扶桑綿粉蚧優(yōu)良病原真菌的篩選及其初步應(yīng)用

摘要 為獲得防控扶桑綿粉蚧Phenacoccus solenopsis的病原真菌優(yōu)良菌株，本研究測定比較了3種昆蟲病原真菌4個(gè)菌株的致病力、環(huán)境耐受力和胞外酶活性，并結(jié)合掃描電鏡觀察和溫室防控效果，進(jìn)一步評價(jià)供試菌株的應(yīng)用潛力。致病力、胞外酶活性和農(nóng)藥耐受力測定結(jié)果表明，爪哇蟲草CordycePs javanica IJID003和131D-1的致病力、農(nóng)藥耐受力和胞外酶活性顯著大于淡紫紫孢霉Purpureocillium lilacinum 12ID-1和木賊鐮刀菌Fusarium eq-uiseti FE-1；紫外輻射耐受力比較顯示，經(jīng)UV暴露處理60 min和120 min后，菌株UID003孢子萌發(fā)率分別為98.50%、80.75%，顯著高于其余3個(gè)菌株。掃描電鏡觀察表明，菌株UID003侵染扶桑綿粉蚧的方式是在接觸表皮處形成膨大的附著胞，進(jìn)而進(jìn)入昆蟲體腔；溫室盆栽扶桑上使用濃度為5×10⁸cfu／mL IJID003菌株孢子懸浮液接種后8d，對扶桑綿粉蚧防效達(dá)到91.17%。爪哇蟲草IJID003為防控扶桑綿粉蚧的優(yōu)勢病原真菌，具有開發(fā)為生防制劑的前景。

關(guān)鍵詞 扶桑綿粉蚧；昆蟲病原真菌；毒力測定；環(huán)境耐受力

中圖分類號：S 476.12 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI： 10.16688／j.zwbh.2024229個(gè)縣（區(qū)、市）記錄了扶桑綿粉蚧的發(fā)生，呈現(xiàn)“南害北移”擴(kuò)散態(tài)勢，對經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物和農(nóng)林植物造成極大的損害，嚴(yán)重威脅我國農(nóng)林生產(chǎn)和生物安全。扶桑綿粉蚧的治理方式仍以傳統(tǒng)的化學(xué)防治為主，而反復(fù)和過度地使用化學(xué)藥劑，不僅引起扶桑綿粉蚧的抗藥性問題，同時(shí)對自然中的昆蟲天敵種群造成較大的影響。因此，亟須發(fā)展針對扶桑綿粉蚧環(huán)境友好型的防治策略，而生物防治方法是替代化學(xué)農(nóng)藥使用、實(shí)現(xiàn)綠色治理的有效途徑。其中，昆蟲病原真菌的有效利用是控制害蟲的生物防治方法之一，因其資源豐富、廣譜高毒力、對環(huán)境友好且易制劑化等優(yōu)點(diǎn)而在害蟲的生物防治中占據(jù)重要的地位。國內(nèi)外針對扶桑綿粉蚧優(yōu)勢病原真菌挖掘的研究，主要通過致病力測定來評價(jià)其應(yīng)用潛力。有研究從扶桑綿粉蚧僵蟲中分離到一株白曲霉Asper-gillus candidus菌株，回接后發(fā)現(xiàn)對扶桑綿粉蚧的室內(nèi)致死率可達(dá)95.00%。由此可見，致病力的測定是評價(jià)昆蟲病原真菌應(yīng)用潛力最直觀的方法。昆蟲病原真菌在進(jìn)入昆蟲體腔之前，需要分泌胞外酶才能穿透昆蟲體壁，除了菌株致病力以外，胞外酶活力也是評價(jià)昆蟲病原真菌毒力的重要指標(biāo)。其中，不少研究都表明Pr1蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性是體現(xiàn)病原真菌毒力的主要指標(biāo)，可為扶桑綿粉蚧高毒力菌株的篩選做參考。另外，在將昆蟲病原真菌用于生物防治時(shí)，不僅需要確保所選真菌分離株的毒力、產(chǎn)孢力和持久性等最大化，也要注意對非目標(biāo)昆蟲毒性的最小化和對非生物因素（如紫外輻射、農(nóng)藥影響和相對溫濕度等）的耐受性良好，這些因素都會影響昆蟲病原真菌在田間的應(yīng)用。目前，有關(guān)扶桑綿粉蚧優(yōu)勢病原真菌的篩選，在毒力和環(huán)境耐受力維度的研究尚無系統(tǒng)的報(bào)道。前期對分離于介殼蟲僵蟲中的4株病原真菌進(jìn)行了回接試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這4株病原真菌菌株均能侵染扶桑綿粉蚧，致其死亡。本文探討4株扶桑綿粉蚧病原真菌菌株的毒力和環(huán)境耐受力，挖掘優(yōu)良菌株；結(jié)合掃描電鏡觀察和溫室防控效果，進(jìn)一步評價(jià)供試菌株的應(yīng)用潛力，為后期扶桑綿粉蚧生防制劑的研究提供有應(yīng)用潛力的菌種資源和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

試驗(yàn)于2023年在廣州市林業(yè)和園林科學(xué)研究院植物保護(hù)研究所（23.16°N，113.28°E）完成。

1.1試驗(yàn)材料

供試菌株：爪哇蟲草Cordyceps jaoanica IJID003、爪哇蟲草13ID-1和淡紫紫孢霉Purpureocilliumlilacinum 12ID-1菌株均從廣州越秀公園白蘭Michelia×alba上的埃及吹綿蚧Icerya aegyptiaca分離得到；木賊鐮刀菌Fusarium equiseti FE-1分離自上海市扶桑Hibiscus rosa-sznensis上的扶桑綿粉蚧僵蟲。

供試?yán)ハx：扶桑綿粉蚧在2023年6月采集于廣州越秀公園（23.14°N，113.27°E）的扶桑植株上，并在扶桑植株上常年繼代飼養(yǎng)，形成穩(wěn)定健康的種群。

供試農(nóng)藥及使用濃度：200g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑（先正達(dá)南通作物有限公司）0.13g／L; 70%吡蟲啉水分散粒劑（深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司）0.03／L；25g／L高效氯氰菊酯微囊懸浮劑（先正達(dá)南通作物有限公司）0.50g／L;156g／L丙環(huán)唑乳油（先正達(dá)南通作物有限公司）0.20g／L;50%硫磺·三唑酮懸浮劑（江門市大光明農(nóng)化新會有限公司）0.67g/L;0.3%印楝素乳油（成都綠金生物科技有限責(zé)任公司）0.01g／L;18%吡蟲啉·噻嗪酮懸浮劑（山東榮邦化工有限公司）0.09g／L。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：0.50% NaCl、0.10%（NH₄）₂ SO₄、0.03% MgSO₄·7H₂O、0.20% NaNO₃、0.40%

KH₂ PO₄、1% K₂ HPO₄。

扶桑綿粉蚧表皮培養(yǎng)基：參考董晶等收集介蟲蠟泌物和體壁的方法并稍作改進(jìn)。將扶桑綿粉蚧雌成蟲從枝條上取下，先收集蟲體蠟泌物，再用刀片稍微切開蟲體表皮，用昆蟲針清除內(nèi)臟，保留體壁，置于無菌水中清洗干凈，于烘箱中60℃烘干。將烘干的體壁和蠟泌物加入液氮研磨成粉末，于60℃烘箱中再次烘干，待用。稱取烘干粉末0.20g，加入含40 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中。

蔗糖蛋白胨液體：蔗糖含量50g/L，蛋白胨含量6 g／L。

以上培養(yǎng)基均置于高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌120℃，30 min。

1.2毒力測定

1.2.1 4個(gè)菌株對扶桑綿粉蚧雌成蟲的致病力測定

采集帶有健康葉片的扶桑嫩綠枝條，用無菌水沖洗，并用75%乙醇擦凈葉片枝條，將枝條插進(jìn)浸水的花泥，置于13cm方形培養(yǎng)皿中，挑選個(gè)頭相對一致的扶桑綿粉蚧雌成蟲移至葉片上。分別配制1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵cfu／mL和1×10⁴cfu／mL共5個(gè)濃度梯度的病原真菌分生孢子懸浮液，用小型噴霧器將1mL孢子懸浮液均勻噴至扶桑綿粉蚧蟲體上，每重復(fù)40頭試蟲并設(shè)3個(gè)重復(fù)，用Parafilm封口膜封培養(yǎng)皿，防止試蟲逃逸。將培養(yǎng)皿置于28℃、L∥D=10h∥14h和相對濕度75%的人工氣候培養(yǎng)箱中，每天檢查并記錄試蟲的死亡數(shù)，觀察7d，以蟲體表面覆蓋菌絲且無活動能力確定為有效致死。應(yīng)用SPSS 22.0軟件的probit analysis，計(jì)算致死中時(shí)間LT₅₀和致死中濃度LC₅₀。

1.2.2胞外酶活性測定

類枯草桿菌Pr1蛋白酶活性測定：分別取10mL濃度為1×10⁷ cfu／mL的4個(gè)菌株孢子懸浮液，加入40 mL表皮培養(yǎng)基，于溫度28℃，170r／min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7d，取上清液作為反應(yīng)的粗酶液。以Suc-（Ala）₂-Pro-Phe-pNA（ Sigma-Aldrich）作為反應(yīng)底物，將30μL粗酶液、30μL底物（1.5×10^-3 mol／L）和30μL Tris-HCl（0.05 mol／L，pH 8.0）依次加入到96孔酶標(biāo)板中，充分混勻后，28℃反應(yīng)20min，然后加入110μL預(yù)冷的冰乙酸終止反應(yīng)。空白對照將上述反應(yīng)體系中的底物用30μL二甲基亞砜代替。最后利用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)液在410 nm處的吸光度。根據(jù)硝基苯胺含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性，每個(gè)酶活性單位定義為每分鐘催化分解Suc-（Ala）₂-Pro-Phe-pNA生成1μg硝基苯胺的酶量。

幾丁質(zhì)酶活性測定：參照董晶等的方法稍作改進(jìn)，將0.5 mL粗酶液與0.5mL膠狀幾丁質(zhì)混合，在水浴鍋中，37℃反應(yīng)4h；然后8000g離心5 min終止酶解反應(yīng)。離心后，吸取900μL上清液，然后加入90μL四硼酸鉀溶液，充分搖勻后沸水浴中反應(yīng)5 min，迅速用自來水冷卻至室溫，然后再加入1%二甲氨基苯甲醛試劑2.7mL，同樣在37℃水浴20 min，再次用自來水冷卻至室溫，用紫外分光光度計(jì)測定585 nm處的吸光度。根據(jù)N-乙酰氨基葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。幾丁質(zhì)酶活性單位定義為每分鐘催化分解幾丁質(zhì)生成1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量。

1.3環(huán)境耐受力測定

1.3.1農(nóng)藥耐受力測定

供試6種農(nóng)藥按照包裝推薦的常規(guī)使用濃度進(jìn)行配制。在5 mL離心管中加入配制好的濃度為1×10⁷ cfu／mL的孢子懸浮液10μL，并加入3 mL蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并按上述使用濃度加入供試藥劑，混勻。在28℃，170r／min的條件下培養(yǎng)20 h后統(tǒng)計(jì)孢子的萌發(fā)率，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.2紫外線輻射耐受力測定

分別取1.5 mL 4個(gè)菌株孢子懸浮液（1×10⁷ cfu／mL）于一次性培養(yǎng)皿中心（直徑為3 cm），打開培養(yǎng)皿蓋，將培養(yǎng)皿置于20 W紫外燈下45 cm處（約270μW／cm²）的勻速旋轉(zhuǎn)儀（20r／min）上照射，設(shè)置照射時(shí)間分別為10、30、60、120、180min，照射處理后取1mL孢子懸浮液于5 mL離心管中，并加入2mL蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，于28℃、170r／min搖床中培養(yǎng)20h，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，以未經(jīng)紫外線處理的孢子懸浮液作為對照，每處理3次重復(fù)。

1.4掃描電鏡（SEM）觀察UID003的侵染過程

參考董晶等的方法，將扶桑綿粉蚧雌成蟲在含0.02%吐溫-80的IJID003菌株孢子懸浮液（1×10⁷ cfu／mL）中浸蘸接種，晾干表面水分后，置于1%水瓊脂板上。用無菌蒸餾水處理扶桑綿粉蚧作為對照。樣品培養(yǎng)2d后可見菌絲侵染蟲體表面，用2.5%戊二醛4℃過夜固定，待脫水干燥。將過夜固定的扶桑綿粉蚧接種蟲體進(jìn)行前處理，置于臨界點(diǎn)干燥儀（EMS850，美國Electron Microscopy Sci-ences公司）進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，離子濺射儀（E-1010，日本日立公司）噴金，在掃描電子顯微鏡（S-3000N，日本日立公司）下觀察。

1.5優(yōu)勢菌株在溫室大棚的初步應(yīng)用

防治試驗(yàn)于2023年9月中旬在廣州市林業(yè)和園林科學(xué)研究院溫室大棚中進(jìn)行。共設(shè)3個(gè)處理：處理組1，配制優(yōu)勢菌株濃度為5×10⁸cfu／mL分生孢子懸浮液50 mL;處理組2，配制18%吡蟲啉·噻嗪酮懸浮劑0.09 g／L，50 mL;處理組3，清水50 mL作為對照組。10盆扶桑為1個(gè)重復(fù)，每處理設(shè)置3次重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組法排列。在每盆扶桑植株上接種扶桑綿粉蚧若蟲40頭，飼養(yǎng)至每株適宜的蟲口密度（200頭）并將多余的若蟲清理。選擇9月中旬雨后濕潤天氣（溫度28～30℃，濕度70%～80%），使用手持噴霧器（MS-BP02，臺州明升塑業(yè)）將藥液噴至葉片正反面，使蟲體充分與藥劑接觸，對照組噴等量清水。施藥后每天下午定時(shí)在試驗(yàn)區(qū)域植株上噴施水霧，保持植株周圍空氣濕潤。在藥劑處理后的第2、4、6、8天，觀察扶桑綿粉蚧蟲體侵染情況，統(tǒng)計(jì)致死蟲數(shù)，其中表面有菌絲覆蓋且無活動能力計(jì)為有效致死，并計(jì)算各處理組蟲口減退率及防治效果。

蟲口減退率=（施藥前活蟲數(shù)-施藥后活蟲數(shù)）／施藥前活蟲數(shù)×100%；

防效=[（處理區(qū)蟲口減退率-對照區(qū)蟲口減退率）／（1-對照區(qū)蟲口減退率）]×100%。

1.6數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性；最后用Prism 8.0繪圖軟件制圖。

2結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)菌株對扶桑綿粉蚧雌成蟲的致病力比較

用爪哇蟲草IJID003和131D-1、木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉121D-1的孢子懸浮液接種扶桑綿粉蚧雌成蟲，連續(xù)觀察雌成蟲的感染癥狀。結(jié)果顯示，接種后第2天，扶桑綿粉蚧雌成蟲活動力下降至無活動能力，蟲體表面開始出現(xiàn)少量菌絲。接種后第3天，蟲體表面出現(xiàn)大量菌絲覆蓋；接種后第4天，扶桑綿粉蚧蟲體表面逐漸被菌絲覆蓋，并開始產(chǎn)生分生孢子（圖1）。

經(jīng)濃度1×10⁷ cfu／mL的病原真菌孢子懸浮液接種后（圖2），隨著接種后天數(shù)的增加，扶桑綿粉蚧累計(jì)校正死亡率也隨之增加，且爪哇蟲草IJID003和131D-1處理組的累計(jì)校正死亡率顯著大于木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉121D-1處理組；其中，在接種后2d，爪哇蟲草IJID003和131D-1、木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉121D-1處理組累計(jì)校正死亡率分別為（ 30. 00±5.00）%、（27.50±2.50）%、（7.50±2.50）%和（6.67±1.73）%，而在接種后7 d，累計(jì)校正死亡率分別為（97. 22±2.78）%、（100.00±0.00）%、（75.00±2.78）%和（79. 63±1.85）%;可見，爪哇蟲草IJID003和131D-1的侵染速度顯著大于木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉121D-1。

另外，爪哇蟲草IJID003和131D-1對扶桑綿粉蚧的LTso（表1）和LCso（表2）均顯著小于木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉121D-1。因此，綜合致病力測定結(jié)果，相比木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉121D-1，爪哇蟲草IJID003和131D-1對扶桑綿粉蚧雌成蟲具更快的侵染速度和更高的致病力。

2.2 4個(gè)菌株的胞外酶活性變化

2.2.1類枯草桿菌Pr1蛋白酶活性

爪哇蟲草IJID003、131D-1，木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉121D-1在表皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～5 d，Prl蛋白酶活性均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在第3天達(dá)到最大值（圖3），分別為（2.73±0.01） （2.63±0.10） （1.94±0.16）和（1.73±0.02） U／mL，且爪哇蟲草IJID003、131D-1的Pr1蛋白酶活性顯著高于木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉12ID-1。4個(gè)菌株分別在表皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)9d后，Prl蛋白酶活性分別為（1.65±0.01） （1.67±0.03） （0.44±0.02）和（1.14±0.03） U／mL。綜上可見，爪哇蟲草IJID003、131D-1的Prl蛋白酶活性顯著高于木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉121D-1。

2.2.2幾丁質(zhì)酶活性

爪哇蟲草菌IJID003、131D-1，木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉121D-1在表皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其幾丁質(zhì)酶活性均表現(xiàn)出隨時(shí)間呈先升高后降低的趨勢，并在第7天達(dá)到最大值（圖4），分別為（38.91±0.53）（37.91±0.31） （31. 32±0.24） U／mL和（26.41±0.08） U／mL，且爪哇蟲草菌IJID003、13ID-1的幾丁質(zhì)酶活性顯著高于木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉121D-1。在表皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)9d，4個(gè)菌株幾丁質(zhì)酶活性分別為（22.68±0.34） （22.32±0.24） （16.11±0.40）U／mL和（13.88±0.34） U／mL。綜上可見，爪哇蟲草菌IJID003、13ID-1的幾丁質(zhì)酶活性顯著高于木賊鐮刀菌FE-1和淡紫紫孢霉12ID-1。

2.3 4個(gè)菌株的環(huán)境耐受力比較

2.3.1農(nóng)藥的耐受力比較

6種化學(xué)藥劑對4個(gè)菌株孢子萌發(fā)影響試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，在用防治刺吸式害蟲的化學(xué)藥劑氯蟲苯甲酰胺、吡蟲啉處理4個(gè)菌株孢子懸浮液后，爪哇蟲草IJID003和13ID-1、淡紫紫孢霉12ID-1的孢子萌發(fā)率顯著大于木賊鐮刀菌FE-1，其中爪哇蟲草IJID003和13ID-1孢子萌發(fā)率分別為97.50%、92.00%和96.25%、91.25%，淡紫紫孢霉12ID-1的孢子萌發(fā)率為84.75%、94.75%，而木賊鐮刀菌FE-1的孢子萌發(fā)率57.5%、5.25%。另外，用6種不同藥劑處理爪哇蟲草IJID003和13ID-1孢子懸浮液后，其孢子萌發(fā)率均高于90%。可見，爪哇蟲草IJID003和13ID-1對農(nóng)藥表現(xiàn)出較好的耐受力，與化學(xué)藥劑相容性較好。

2.3.2紫外線輻射耐受力比較

4個(gè)菌株暴露于紫外輻射不同時(shí)間的孢子萌發(fā)率如表4所示。紫外照射處理10min，4個(gè)菌株的孢子萌發(fā)率均較高，其中菌株IJID003、131D-1和12ID-1的孢子萌發(fā)率分別為98.75%、96.25%和98.25%，三者無顯著差異，但顯著高于菌株FE-1（89.25%）。紫外照射處理30 min，菌株IJID003和13ID-1的孢子萌發(fā)率分別為99.00%和95.75%，顯著高于菌株12ID-1和FE-1。而紫外照射處理60 min和120 min時(shí)，菌株IJID003孢子萌發(fā)率分別為98.50%和80.75%，顯著高于其余3個(gè)菌株。另外，紫外照射處理180 min后，4個(gè)菌株孢子萌發(fā)率均較低，無顯著差異。可見，爪哇蟲草IJID003對紫外線輻射具有較好的耐受力。

結(jié)合致病力測定和胞外酶測定結(jié)果，爪哇蟲草菌株IJID003和13ID-1的致病力和胞外酶活力顯著大于淡紫紫孢霉12ID-1和木賊鐮刀菌FE-1。環(huán)境耐受力測定發(fā)現(xiàn)，菌株IJID003和13ID-1對農(nóng)藥表現(xiàn)出較好的耐受力，同時(shí)菌株IJID003還具有較好的紫外輻射耐受力。綜合以上結(jié)果，將爪哇蟲草IJID003確定為扶桑綿粉蚧最優(yōu)生防真菌。

2.4菌株UID003在扶桑綿粉蚧體壁上的侵染過程

通過掃描電鏡（SEM）觀察，由圖5可見，菌株IJID003分生孢子附著寄主表皮后，萌發(fā)所形成的芽管先在昆蟲體壁水平生長，在接觸表皮處形成膨大的附著胞，進(jìn)一步進(jìn)入昆蟲體腔，完成侵染致病過程。

2.5菌株UID003對溫室扶桑綿粉蚧的防效

分別用5×10⁸cfu／mL濃度的菌株IJID003孢子懸浮液和化學(xué)藥劑18%吡蟲啉·噻嗪酮懸浮劑0.09g／L在溫室進(jìn)行扶桑綿粉蚧防治試驗(yàn)，由圖6可見，盆栽扶桑上的扶桑綿粉蚧經(jīng)菌株IJID003接種后第4天開始出現(xiàn)明顯的感染癥狀；在接種后第6天，發(fā)現(xiàn)扶桑植株上有更多的扶桑綿粉蚧感染，且在后期蟲體表面逐漸產(chǎn)生分生孢子，覆蓋蟲體體表。另外，在接種后20d，發(fā)現(xiàn)有扶桑綿粉蚧低齡若蟲出現(xiàn)侵染，可見扶桑綿粉蚧蟲體產(chǎn)生的分生孢子又形成新的侵染。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表5）表明，經(jīng)化學(xué)藥劑處理后8d，對扶桑綿粉蚧的防效為97.10%；爪哇蟲草IJID003接種后8d，對扶桑綿粉蚧的防效可達(dá)91.17%，與化學(xué)藥劑無顯著差異，具有較好的室外侵染能力。

3結(jié)論與討論

昆蟲病原真菌影響宿主發(fā)育和生殖過程，并最終導(dǎo)致宿主死亡，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有750～1000種真菌對昆蟲具有致病性。前人針對扶桑綿粉蚧病原真菌的挖掘篩選，主要利用其他種類寄主來源的病原真菌菌株，而對來源于扶桑綿粉蚧或介殼蟲等的病原真菌的挖掘篩選研究較少。通常來自原寄主的病原真菌對防治同種靶標(biāo)具有更高的毒力或?qū)Ｒ恍浴Ｎ闹械淖ν巯x草、淡紫紫孢霉和木賊鐮刀菌均屬絲狀真菌，在適宜的環(huán)境條件下，分生孢子萌發(fā)后均能在寄主體表快速產(chǎn)生絲狀菌絲水平生長，在較短時(shí)間內(nèi)可以將蟲體體表包裹，因此3種病原真菌侵染扶桑綿粉蚧后病程發(fā)展均較快，這與電鏡的觀察結(jié)果是一致的。然而，體表附著階段及孢子萌發(fā)階段僅僅是侵染過程的開始，穿透寄主體表并分泌毒素才能引起致病，定殖能力強(qiáng)、毒素的有效分泌是蟲生真菌致病的關(guān)鍵。有較多研究表明，致病力和胞外酶活性均能體現(xiàn)昆蟲病原真菌的毒力，且致病力與Pr1蛋白酶及幾丁質(zhì)酶活性呈正相關(guān)，因此可將其作為菌株毒力篩選時(shí)的核心指標(biāo)。本文除了進(jìn)行最直觀的致病力評價(jià)之外，還將4株病原真菌菌株置于寄主表皮培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)并進(jìn)行胞外酶活力測定。Pr1蛋白酶和幾丁質(zhì)酶是病原真菌是參與昆蟲體壁穿透的關(guān)鍵胞外酶，爪哇蟲草分泌的Pr1蛋白酶活性在第3天達(dá)到最大值，且在第7天達(dá)到小高峰，而幾丁質(zhì)酶活性則在第7天達(dá)到最大值。由于昆蟲的外表皮層由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)鑲嵌構(gòu)成，內(nèi)表皮層由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)鑲嵌構(gòu)成，可見爪哇蟲草可以根據(jù)昆蟲表皮結(jié)構(gòu)組成，先后大量分泌相關(guān)胞外酶降解昆蟲體壁，該結(jié)果與前人結(jié)果一致的。爪哇蟲草的致病力與胞外酶活力均表現(xiàn)突出的優(yōu)勢，為優(yōu)良真菌的篩選提供最關(guān)鍵的參考。

昆蟲病原真菌對環(huán)境比較敏感，許多非生物因素例如紫外線、溫度、濕度和化學(xué)藥劑等，都會影響真菌存活、繁殖和感染、殺死宿主的能力。其中，昆蟲病原真菌在田間難以避免與農(nóng)藥相遇，一些農(nóng)藥會對菌株的生長產(chǎn)生抑制作用，但抑制程度各不相同，篩選出與農(nóng)藥相容性較好的菌株具有現(xiàn)實(shí)意義。本研究發(fā)現(xiàn)爪哇蟲草與供試藥劑均具有較好的相容性，其中與常用防治介殼蟲的內(nèi)吸性藥劑吡蟲啉、氯蟲苯甲酰胺也表現(xiàn)較好的相容性，這與前人的研究結(jié)果是一致的，這也為爪哇蟲草菌與內(nèi)吸性藥劑混配防治扶桑綿粉蚧，減少化學(xué)用藥提供參考。另外，紫外線也是決定昆蟲病原真菌田間應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素之一，選擇對紫外線輻射耐受力好的菌株至關(guān)重要。昆蟲病原真菌對紫外線輻射耐受性的物種間和物種內(nèi)的差異均有報(bào)道，選擇對UV-B輻射具有更強(qiáng)耐受力的昆蟲病原真菌菌株是減少太陽輻射有害影響，提高菌株利用效率的有效策略。本文發(fā)現(xiàn)爪哇蟲草IJID003和13ID-1對紫外線輻射的耐受性明顯強(qiáng)于淡紫紫孢霉12ID-1和木賊鐮刀菌FE-1，而菌株UID003對紫外線輻射的耐受能力最強(qiáng)。本文中同一地理來源的爪哇蟲草IJID003和13ID-1，在紫外線輻射處理60～120 min后孢子萌發(fā)表現(xiàn)出種內(nèi)差異，可能是蟲生真菌為了適應(yīng)周邊環(huán)境而出現(xiàn)的耐逆性能的變化。比如，Jarons-ki發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌Beauveria bassiana（Bals.-Criv.）Vuill.GHA菌株孢子活力在沒有遮蔭的上部葉片表面下降速度更快（每天47%），而在葉片底部的下降速度較慢（每天9%～11%）。菌株的紫外抗逆性狀直接關(guān)乎其田間防效和穩(wěn)定性，后期研究應(yīng)針對爪哇蟲草菌進(jìn)一步挖掘抗紫外線輻射強(qiáng)的菌株。

綜上，本研究經(jīng)過毒力和環(huán)境耐受力測定，篩選得到對扶桑綿粉蚧具高毒力且對農(nóng)藥和紫外線耐受力好的優(yōu)勢菌株爪哇蟲草IJID003。該類真菌寄主廣泛，產(chǎn)孢量大，是具有微生物制劑開發(fā)前景的候選菌種，研究結(jié)果為后期的產(chǎn)品制備以及改良提供了理論基礎(chǔ)。