皂角豆象幼蟲齡期指標與判別

摘要 明確皂角豆象Megabruchidius dorsalis幼蟲發育狀況和最佳分齡指標，有助于為其預測預報及種群防控提供理論依據。通過室內飼養，逐日測量幼蟲的頭殼寬、上顎寬、體長和體寬等形態指標，并運用頻次分布、多峰擬合、核密度估計法、Dyar法則判斷皂角豆象幼蟲的齡數，運用Crosby生長法則和回歸分析進行驗證。結果表明：皂角豆象幼蟲頭殼寬和上顎寬多峰擬合和核密度估計分析顯示出4個明顯的正態峰；僅頭殼寬的Crosby指數小于0.1且Brooks指數較為穩定，說明幼蟲的頭殼寬度可作為劃分齡期的形態指標，其1～4齡幼蟲的頭殼寬平均值分別為0.166、0.311、0.530、0.834 mm。室內28℃下飼養幼蟲歷期約為16d，根據幼蟲頭殼寬和日齡的關系，1～4齡幼蟲的日齡分別介于1～6、3～9、5～11 d和8～16 d之間。因此，皂角豆象幼蟲可分為4齡，頭殼寬作為其幼蟲分齡最佳指標。

關鍵詞

皂角豆象；幼蟲齡期；頭殼寬；多峰擬合；核密度估計法；Crosby指數

中圖分類號：S 763. 38 文獻標識碼：A DOI：10.16688／j.zwbh.2024126

皂角豆象Megabruchidius dorsalis （Fahraeus，1839），又名皂莢豆象，隸屬鞘翅目Coleoptera葉甲科Chrysomelidae豆象亞科Bruchinae，原隸屬錐胸豆象屬Bruchidius Schilsky，后Borowiee根據其觸角無雌雄二型和雌蟲臀板上的凹陷，以其為模式種建立了Megabruchidius屬。該蟲常以高齡幼蟲和成蟲越冬，主要分布在印度、日本、歐洲和中國等地，在我國主要分布在各皂角種植區，已知寄主大多為皂莢屬Gleditsia Linn.植物。皂角豆象主要以幼蟲鉆蛀莢果為害，其成蟲通常在皂莢和皂角種子表面產卵，幼蟲孵化后鉆入種子中直到羽化后鉆出，一年發生多代，且連續為害，幼蟲易隨著莢果擴散，因此，幼蟲期是該蟲的主要防治階段。在各皂角種植區，大量皂角的種子遭到皂角豆象的蛀害，其中，在貴州莢果受害率可達73%，該害蟲嚴重降低皂角的產量和質量。

皂角豆象幼蟲鉆蛀取食皂角莢果，隱蔽性強，由于皂角莢果十分堅硬，難以通過蛻皮直接觀察其幼蟲齡數。目前，僅李猷等報道了該蟲的生物學特性，但其將幼蟲期和蛹期籠統地稱為豆內期，未能詳細劃分其齡數和測定齡期。明確皂角豆象幼蟲的齡數和齡期，可為該蟲的科學研究、預測預報和種群生態防治提供重要依據。目前，確定幼蟲齡期的方法很多，最常用的方法為目測直方圖的頻率分布分析圖，核密度估計法以及基于K-均值或高斯混合模型的聚類分析。通過以上方法獲得的齡數可依據Crosby生長法則與回歸分析評估其是否合理。根據Dyar法則，相鄰齡期的昆蟲頭殼寬度存在著一定的幾何級數關系，據此可以推斷幼蟲的齡數。崔小林等通過測量分析幼蟲頭殼寬、上顎寬和體長將綠豆象Callosobruchus chinensis Linnaeus幼蟲分為4個齡期；通過觸角孔間距和前胸背板寬度可將檸條綠虎天牛Chlorophorus caragana Xie amp; Wang幼蟲階段分為7個齡期。目前，對于皂角豆象幼蟲齡期僅在Lezhenina等的研究中發現有4齡幼蟲，但并未詳細報道劃分依據。

因此，本文通過逐日測量皂角豆象幼蟲的頭殼寬、上顎寬、體長和體寬，并運用頻次分布和核密度估計法分別推測幼蟲齡數，運用Crosby生長法則和回歸分析方法判斷皂角豆象幼蟲的最佳分齡方法及其指標并驗證幼蟲的齡數，為皂角豆象幼蟲齡期的準確劃分提供依據，為明確皂角豆象預測預報及種群生態防控提供理論基礎。

1材料與方法

1.1供試蟲源

供試蟲源采自于2020年10月采自貴州織金縣（106°03′E-106°04′E，26°32′N-26°33′N）周邊皂角莢中，連同莢果一起帶回實驗室在人工氣候箱（RX2-380A-LED，寧波江南儀器廠）恒定條件下飼養，飼養條件為（28±1）℃，相對濕度（65±5）%，光周期L∥D=10 h∥14 h。在塑料盒（225 mm×155mm×80 mm）中放置皂角Gleditsia sinensis Lam.種子飼養，建立實驗種群，連續飼養多代，塑料盒頂部蓋紗布透氣。成蟲羽化后，根據臀板上的凹陷等特征，區分皂角豆象成蟲性別，并每天用新鮮黃瓜片補充營養，備用。

1.2幼蟲樣本收集

在飼養條件下，將新羽化的皂角豆象（♀：♂=1：1）配對后放人培養皿（35mm）中飼養并觀察產卵情況，待卵孵化后，用毛筆刷將初孵幼蟲挑至皂角種子上，觀察幼蟲鉆人種子。每天隨機選取15粒皂角種子，沿皂角種子的種臍走向剖開取出幼蟲，將蟲體展平，逐頭測量相關形態指標，其余有蟲種子繼續飼養，直到所取幼蟲化蛹，累計取16d，共解剖240粒有蟲種子（240個樣本）。

1.3分齡指標及測量方法

參考崔小林等的研究選取皂角豆象幼蟲的頭殼寬、上顎寬、體長及體寬作為其分齡指標。將收集到的幼蟲平展，使用奧斯微視頻顯微鏡（AO-FD600E，深圳市奧斯微光學儀器有限公司）測量幼蟲的頭殼寬-Y1（與蟲體縱軸垂直的頭殼最寬處），上顎寬-Y2（與蟲體縱軸垂直的上顎最寬處），體長-Y3（頭部最前端沿中軸縱向至腹部最末端）和體寬-Y4（與蟲體縱軸垂直的最寬處）（圖1）。

1.4數據統計與分析

使用SPSS 26.0軟件對獲得的數據進行頻次分析，在假設各項指標數據分布呈正態分布情況下，使用以下2種方法分析數據。

多峰擬合法與指數回歸分析：用Origin 2018（Origin Lab）作每項指標相應的頻次分布直方圖，然后進行多峰擬合，根據曲線單峰數量、擬合效果、Dyar法則等判斷幼蟲齡數，將相鄰兩峰正態曲線的交點作為蟲齡分界點。多峰擬合高斯函數如式（1）：

式中，Y₀代表函數垂直偏移量，A代表振幅，W代表關聯高斯函數寬度的參數，x_C代表函數峰值對應的x值。

齡數確定后，根據測量值計算指標（頭殼寬、上顎寬、體長、體寬）的樣本數、變幅、均值、標準誤差及變異系數。對皂角豆象幼蟲齡期（x）與其對應指標測量值進行指數回歸分析，其他必要計算均在Microsoft Excel 2021中進行。

核密度估計法與指數回歸分析：通過應用R語言的“ggplot2”包中的“geom_density\"函數獲取核密度曲線，目測0.05～0.12 mm范圍內的不同帶寬所得曲線。其中，帶寬為核密度估計的關鍵參數，決定核密度函數平滑程度。帶寬過窄，核密度函數波動劇烈，包含大量噪聲帶寬過寬，核密度函數過度平滑，造成數據細節丟失。選擇最佳帶寬構建的核密度曲線的最低點作為各齡期的分離點，確定齡期后再進行與第一種方法類似的處理。

結合Crosby生長法則和指數回歸分析，評價齡期劃分的合理性。當Crosby指數小于0.1且R²愈高時，劃分齡期的分組愈合理，反之則不合理。Brooks指數、Crosby指數、變異系數計算公式：

2結果與分析

2.1皂角豆象幼蟲指標的多峰擬合法與指數回歸分析

對240頭皂角豆象各齡幼蟲樣本的頭殼寬、上顎寬、體長和體寬4項形態指標的測量值進行頻次分布和多峰擬合。通過頭殼寬（圖2a）和上顎寬（圖2b）的頻次分布直方圖可以觀察到4個明顯的集中分布區域（一個集中區域代表一個齡期），無明顯重疊現象，多峰擬合也顯示具有4個明顯的正態峰（頭殼寬：R²=0.936；上顎寬：R²=0.948；Plt;0.05）（表1），則初步判定頭殼寬和上顎寬可作為皂角豆象幼蟲分齡指標。皂角豆象幼蟲體長和體寬頻次分布圖未見明顯集中分布區（圖2c，d），無法判別幼蟲齡期。根據Dyar法則可以初步判定皂角豆象幼蟲的齡數為4齡。正態曲線交點作為蟲齡分界點，1～4齡幼蟲的頭殼寬平均值分別為0.166、0.311、0.530、0.834mm，上顎寬平均值分別為0.073、0.173、0.306、0.446 mm（表2）.

分別以頭殼寬與上顎寬為依據所對應1～4齡幼蟲其體長、體寬范圍值一致。其中體長平均值分別為0.685、0.920、1.553、4.040 mm，體寬平均值分別為0.286、0.543、0.998、2.404 mm（表2）。各齡期測量數值間重疊現象嚴重。

對皂角豆象幼蟲齡期（z）與其對應的頭殼寬（圖3a）、上顎寬（圖3b）、體長（圖3c）和體寬（圖3d）的測量值進行指數回歸分析。結果表明，頭殼寬和上顎寬的指數關系與齡期存在極顯著的相關關系，其中頭殼寬與齡期之間的指數擬合模型的回歸系數最大（R²=0.9753）。

2.2皂角豆象幼蟲指標的核密度估計與指數回歸分析

在頭殼寬（圖4a）、上顎寬（圖4b）、體長（圖4c）、體寬（圖4d）的核密度估計圖中都可以觀察到4個明顯的集中分布區域（1個集中區域代表1個齡期），再將不連續點確定為每個連續齡期之間的分離點，可以初步判定皂角豆象幼蟲齡數為4齡，其中1～4齡幼蟲的頭殼寬平均值分別為0.166、0.313、0.537、0.834mm，上顎寬平均值分別為0.074、0.174、0.306、0.446 mm，體長平均值分別為0.839、1.997、3.828、5.456 mm，體寬的平均值分別為0.466、1.323、2.388、3.072mm（表2）.

對皂角豆象幼蟲齡期（x）與其對應的頭殼寬（a）、上顎寬（b）、體長（c）和體寬（d）的測量值進行指數回歸分析（圖5）。結果表明，頭殼寬、上顎寬、體長的指數關系與齡期存在極顯著的相關關系，頭殼寬與齡期之間的指數擬合模型的回歸系數最大（R²=0.9749）。

2.3皂角豆象幼蟲Crosby指數分析

結果表明，在皂角豆象幼蟲齡期的2種分離方法（多峰擬合法與核密度估計法）中頭殼寬、上顎寬、體長和體寬4項指標都可區分為4個齡期。進一步分析2種方法中皂角豆象幼蟲各齡指標的測量值的樣本數、變幅、平均值、標準誤差、變異系數、Brooks指數和Crosby指數（表2）。

在多峰擬合法和核密度估計法中，僅皂角豆象幼蟲頭殼寬Crosby指數小于0.1且Brooks指數較為穩定，表明2種擬合方法以頭殼寬為分齡指標將皂角豆象幼蟲劃分為4個齡期合理。

2.4皂角豆象幼蟲各齡齡期

根據Crosby生長法則和回歸分析法驗證幼蟲的齡數為4齡，試驗過程中觀察到1～4齡幼蟲如圖6所示。皂角豆象幼蟲從第12天開始陸續停止取食，16d后全部停止。連續16d每日隨機抽取15頭幼蟲測量其頭殼寬，可得頭殼寬與幼蟲日齡的關系，1～4齡幼蟲的日齡分別介于1～6、3～9、5～11d和8～16d之間，相鄰齡期有重疊現象，第3天、第5天和第8天幼蟲開始跨齡（圖7）。

3結論與討論

明確幼蟲的齡數和齡期，可為昆蟲生物學特性研究提供基礎，也是確定幼蟲防治時機的重要依據。準確判別幼蟲齡期需要依據幼蟲蛻皮作為標準，但皂角豆象幼蟲難以通過蛻皮直接觀察齡數變化，因此可以使用Dyar法則確定皂角豆象幼蟲齡期。本研究基于皂角豆象幼蟲頭殼寬、上顎寬、體長和體寬的測量值的頻次分布，利用多峰擬合、核密度估計法、Dyar法則與回歸分析推測皂角豆象幼蟲齡期為4齡。2種方法中皂角豆象幼蟲頭殼寬的R²均優于其他形態指標的R²，且僅頭殼寬Crosby指數小于0.1，說明在皂角豆象幼蟲分齡中頭殼寬為最佳分齡形態指標。多峰擬合法中頭殼寬R²值較核密度估計法中的高，即多峰擬合法比核密度估計法更為適合對皂角豆象幼蟲進行分齡。結合室內飼養結果，根據皂角豆象幼蟲頭殼寬和上顎寬與幼蟲日齡的關系，可推測1～6d為1齡幼蟲，2齡和3齡幼蟲齡期交叉明顯，2齡幼蟲介于3～9d，3齡幼蟲介于5～11d，4齡幼蟲介于8～16d之間。

在許多蛀干害蟲的分齡研究中，不同種類最佳分齡指標存在一定差異，其中頭殼和上顎作為骨化程度較高的結構，常被作為最合理可靠的分齡指標，如在鞘翅目松褐天牛Monochamus alternatus Hope、赤斑白條天牛Batocera rufomaculata Degeer、蜂巢奇露尾甲Aethina tumida Murray幼蟲的分齡研究中，發現幼蟲頭殼寬被作為分齡指標；上顎長作為星天牛Anoplophora chinensis Forste分齡指標優于其他指標；在鉆蛀性害蟲鱗翅目昆蟲幼蟲的分齡研究中，梨小食心蟲Grapholitha molesta Bus-ck、甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hubner、菱角水螟Parapoynx crzsonalis Walker等幼蟲皆可通過頭殼寬準確劃分齡數。當然，其他指標如尾又及其長度、前胸背板、單眼和觸角間距等也可用于幼蟲分齡，諸如尾又及其長度是白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis Fairmaire分齡的理想指標；前胸背板寬度可作為松褐天牛M.alternatus Hope幼蟲齡期劃分的指標；陸俊姣等研究了華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita Faldermann幼蟲的齡數，發現其單眼間距和觸角間距易觀察測量，且Crosby指數均小于0.1，以及與齡期的回歸擬合較好（Plt;0.001），并且明確了各齡歷期（在25℃下可分為3個齡期，分別為22、30、180 d），因此，不同昆蟲的分齡指標需進行驗證方可判斷其有效性。本研究中發現幼蟲頭殼寬為最佳的分齡指標，這與桑天牛Apriona germari Hope幼蟲、油茶象Curculio chinensis幼蟲分齡的研究結果一致。

本研究中皂角豆象體長和體寬容易受食物狀況、測量過程的影響，重疊現象嚴重，因此不推薦為蟲齡劃分的指標，這與其他研究結果一致。因為在相同齡期下的幼蟲，受個體發育或其他因素的影響，體長和體寬可能差異較大，如處于饑餓狀態下的楊黑點葉蜂Pristophora conjugata的幼蟲生長發育緩慢，但實際生產中由于體長和體寬易于用肉眼觀察，可以作為輔助分齡指標。

溫度、濕度、光照、幼蟲密度、成蟲性信息素、寄主植物等因素亦會影響幼蟲發育，從而影響幼蟲的齡數。崔小林等研究了不同溫度下綠豆象幼蟲的齡期劃分，根據對綠豆象幼蟲的體長、頭殼寬及上顎寬測量值進行頻次分布和曲線擬合，推斷20、25、30℃條件下綠豆象幼蟲分別為5齡、4齡和3齡。因此特定條件下齡期的準確劃分，對于昆蟲生物學習性和綠色防控至關重要。有關不同溫度、濕度、光照和寄主植物等對皂角豆象幼蟲齡數和齡期的影響程度還需進一步探索。