超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定16種農(nóng)藥在玉米吐水中的殘留

摘要 本研究基于改進的QuEChERS前處理方法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了16種不同理化性質(zhì)的農(nóng)藥在玉米吐水中的殘留分析方法。利用乙腈提取玉米吐水樣品，經(jīng)ACQUITY UPLC^TMBEH C18色譜柱分離后用多反應(yīng)監(jiān)測模式進行定量分析，最后通過外標(biāo)法進行定量。結(jié)果表明：在0.1～1000μg／L范圍內(nèi)，16種供試農(nóng)藥的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積間均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，決定系數(shù)R²≥0.9971；定量限（limit of quantitation，LOQ）為0.1～0.7μg／L;在10、100μg／L和1000μg／L的3個添加濃度水平條件下，供試農(nóng)藥平均回收率均在77.3%～107.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）為1.7%～13.5%。運用該方法對玉米吐水樣品進行實測，16種農(nóng)藥均可被檢測出，其中啶蟲脒的檢出濃度最高（548.8μg／L）。該方法適用于玉米吐水中多種農(nóng)藥殘留的同時檢測。

關(guān)鍵詞 玉米；吐水；農(nóng)藥殘留；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號：O 657.63；S 481.8 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.16688／j.zwbh.2024161

吐水是植物通過葉片頂端或邊緣部分的水孔向外界排泄體內(nèi)多余水分的一種自然生理現(xiàn)象，普遍存在于玉米、小麥、蔬菜和瓜果等維管系統(tǒng)發(fā)達的作物中，對維持植物正常生長和衡量根系活性具有重要意義。區(qū)別于露水，吐水主要來源于植物體內(nèi)的木質(zhì)部汁液，其中含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，可為許多昆蟲提供穩(wěn)定的水源和營養(yǎng)來源。然而隨著農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的廣泛應(yīng)用，植物吐水中發(fā)現(xiàn)了較高水平的農(nóng)藥殘留。這給以吐水作為水源或營養(yǎng)來源的非靶標(biāo)昆蟲，尤其是蜜蜂等傳粉媒介昆蟲，帶來了潛在的生態(tài)健康威脅。因此，開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留分析檢測技術(shù)，不僅對于控制作物吐水中的農(nóng)藥殘留風(fēng)險至關(guān)重要，同時也是進行生態(tài)風(fēng)險評估的基礎(chǔ)。

玉米作為全球重要的糧食作物之一，在人類飲食和動物飼養(yǎng)中扮演著重要的角色。然而，在玉米植株生長過程中，病蟲害一直是嚴(yán)重威脅其產(chǎn)量和質(zhì)量的主要因素。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中目前普遍采用化學(xué)農(nóng)藥控制玉米病蟲害，而農(nóng)藥混施作為保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)對復(fù)雜病蟲害的常用策略，在提高作物產(chǎn)量的同時也伴隨著農(nóng)藥多殘留暴露的潛在環(huán)境問題。近年來，有關(guān)作物吐水中農(nóng)藥殘留的研究逐漸增多，但多是針對單一藥劑或同一類別的農(nóng)藥。考慮到實際田間環(huán)境下多為不同農(nóng)藥混施的情況，建立一種能夠同時檢測多種農(nóng)藥的殘留分析方法對于準(zhǔn)確評估作物吐水中的農(nóng)藥殘留很有必要。目前，國內(nèi)外尚未報道關(guān)于同時檢測玉米吐水中多種不同類型農(nóng)藥殘留的分析方法。

為了評估玉米吐水中不同類型農(nóng)藥的殘留水平，本研究基于改進的QuEChERS前處理方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS／MS），成功建立了一種在玉米吐水中同時檢測16種不同理化性質(zhì)農(nóng)藥殘留的分析方法。供試農(nóng)藥均在玉米田間應(yīng)用廣泛，包括7種新煙堿類殺蟲劑（烯啶蟲胺、呋蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲胺、吡蟲啉、啶蟲脒和噻蟲啉）、3種雙酰胺類殺蟲劑（溴氰蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟蟲雙酰胺）、3種三唑類殺菌劑（戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑和三唑酮）、1種咪唑類殺菌劑（咪鮮胺）、1種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（吡唑醚菌酯）和1種三嗪類除草劑（莠去津）。該分析方法對準(zhǔn)確性和回收率都進行了驗證，并基于該方法對采集的玉米吐水樣品進行了實際濃度檢測。這一研究方法的建立對于指導(dǎo)農(nóng)藥安全使用和預(yù)防生態(tài)環(huán)境風(fēng)險提供了重要支撐。

1材料與方法

1.1藥劑與試劑

16種供試農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分別為：98.8%烯啶蟲胺、99.9%呋蟲胺、97.0%噻蟲嗪、98.2%吡蟲啉、99.3%啶蟲脒、98.0%噻蟲胺、98.5%噻蟲啉、92.4%溴氰蟲酰胺、99.3%氯蟲苯甲酰胺、97.0%莠去津、98.0%三唑酮、98.0%咪鮮胺、99.0%戊唑醇、98.0%吡唑醚菌酯、98.0%氟蟲雙酰胺和99.1%苯醚甲環(huán)唑，均購自沈陽化工研究院農(nóng)藥檢測實驗室；供試玉米種子（品種為‘先玉335’）購自北京中蔬種業(yè)科技有限公司；樣品提取使用的分析純氯化鈉、無水硫酸鎂、甲酸、乙腈購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；色譜純乙腈購自北京精細化工有限公司；Filter Unit有機濾膜（規(guī)格為0.22μm）購自天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（美國Waters Acquity公司）；AB Sciex Q-trap 5 500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國ABSCIEX公司），配電噴霧離子源（ESI）；DT 500A電子天平（精度為±0.00001g，德國Sartorious公司）；Vortex-genie 2/2T渦旋混合儀（美國Scientific Industries儀器公司）；Heraeus Megafuge 8臺式高速離心機（美國Thermo fisher公司）；IQ-7003超純水制備系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.3檢測條件

1.3.1色譜條件

選用ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱（100mm×2.1 mm，1.7μm）進行色譜分離，柱溫為40℃；進樣量為3UL;流速為0.3 mL／min;以二元梯度洗脫分離，流動相A為甲酸乙腈（V/V=0.1%），流動相B為甲酸水溶液（V／V=0.1%）；運行洗脫時間為5 min。梯度洗脫條件詳見表1。

1.3.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），采用正離子模式進行掃描，離子源接口電壓為5500IPa;離子源接口溫度為300℃；噴霧氣（nebulizer gas，GS1）為氮氣，413.7MPa;輔助加熱氣（heating gas，GS2）為氮氣，413.7MPa；氣簾氣（curtain gas，CUR）為氮氣，206.85 MPa；碰撞氣為氮氣，噴撞氣（collisiongas，CAD）為氬氣，62.055MPa;在多反應(yīng)監(jiān)測（multiple response monitoring，MRM）條件下16種農(nóng)藥的主要質(zhì)譜參數(shù)詳見表2。

1.4樣品采集

在溫室盆栽條件下對玉米進行農(nóng)藥暴露試驗以獲取玉米吐水樣品。供試土壤采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所試驗地塊表層土（0～20cm）。將采集的土壤在溫室中風(fēng)干，過篩（2mm）以去除石塊、根系等雜質(zhì)。稱取400g土壤于花盆中，播入玉米種子并澆水，待植株生長至拔節(jié)期，采用根部澆灌的施藥方式將10 mL濃度均為1 mg／L的1 6種混合農(nóng)藥施加于植株根部，每天補充水分使盆栽保持在最大持水量的70%左右。將不施藥的玉米盆栽作為空白對照，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。于施藥后第7天的清晨，通過移液槍收集植株葉片上的吐水，并裝入離心管中，在-20℃下保存。

1.5樣品前處理

玉米吐水樣品：準(zhǔn)確量取1 mL吐水樣品至10 mL離心管中，加入2mL乙腈，渦旋振蕩10 min，加入1g NaCl，再次渦旋振蕩5min，4000r／min離心5 min，然后用2mL無菌注射器吸取上清液，過0.22μm有機濾膜并進樣分析。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

準(zhǔn)確稱取16種供試農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純乙腈配制成100 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｈ? mL空白對照玉米吐水樣品置于10mL離心管中，按照1.5節(jié)前處理方法進行提取，獲得空白基質(zhì)溶液。利用空白基質(zhì)對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行梯度稀釋，制備出0.1、1、10、100、500μg／L和1000μg／L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液。在已設(shè)定的1.3節(jié)檢測條件下進樣檢測。針對16種目標(biāo)農(nóng)藥，以峰面積為縱坐標(biāo)（y），對應(yīng)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度（x，μg／L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7添加回收試驗及基質(zhì)效應(yīng)評價

向空白對照玉米吐水樣品中添加3個濃度水平（10、100μg／L和1000μg／L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平設(shè)置5個重復(fù)，按照1.5節(jié)的方法進行樣品前處理和1.3節(jié)的儀器檢測條件進行測定，所得結(jié)果計算平均添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。16種農(nóng)藥在基質(zhì)樣品中的定量限（limit of quantitation，LOQ）采用10倍信噪比（S/N）進行確定。

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品基質(zhì)對分析檢測方法靈敏度造成的影響，對準(zhǔn)確測定亦會造成干擾。基質(zhì)效應(yīng)指標(biāo)（Me）計算公式如下：

若-20%≤Me≤20%，則說明基質(zhì)對于目標(biāo)化合物檢測信號影響較小，基質(zhì)效應(yīng)不顯著；若Melt;-50%或Megt;50%，則認為基質(zhì)效應(yīng)較高，對定量結(jié)果的干擾較大；若20%

2結(jié)果與討論

2.1前處理方法的確定

由于乙腈在色譜分析中具有良好的兼容性，并且不會對色譜柱和檢測器造成不良影響，因此本方法采用乙腈作為單一溶劑來提取目標(biāo)農(nóng)藥。玉米吐水是一種清澈透明的液體，相對于植物組織樣品，它的基質(zhì)更為簡單，僅含有植物激素、蛋白質(zhì)和微量礦物質(zhì)元素等有機和無機成分。因此，其中的目標(biāo)農(nóng)藥易于直接提取和分析，該樣品在提取過程中未使用凈化劑。

2.2儀器檢測條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件優(yōu)化

當(dāng)流動相的有機相組分和水相組分分別設(shè)置為常規(guī)使用的色譜純乙腈和超純水時，儀器對16種待測農(nóng)藥的檢測靈敏度普遍較低。因此，可在流動相中添加一定體積的甲酸以達到提高供試農(nóng)藥的離子化效率和峰形質(zhì)量的目的。經(jīng)過不斷優(yōu)化流動相組成比例后，確定流動相條件為：有機相為0.1%（V/V）甲酸乙腈，水相為0.1%（V/V）甲酸水溶液，流速為0.3mL／min，柱溫設(shè)為35℃。基于該方法檢測的各目標(biāo)農(nóng)藥的離子色譜圖如圖1所示，可以觀察到供試藥劑在儀器檢測中均呈現(xiàn)出清晰的峰形和較高的響應(yīng)。通過進一步優(yōu)化色譜柱的梯度分離洗脫程序（表1），16種目標(biāo)農(nóng)藥的各監(jiān)測離子在5min內(nèi)均實現(xiàn)了有效分離。

2.2.2質(zhì)譜條件優(yōu)化

在進行多組分農(nóng)藥殘留分析時，考慮到目標(biāo)農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，所有化合物均通過電噴霧離子源正離子模式（ESI⁺）電離，并以形成的質(zhì)子化分子離子（[M+H]⁺）作為前體離子進行檢測。通過使用濃度為10.0μg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對相關(guān)參數(shù)進行優(yōu)化，首先進行母離子掃描，以確定各農(nóng)藥的母離子，然后實施子離子掃描，選取2個信號強度較高的子離子碎片用于農(nóng)藥的確證和量化分析。最后調(diào)整并優(yōu)化去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）等參數(shù)，確保所選農(nóng)藥的子離子碎片信號為最優(yōu)化。

2.3方法線性范圍、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

利用乙腈和玉米吐水分別作為空白對照來配制溶劑和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白樣品中未檢測到任何供試農(nóng)藥。如表3所示，在質(zhì)量濃度為0.1～1000μg／L范圍內(nèi)，16種供試農(nóng)藥在各基質(zhì)樣品中均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（R2≥0.9971）。以10倍信噪比（S／N）計算得16種農(nóng)藥的定量限（LOQ）為0.1～0.7μg／L，16種供試農(nóng)藥在玉米吐水中的基質(zhì)效應(yīng)介于-63%～21%之間，其中烯啶蟲胺、溴氰蟲酰胺和苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)出較高的基質(zhì)效應(yīng)，分別為-61%、-53%和-63%，受基質(zhì)干擾較大。噻蟲胺、氯蟲苯甲酰胺、三唑酮和氟蟲雙酰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為-4%、4%、-20%和-10%，沒有明顯的基質(zhì)效應(yīng)。因此，為了最大程度彌補基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果的影響，提高檢測方法的準(zhǔn)確性，本研究采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對實際樣品進行定量分析。

2.4方法的準(zhǔn)確度和精密度

各供試農(nóng)藥通過優(yōu)化提取和檢測分析后得到的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果如表4所示，16種農(nóng)藥的平均回收率均介于77.3%～107.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）介于1.7%～13.5%之間，以上數(shù)據(jù)均滿足農(nóng)藥殘留分析標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確度和精密度要求。

2.5實際樣品檢測

通過已建立的多殘留分析方法對收集的玉米吐水樣品進行農(nóng)藥殘留檢測，結(jié)果如圖2所示，在暴露于相同劑量的16種供試農(nóng)藥后，這些農(nóng)藥在吐水中均可被檢出，其中啶蟲脒、吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲啉在吐水中檢測到有較高濃度水平的農(nóng)藥殘留（382.5～548.8μg／L）；咪鮮胺、吡唑醚菌酯、氟蟲雙酰胺和苯醚甲環(huán)唑的殘留水平較低。農(nóng)藥的疏水性（K_ow）是影響農(nóng)藥在植物體內(nèi)吸收和遷移的關(guān)鍵影響因素，農(nóng)藥的lg K_ow值越高，其疏水性越強，從根部進入植物體內(nèi)后更容易被根部的脂質(zhì)組織保留而難以向上轉(zhuǎn)運。本研究中16種農(nóng)藥具有較為寬泛的K_ow值（-0. 66～4.36），這可能是導(dǎo)致它們在吐水中殘留濃度水平差異較大的原因。對于疏水性較強的農(nóng)藥（如氟蟲雙酰胺和苯醚甲環(huán)唑的lgK_ow值分別為4.14和4.36），它們更容易在玉米植株的根部富集，因此在吐水中濃度較低。相反，疏水性較低的農(nóng)藥（如啶蟲脒、吡蟲啉的lg K_ow值分別為0.80和0.57）容易被玉米植株吸收并向地上部分轉(zhuǎn)運，因此在吐水中殘留濃度較高。

3結(jié)論

本研究建立了一種基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（HPLC-MS／MS）的農(nóng)藥殘留測定檢測方法，樣品經(jīng)改進后的QuEChERS方法進行前處理，最終成功檢測了玉米吐水中16種不同理化性質(zhì)農(nóng)藥的殘留。結(jié)果表明，在3個添加水平下，16種農(nóng)藥的平均回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足農(nóng)藥殘留測定標(biāo)準(zhǔn)要求。所用儀器和樣品檢測方法具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，可滿足玉米吐水中農(nóng)藥多殘留分析的要求，并可用于大量樣品的快速檢測，該方法可為作物吐水中農(nóng)藥殘留的分析和生態(tài)風(fēng)險評估提供重要方法基礎(chǔ)。