究選取廣譜殺菌劑和針對普通腥黑穗病的殺菌劑作為候選殺菌劑，對小麥矮腥黑穗病進(jìn)行室內(nèi)毒力測定和盆栽拌種試驗，評估各候選殺菌劑對小麥矮腥黑穗病的防治效果，從而篩選出能有效防治小麥矮腥黑穗病的殺菌劑，為我國對該病害的科學(xué)防控提供藥劑儲備。

1材料與方法

1.1供試材料

小麥矮腥黑粉菌菌株，易感矮腥黑穗病小麥品種‘東選3號’均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥類真菌病害研究組提供。

供試土壤：普通土壤滅菌后與營養(yǎng)土按2：1比例混合后使用。

供試材料均進(jìn)行了消毒處理，所有材料均單獨(dú)存儲于國家級高危實(shí)驗室當(dāng)中，防止其人為擴(kuò)散。

1.2供試藥劑

供試原藥5種：96%多菌靈、98%烯唑醇，上海源葉生物科技有限公司；99.8%三唑酮，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；99%咯菌腈，上海吉至生化科技有限公司；98%苯醚甲環(huán)唑，北京伊諾凱科技有限公司。供試商品制劑5種：50%多菌靈可濕性粉劑（WP）、12.5%烯唑醇可濕性粉劑（WP）、20%三唑酮乳油（EC），四川潤爾科技有限公司；25 g/L咯菌腈懸浮劑（SC）、30g／L苯醚甲環(huán)唑懸浮劑（SC），先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司。二甲基甲酰胺（DMF）用于溶解原藥。

1.3供試培養(yǎng)基

2%土壤浸提液培養(yǎng)基：稱取75g已滅菌的土壤放置在8層紗布上，用800mL煮沸的無菌水過濾，用無菌水定容至1000mL，加入20g瓊脂粉后滅菌備用。

1.4小麥矮腥黑粉菌冬孢子的培養(yǎng)

向2 mL離心管中放入4～5粒小麥矮腥黑粉菌菌癭，加入蒸餾水在室溫下過夜靜置；用鑷子將種皮剝開夾碎菌癭，使其混入滅菌蒸餾水中，使用150目紗布過濾雜質(zhì)后離心；12000r／min離心30 s，棄掉上清液，加入0.25%次氯酸鈉對冬孢子消毒10 min，上下混勻徹底消毒；12000r／min離心30s，棄掉上清液，用滅菌蒸餾水沖洗3遍；使用光學(xué)顯微鏡通過血球計數(shù)板觀察小麥矮腥黑粉菌冬孢子，將冬孢子濃度調(diào)至1×10⁶個／mL備用。

制備2%的土壤浸提液固體培養(yǎng)基，將青一鏈雙抗（Gibco）以1%體積比添加到培養(yǎng)基中，在每個平板上涂布200μL的冬孢子懸浮液。在4℃、1 lx光照和50%相對濕度下，倒置于人工培養(yǎng)箱中全光照培養(yǎng)45d左右。

1.5小麥矮腥黑粉菌的室內(nèi)毒力測定

含藥平板的制作：5種供試原藥均用適量的DMF溶液溶解，以無菌水稀釋各原藥，配制成表1中各原藥的濃度梯度，將配制好的1mL各系列濃度梯度殺菌劑分別加入到剛滅完菌稍微冷卻的2%土壤浸提液培養(yǎng)基中，充分搖勻，得到各原藥的系列梯度含藥培養(yǎng)基，按照濃度設(shè)定，將其倒入培養(yǎng)皿中，各藥劑各梯度設(shè)3個重復(fù)，將不含藥培養(yǎng)基作為對照。在預(yù)試驗中DMF溶液在培養(yǎng)基中的使用量低于0.1%，發(fā)現(xiàn)DMF溶液對小麥矮腥黑粉菌的影響在統(tǒng)計誤差范圍內(nèi)故忽略不計。

在配制好的各藥劑各梯度的含藥平板中分別加入200μL小麥矮腥黑粉菌冬孢子懸浮液，涂布均勻，在人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45d左右，然后觀察冬孢子萌發(fā)狀態(tài)。當(dāng)不加藥培養(yǎng)基的冬孢子萌發(fā)率最大時，開始統(tǒng)計各藥劑各梯度的孢子萌發(fā)情況。每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)觀察300個冬孢子，待芽管長度大于冬孢子半徑時視為萌發(fā)。按照下列公式計算各藥劑各梯度的冬孢子萌發(fā)率和對冬孢子萌發(fā)的抑制百分率。

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)的孢子數(shù)／調(diào)查總數(shù)×100%;

孢子萌發(fā)抑制率=（空白對照孢子萌發(fā)率-藥劑處孢子理萌發(fā)率）／空白對照孢子萌發(fā)率×100%。

1.6不同殺菌劑拌種對小麥矮腥黑穗病的防效測定

根據(jù)1.4的方法制備小麥矮腥黑粉菌的冬孢子懸浮液，然后進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長狀態(tài)，待菌絲生長至侵染菌絲階段收集菌絲，制備菌絲懸浮液，用于土壤接菌。

菌絲懸浮液的制備：向已經(jīng)長至侵染菌絲階段的平板內(nèi)加入3mL滅菌水，用滅菌后的涂布器刮取菌絲，重復(fù)2次，檢測其OD₆₀₀，OD₆₀₀在0.1～0.2范圍，備用。

供試小麥的拌種處理：挑選飽滿健康的小麥種子進(jìn)行拌種，首先將適量的小麥種子放入直徑15 cm的玻璃培養(yǎng)皿中浸泡大約6h，去除雜質(zhì)和水分，然后使用30%的次氯酸鈉消毒10 min，再使用無菌水反復(fù)沖洗幾次后去除水分和殘留的次氯酸鈉，最后按表2進(jìn)行拌種處理。

將對照小麥種子和不同藥劑拌種后的小麥種子進(jìn)行春化，春化后將其栽種于花盆中，每盆栽種10株，重復(fù)3盆，共計18盆，將所有小麥放置于超低溫植物培養(yǎng)箱中，溫度12℃，光周期L∥D=16h∥8h。待麥苗長出土層時，使用2 mL無菌注射器吸取小麥矮腥黑粉菌冬孢子菌絲懸浮液進(jìn)行土壤接菌，每次2mL，連續(xù)接菌7d。待小麥長至孕穗期，將溫度調(diào)至20℃，光周期L∥D=16 h∥8h，每隔7d澆水1次，直至小麥長至成熟，然后按照下列公式計算植株發(fā)病率和防效。

植株發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)／調(diào)查總株數(shù)×100%；

防治效果=（空白對照病株率-藥劑處理病株率）／空白對照病株率×100%。

1.7數(shù)據(jù)處理

使用Excel和SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析，以各藥劑濃度的對數(shù)值為橫軸（x），抑菌率對應(yīng)的幾率值為縱軸（y），計算每一種殺菌劑的毒力回歸方程和有效中濃度ECso。采用Duncan氏新復(fù)極差法對不同藥劑拌種對小麥矮腥黑穗病的防效進(jìn)行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同殺菌劑原藥對小麥矮腥黑粉菌孢子萌發(fā)的抑制作用

在4℃、1 lx光照和50%相對濕度下，倒置于人工培養(yǎng)箱中全光照培養(yǎng)45 d左右的空白對照通過光學(xué)顯微鏡的觀察，其萌發(fā)率達(dá)到高峰，為70.88%。咯菌腈、苯醚甲環(huán)唑、烯唑醇、多菌靈、三唑酮等殺菌劑對冬孢子的萌發(fā)均有一定的抑制效果，具體結(jié)果如表3所示。咯菌腈、苯醚甲環(huán)唑、烯唑醇3種藥劑濃度在10μg／mL時對孢子萌發(fā)抑制率分別為87.30%、65.51%、55.95%，而濃度在50μg／mL時多菌靈、三唑酮2種藥劑對孢子萌發(fā)抑制率分別為84.32%和62.38%。從抑制率和濃度兩個角度綜合分析，得出咯菌腈對小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)。

2.2室內(nèi)毒力測定結(jié)果

如表4所示，供試的5種原藥對小麥矮腥黑粉菌冬孢子均有抑制作用，但毒力具有差異。其中咯菌腈和苯醚甲環(huán)唑的抑菌效果最好，EC₅₀分別是0.4957μg／mL和0.6529μg／mL;而烯唑醇和多菌靈的抑菌效果次之，ECso分別是1.7421μg／mL和8.0669μg／mL;三唑酮的抑菌效果較差，EC₅₀是18.9446μg／mL。

2.3盆栽拌種對小麥矮腥黑穗病的防治效果

如表5所示，5種供試藥劑拌種對小麥矮腥黑穗病的防治效果差異顯著，25g／L咯菌腈SC和30g／L苯醚甲環(huán)唑SC的防治效果最好，二者之間無顯著差異，分別為87.00%和85.42%，顯著高于其他3種藥劑；50%多菌靈WP和12.5%烯唑醇WP顯著高于20%三唑酮EC，二者之間的防效差異不顯著，防效分別為66.17%和70.33%;20%三唑酮EC的防治效果為59.17%。表明5種供試藥劑中，25g／L咯菌腈SC和30g／L苯醚甲環(huán)唑SC的防效較高，20%三唑酮EC的防效最低。因此推薦25g／L咯菌腈SC和30g／L苯醚甲環(huán)唑SC作為小麥矮腥黑穗病的田間拌種預(yù)備藥劑。

3結(jié)論與討論

俞大紱通過翻譯和借鑒美國等國家的文獻(xiàn)，認(rèn)為氯化苯（六氯苯和五氯硝基苯）之類的化學(xué)藥劑防治小麥矮腥黑穗病效果顯著，但不經(jīng)濟(jì)可行。雖然小麥矮腥黑穗病尚未在我國發(fā)生，但由于我國新疆與8個國家接壤，邊境線長，加之對外貿(mào)易頻繁，小麥矮腥黑穗病傳人風(fēng)險極大，當(dāng)?shù)卦缫验_展藥劑拌種用來防治小麥普通腥黑穗病，而普通腥黑穗病在我國曾發(fā)生過大流行，針對普通腥黑穗病的殺菌劑較多，常曉春等、張菡等、張渭薇等、施秀燕等等先后篩選出了一些防治普通腥黑穗病的殺菌劑，但針對小麥矮腥黑穗病有效的殺菌劑尚不清楚。所以篩選針對小麥矮腥黑穗病具有較好防效的藥劑作為技術(shù)儲備迫在眉睫。

本研究測定了5種殺菌劑原藥對小麥矮腥黑穗病菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果表明咯菌腈和苯醚甲環(huán)唑的抑菌效果最好，EC₅₀分別是0.4957μg／mL和0.6529μg／mL，但結(jié)合使用劑量和抑菌率來看，咯菌腈的抑菌效果最優(yōu)。隨后又對相應(yīng)的農(nóng)藥制劑進(jìn)行了小麥矮腥黑穗病的室內(nèi)盆栽拌種試驗，發(fā)現(xiàn)25g／L咯菌腈SC和30g／L苯醚甲環(huán)唑SC的防治效果最好，與室內(nèi)毒力測定的結(jié)果相一致。綜合上述結(jié)果，可將25g／L咯菌腈SC和30g／L苯醚甲環(huán)唑SC作為未來可能在我國發(fā)生的小麥矮腥黑穗病田間推薦防治藥劑。

本研究試驗均在室內(nèi)進(jìn)行，具有相對穩(wěn)定和可控的生長環(huán)境、試驗操作等條件，而田間作物生長的環(huán)境條件十分復(fù)雜，室內(nèi)的抑菌效果和防治效果不能完全代表田間藥劑防治效果，但可作為田間藥劑防治的參考依據(jù)。