Wolbachia感染下松毛蟲赤眼蜂Atg8基因表達特征

摘要 細胞內共生菌Wolbachia可誘導卵寄生蜂赤眼蜂發生孤雌產雌生殖現象。細胞自噬是細胞維持自身穩態和抵御病原物的重要機制，是影響Wolbachia感染和增殖的重要因子。其中，ATG8／LC-3蛋白是細胞自噬的重要指示蛋白。本研究克隆了松毛蟲赤眼蜂Trichogramma dendrolimi細胞自噬關鍵基因TdeAtg8，該基因編碼的TdeATG8蛋白包含130個氨基酸，具有ATG8蛋白家族保守結構域，相對分子質量為15.25kD，理論等電點為9.432。檢測不同發育階段松毛蟲赤眼蜂Wolbachia感染品系和未感染品系的TdeAtg8轉錄水平發現，與未感染品系相比，感染品系的TdeAtg8轉錄水平在蛹期和成蟲期顯著上調，在預蛹期顯著下調；兩種品系的TdeAtg8轉錄水平在卵期和幼蟲期無顯著差異。研究結果將為進一步揭示Wolbachia與宿主細胞自噬反應的相互作用機理奠定基礎。

關鍵詞 Wolbachia；細胞自噬；松毛蟲赤眼蜂；生物防治；Atg8

中圖分類號：S 476.3 文獻標識碼：A DOI：10.16688／j.zwbh.2024210

細胞內共生菌Wolbachia廣泛存在于節肢動物中，在調節宿主繁殖方面扮演著重要角色。Wol-bachia通過宿主生殖細胞進行母系傳播，可引起宿主細胞質不親和、雌性化、孤雌生殖和雄性死亡等生殖表型。其中，Wolbachia可以誘導卵寄生蜂赤眼蜂Trichogramma孤雌產雌生殖。孤雌產雌生殖的雌蜂無需交配就能產下具有控害功能的雌性子代，因此Wolbachia介導的孤雌產雌生殖赤眼蜂在生物防治中具有較高應用潛力。

細胞自噬通過溶酶體主動降解異常蛋白、受損細胞器和病原體，是細胞維持自身穩態的重要機制。細菌、病毒等病原體侵染細胞時，病原體可誘導細胞形成杯狀隔膜包繞在被降解物周圍，隨后逐漸延伸至降解物周圍形成封閉的自噬體膜。自噬體經細胞骨架運輸至溶酶體，通過自噬溶酶體主動降解內部成分。自噬體形成機制在不同生物中具有高度保守性。在細胞自噬過程中，自噬相關蛋白前體ATG8首先經過ATG4蛋白酶的切割暴露C端甘氨酸（Gly）殘基，經ATG7（E1酶）激活轉移至ATG3 （E2酶），通過ATG12-ATG5-ATG16 （E3酶）大分子復合物與磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl etha-nolamine，PE）結合形成ATG8-PE復合物。ATG8-PE復合體定位于自噬體膜上，自噬體成熟后其外膜上的ATG8被ATG4解偶聯。隨后，自噬體與溶酶體結合形成自噬溶酶體，將自噬體內膜偶聯的ATG8及內部包含的折疊錯誤的蛋白質、入侵微生物、多余或損傷的細胞器一同降解。在上述過程中，ATG8蛋白是參與整個自噬過程的重要標志蛋白，也是自噬體膜形成的重要標志。

Wolbachia是嚴格的細胞內共生菌，其對細胞的感染和自身增殖活動依賴于宿主細胞的生理活動。宿主細胞則可通過細胞自噬活動調節Wolba-chia對宿主細胞的感染，是宿主調節Wolbachia在不同組織細胞感染水平的重要機制。例如，在黑腹果蠅Drosophila melanogaster中，果蠅體細胞的Wolbachia受細胞自噬的負調節，其細胞自噬反應使Wolbachia感染滴度隨胚胎的發育而下降。透射電鏡發現果蠅體內Wolbachia可與細胞內質網膜相互作用，誘導細胞自噬現象。在果蠅和線蟲體細胞組織中，Wolbachia的共生株系或致病株系皆受到宿主細胞自噬調控，快速復制的Wol-bachia可激活宿主的自噬反應。這些現象表明，自噬是宿主調節Wolbachia感染滴度的重要機制。

本研究克隆了松毛蟲赤眼蜂Trichogrammadendrolimi細胞自噬相關蛋白（TdeATG8）基因（TdeAtg8），采用實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR）檢測松毛蟲赤眼蜂Wolbachia感染品系和未感染品系在不同發育階段的Atg8轉錄水平。研究旨在明確細胞自噬標志蛋白TdeATG8在松毛蟲赤眼蜂Wolbachia感染品系和未感染品系的表達規律，初步明確Wolbachia感染對赤眼蜂細胞自噬水平的影響。研究結果將為進一步探究Wolbachia與赤眼蜂細胞自噬反應的相互作用機理奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試昆蟲

供試松毛蟲赤眼蜂Wolbachia感染品系（Tdw）和未感染品系（Td）采集自遼寧省桓仁滿族自治縣（41°10′N，125°25′E）。松毛蟲赤眼蜂種群以柞蠶Antheraea Pernyi卵為中間寄主繁育，在溫度（25±1）℃、相對濕度（70±5）%、光周期L∥D=16 h∥8h條件下連代飼養。

1.2松毛蟲赤眼蜂細胞自噬相關蛋白基因TdeAtg8的克隆

1.2.1總RNA的提取和cDNA的合成

取松毛蟲赤眼蜂寄生后發育20 min（卵期）、3d（幼蟲期）、6d（預蛹期）、9d（蛹期）的柞蠶卵，解剖獲得柞蠶卵內的子代蜂。成蟲期樣本取自初羽化24h內的子代蜂。采用Trizol法提取Tdw和Td各發育階段的總RNA，以核酸蛋白儀驗證RNA濃度和純度。提取的RNA采用定量PCR專用反轉錄試劑盒[PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eras-er，Perfect Real Time，TaKaRa，寶日醫生物技術（北京）有限公司]反轉錄cDNA，并保存于-20℃備用。

1.2.2TdeAtg8的cDNA全長擴增與測序

參照NCBI中已登錄的膜翅目Hymenoptera模式昆蟲Atg8同源序列，查詢對應氨基酸序列，通過TBtool-x64的Blast比對篩選出松毛蟲赤眼蜂轉錄組中轉錄本所編碼的同源蛋白序列及CDS區序列。采用在線網站（https：∥www.primer3plus.com）設計Atg8基因全長序列上、下游擴增引物（上游引物：

5′-AT GAATCTCGTACCAAAATCTTTC-3′；下游引物：5′-TTAAGAACTCTCACAGAGCTTG-3′）。以前期獲得的cDNA為模板，使用高保真酶預混液[PrimeSTA Max Premix（2×），TaKaRa，寶日醫生物技術（北京）有限公司]擴增Atg8全長序列。PCR反應體系為：cDNA模板1μL，高保真酶預混液25μL，上、下游引物（10μmol／各1μL，ddH₂O21μL。PCR反應程序為98℃ 3 min; 98℃10 s，60℃20 s，72℃30 s，35個循環；72℃ 5 mm。擴增產物保存于4℃。利用膠回收試劑盒（Omega GelExtraction Kit，Omega，廣州飛揚生物工程有限公司）將PCR產物純化，經pEASY-T1 simple（北京全式金生物技術有限公司）表達載體構建質粒后測序。

1.3TdeATG8的生物信息學分析

利用在線網站NovoPro （https：∥www. novopro.cn／tools／translate.html）對TdeATG8進行蛋白質理化性質、亞細胞定位、跨膜結構、信號肽預測和蛋白質二級結構預測分析。利用在線網站NCBI分析TdeATG8的保守結構域。從NCBI（https：∥www. ncbi.nlm.nih.gov／）分別下載不同昆蟲的ATG8氨基酸同源序列[煙蚜繭蜂Aphidius gifuensis（XP 044007066.1），Diachasrma alloeum （XP 015112600.1），毀側溝繭蜂Microplitis demolitor（XP 008553788.1），中紅側溝繭蜂Microplitis me-diator （XP 057320069.1），菜粉蝶盤絨繭蜂Cotesia glomerata （XP 044589810.1），島甲腹繭蜂Chelo-nus insularis （XP 034935317.1），葉舌蜂Hylaeus volcanicus （XP 053973286.1），紅腹尾蜂Orussus abietinus （XP 012280792.1），紅石蜂Osrnia bzcor-nis （XP 029032143.1），火紅熊蜂Bombus pyrosoma（XP 043592571.1），小蜜蜂Apis florea（XP 003691334.1），多胚跳小蜂Copidosoma florida-num （XP 014206291.1），短管赤眼蜂Trichogram-ma pretiosum （XP 014223823.1），麗蠅蛹集金小蜂Nasonia vitripennis（XP 031782411.1）]。通過DNAMAN對松毛蟲赤眼蜂及其他膜翅目昆蟲的ATG8進行氨基酸序列比對。采用MEGA11軟件的鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構建ATG8同源序列的系統發育樹（bootstrap=1000）。

1.4TdeAtg8在Td和Tdw不同發育階段的轉錄水平定量分析

選擇RPL10（上游引物：5 '-TCCGCGCACA-CATCTATACA-3';下游引物：5 '-TTGACTGT-GCCACTGAAACG-3'）和RPS13（上游引物：5'-TCCCAGTCAGCTTTGCCATA-3';下游引物：5'-GCACTTGAGCAACACCATGA-3'）[生工生物工程（上海）有限公司合成]作為RT-qPCR反應內參基因。選取前期獲得的Tdw和Td不同發育階段子代蜂cDNA。設置3個生物學重復，每一生物學重復設3次機械重復。利用RT-qPCR檢測各品系不同發育階段TdeAtg8轉錄水平（上游引物：5 '-GCATCCCACGCAAGCATTTT-3'；下游引物：5'-ACAGAGCTTGTGTGTTGATCCA-3'）。RT-qPCR反應體系為：cDNA模板1.6μL（200ng／μL），上、下游引物（10μmol／L）各0.8μL，2×TBGreen Premix Ex TaqⅡ[TaKaRa，寶日醫生物技術（北京）有限公司]10μL，ddHO 6.8μL，反應程序為：95℃30 s；95℃5s，51℃30 s，39個循環；72℃30 s，95℃ 10 s，以0.5℃／s從60℃升溫至95℃維持5s。利用2^-△△C_T法計算TdeAtg8的相對表達量。

2結果與分析

2.1 TdeAtg8的序列特征

TdeAtg8序列全長570 bp，編碼130個氨基酸，無跨膜區，無信號肽，蛋白質分子量為15.25 kD，等電點為9.432。蛋白亞細胞定位預測TdeATG8主要位于細胞質內。在N端第16-120位氨基酸殘基之間有1個UbLATG8_1VIAPILC3保守結構域。TdeATG8氨基酸序列具有ATG4和ATG7互作位點。N端第49-53位氨基酸殘基之間具有保守的ATG13互作區域（圖1）。TdeATG8的二級結構中，α-螺旋（alpha helix）占38.46%，β-折疊（betastrand）占6.92%，無規則卷曲（random coil）占40.77%，延長鏈（extended strand）占13.85%。

TdeATG8與同為膜翅目赤眼蜂科赤眼蜂屬的短管赤眼蜂的同源蛋白氨基酸序列相似性最高，為99.23%。該分支又與多胚跳小蜂聚為一支（圖2）。

2.2 Tdw和Td不同發育階段TdeAtg8的轉錄水平

與Td相比，Tdw預蛹期TdeAtg8的轉錄水平顯著下調（df=77，t=3.555，P=0.006），蛹期（df=77，t=18.381，Plt;0.001）和成蟲期（df=77，t=21.926，Plt;0.001）顯著上調，在卵期（df=77，t=1.693，P=0.095）和幼蟲期（df=77，t=0.732，P=0.466）均無顯著差異。Td成蟲期TdeAtg8轉錄水平顯著高于除卵期外的其他時期。Tdw成蟲期TdeAtg8轉錄水平顯著高于其他時期；幼蟲期最低（圖3）。

3結論與討論

本研究克隆了松毛蟲赤眼蜂的TdeAtg8全長cDNA，預測編碼的TdeATG8含有1個UbLATG8 MAPILC3保守結構域。TdeATG8的Ubl與磷脂酰乙醇胺（PE）結合是自噬體形成的重要過程。

ATG8不僅在自噬體膜的延伸中發揮作用，還會通過銜接的ATG13蛋白將聚集的蛋白、線粒體、和病原物招募到自噬體膜上。TdeATG8 N端第49-53位氨基酸殘基是調節LC3蛋白與ATG13LIR結構域相互作用的重要區域。TdeATG8在進化上較為保守，與短管赤眼蜂的ATG8同源蛋白在演化上具有相似性。

Wolbachia感染顯著上調了松毛蟲赤眼蜂蛹期及成蟲期的自噬水平。自噬是細胞控制Wolbachia感染和增殖的重要機制。果蠅Atg16、Atg13缺失突變體Wolbachia感染滴度相對于野生型顯著上升，暗示自噬是控制細胞內Wolbachia增殖的主要因素。Wolbachia在果蠅幼期均勻分布，但隨著子代的發育，頭部等組織的Wolbachia感染滴度顯著下降，呈現出限制性感染模式，果蠅體內Wolba-chia的限制性感染模式與細胞自噬相關。本研究組前期研究也發現，赤眼蜂Wolbachia相對滴度在蛹期和成蟲期逐漸呈現下降趨勢。據此推測Wolbachia感染介導的松毛蟲赤眼蜂預蛹期及蛹期的細胞自噬活動可能參與了塑造赤眼蜂成蟲的Wolbachia感染滴度和分布格局。Hargitai等發現，Wolbachia感染介導的宿主自噬反應可能與Wolbachia自身的損傷有關。果蠅體內Wolbachia感染區域限制于卵巢等特定器官，伴隨宿主發育，在感染及增殖過程中受損傷的Wolbachia數量逐漸積累，從而激活宿主細胞自噬反應清除部分Wolba-chia。使用抗生素處理果蠅后，宿主體內受損及死亡Wolbachia顯著增加，自噬強度顯著上調。

本研究發現，2種品系的松毛蟲赤眼蜂在卵期、蛹期和成蟲期的細胞自噬標志基因Atg8轉錄水平均顯著高于幼蟲期和預蛹期。不同發育階段子代蜂細胞分化和組織發育的特點可能致使相應時期細胞自噬水平存在差異，使細胞自噬關鍵基因Atg8在不同發育階段差異顯著。在鱗翅目等昆蟲的變態發育過程中，蛻皮激素可參與誘發細胞自噬引起的Ⅱ型細胞程序性死亡，用以代謝或降解幼蟲的組織細胞。在家蠶變態發育過程中，中腸和絲腺的細胞自噬分子相應與其體內蛻皮酮激素滴度高度同步。赤眼蜂屬于典型的全變態昆蟲，細胞自噬對其維持不同階段變態發育的穩態、促進細胞自我更新、參與執行細胞增殖和分化等過程至關重要。在這一過程中，細胞通過自噬作用將細胞組分重新代謝利用，促進器官或組織的形成。赤眼蜂在蛹期會逐步形成各種內部器官，赤眼蜂化蛹后，新的體壁會在預蛹體壁下形成，經10h發育后，體軀開始分節，足芽、翅芽和觸角芽開始形成并逐漸延長。在子代蜂體軀內部，神經系統開始出現，腦芽發育形成腦和腦神經，腹索神經變粗并形成神經節。子代蜂預蛹中的生殖囊也逐漸發育為生殖腺。上述現象揭示細胞自噬水平在蛹期開始上調可能與赤眼蜂的變態發育過程有關。在成蟲期，赤眼蜂卵巢中的卵母細胞仍會繼續發育成熟，同時成蟲遭遇營養缺乏等環境脅迫時，也會通過細胞自噬保障其生存。例如，當環境營養缺乏時，某些昆蟲會通過自噬促進營養物質的循環利用。赤眼蜂胚胎在卵裂后，會逐步分化形成胚盤，同時胚胎開始出現細胞分化形成胚層，伴隨漿膜、羊膜、胚帶、口節、體壁的形成，胚體開始分節并出現附器。在這些過程中，細胞自噬都有參與并發揮了重要作用。

Wolbachia作為細胞內共生菌與受感染的節肢動物存在著互惠、共生、寄生關系，在昆蟲生物學領域有著重要地位。但它與松毛蟲赤眼蜂自噬反應的相互作用機制還未知。本研究為進一步揭示Wolbachia與宿主細胞自噬反應的相互作用機理奠定基礎。