交配前后雌性橘小實蠅觸角和腦部組織比較轉錄組分析

摘要 橘小實蠅Bactrocera dorsalis是我國水果產業的重要害蟲，雌蟲初次交配后再次交配的行為有明顯變化，這種變化可能受神經系統調節。本研究通過行為學試驗觀察12日齡的橘小實蠅成蟲初次交配后連續4d的再交配行為；利用高通量測序技術分別對交配前后橘小實蠅雌蟲的觸角及腦組織進行轉錄組測序，分析交配前后差異表達的基因；以Plt;10^-4為標準篩選交配后雌蟲腦組織中與交配行為變化相關的候選基因，并利用qPCR對候選基因轉錄水平進行驗證；利用生物信息學方法在全基因組中鑒定候選基因的基因家族成員并分析其在外周神經組織中的表達模式。結果表明，初次交配后連續4d橘小實蠅雄蟲交配率均在94%以上，而雌蟲在未產卵的情況下交配率均低于11%；與未交配狀態相比，交配后橘小實蠅雌蟲觸角組織中有1個基因的轉錄顯著上調，3個基因顯著下調；腦組織中有20個基因顯著上調，22個基因顯著下調。從交配后雌蟲腦組織中20個上調基因中共篩選到5個候選差異基因，其中2個屬于卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）基因家族，3個屬于類蛻皮素激酶（ecdysteroid kinase-like，EcKL）基因家族；橘小實蠅全基因組中共鑒定到59個EcKL基因家族成員和11個Vg基因家族成員，其中49個EcKL和9個Vg在腦和外周神經組織中有表達。本研究結合行為學試驗及組學數據對交配后橘小實蠅雌蟲觸角及腦組織中轉錄組進行了分析，并分析了與交配后再次交配行為相關的候選基因的基因家族成員和表達模式，為進一步研究調控橘小實蠅交配行為的關鍵基因及開發相關防控技術提供了基礎。

關鍵詞 橘小實蠅；交配行為；觸角；腦；轉錄組

中圖分類號：Q 969.9；S 433 文獻標識碼：A DOI：10.16688／j.zwbh.2024109

交配是大多數昆蟲繁殖后代的關鍵步驟，昆蟲的交配行為在交配后會發生顯著變化，這些變化反映了它們在不同生命階段的需求。例如黑腹果蠅Drosophila melanogaster雌蟲在交配后應產卵需求，會激活先天免疫，并加速生殖成熟和產卵。神經系統是昆蟲行為調控的核心，神經系統感知到交配狀態的變化后會調節昆蟲的交配行為。例如，昆蟲交配后其嗅覺外周神經對性信息素的敏感度降低，而對于植物氣味的敏感度大幅增強，多巴胺信號通過多巴胺受體傳遞到P1神經元，調控交配行為，交配后，雄性黑腹果蠅多巴胺能神經元的興奮度降低，對雌性刺激的敏感性下降，導致P1神經元的激活被抑制，進而減少了求偶行為。

交配行為直接影響昆蟲的繁殖行為，尤其是雌蟲，交配行為會刺激其神經系統，進而調控其產卵行為，而基因在其中發揮著根本作用。目前研究較多的是性肽，其通過性肽受體調控雌性交配后的行為轉變，這在黑腹果蠅、棉鈴蟲Helicooerpa ar-migera和橘小實蠅Bactrocera dorsalis中均有報道。在果蠅中，性肽受體通過關閉腦部pCl中樞向陰道板傳遞的打開信號.使雌蟲從接受交配轉向拒絕交配。雖然性肽在昆蟲中已有較多的研究，但涉及雌性行為轉變的基因轉錄水平變化的研究相對較少。

轉錄組測序在高通量篩選與尋找與生理狀態變化相關的重要基因中發揮有效的作用，利用轉錄組測序可以獲得某一生理條件下細胞內所有轉錄產物的集合，是研究基因表達調控的重要手段。已有的轉錄組研究表明，交配狀態不僅影響與交配和繁殖行為直接相關的基因，例如與卵子生產和化學感受相關的基因，也影響其他功能的基因，例如肌肉發育、酸堿度調節和翻譯起始因子。另外，不同物種間，與交配行為有關的基因的功能及表達變化情況均存在差異，例如，黑腹果蠅或意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica交配后雌性體內免疫相關基因轉錄水平顯著上調，而地中海實蠅Ceratitis capitata交配后雌性體內免疫基因轉錄水平并沒有顯著變化，氣味結合蛋白的表達變化也和黑腹果蠅不一樣。因此，對特定害蟲交配前后所涉及重要組織的轉錄組進行測序和比較分析，有可能獲得與交配行為相關的基因。

橘小實蠅是全球重大果蔬害蟲，可為害150多種水果及蔬菜，其主要通過雌蟲在果實內產卵造成危害。目前化學防治方法對橘小實蠅防控效果有限且存在抗藥性等問題。綠色防控使用的高效引誘劑如甲基丁香酚主要針對雄蟲。本研究使用高通量測序對橘小實蠅交配前后觸角和腦部差異轉錄組進行分析，采用生物信息學對其基因進行鑒定和功能注釋，對上調最為顯著的基因進行qPCR驗證，挖掘繁殖行為相關基因進行系統發育分析和表達分析，旨在為理解橘小實蠅交配狀態介導的行為轉變機制提供分子基礎，同時獲取干擾雌蟲交配行為和繁殖行為的潛在靶標，為后續利用RNA干擾技術開發核酸農藥干擾這些基因的表達，從而抑制橘小實蠅的交配和繁殖奠定基礎。

1材料和方法

1.1行為學試驗

橘小實蠅來源于中國農業科學院深圳農業基因組研究所。橘小實蠅卵置于幼蟲人工飼料中飼養，飼養溫度25～27℃，相對濕度50%～60%，光周期L∥D=14h∥10h，幼蟲老熟后置于濕沙中化蛹；羽化前將蛹從沙中篩出，放入18cm×25cm×14cm的亞克力材質透明養蟲籠中，直至羽化；成蟲飼料為啤酒酵母和白砂糖1：1混合物，同時放置水源。根據前期實驗室飼養經驗，羽化后12～16d為成蟲的交配高峰期。因此選擇12日齡作為研究的初始日齡。將50對12日齡的雌雄成蟲放入18cm×25cm×14cm透明亞克力養蟲籠中，于16：30 -20：30（實蠅交配高峰時段）放置于50lx光照下觀察其交配情況，小心地挑出30對正在交配的雌雄成蟲單對放置在潔凈果蠅管內，確保不打斷其交配過程。交配時長大于2h視為成功交配，20：30關閉燈光。第2天9：00將交配成功的雌性和雄性成蟲各30頭分別放到兩個透明亞克力養蟲籠內飼養，于16：30再分別放入30頭相同日齡的異性未交配成蟲，置于50 lx光照下，觀察已交配成蟲的再次交配情況，記錄交配個體的數量，20：30關閉燈光。第3天至第5天的操作和第2天相同，進行5次重復試驗，每重復用蟲數、時間和光照條件均相同。統計雌性和雄性成蟲初次交配及之后第2天至第5天的交配率。利用GraphPad Prism（v 9.5.1）進行差異顯著分析，對各天的平均交配率進行方差齊性檢驗（Brown-Forsythe test），對雌雄每天的交配率進行單因素方差分析（One-way ANOVA），所有重復數據結果均表示為平均值±標準誤差。

1.2用于轉錄組測序的雌蟲樣本采集

由于橘小實蠅交配會在夜間持續進行，最長可由傍晚持續到次日上午，因此在12日齡的橘小實蠅成蟲完成交配后的第2天上午9：00，將150頭已交配雌性個體平均分配到3個養蟲籠中，補充等量的未交配雄蟲，當日傍晚觀察橘小實蠅雌蟲交配行為，確定其交配率顯著低于初次交配且交配行為穩定后，于第3天（14日齡）上午9：00采集完成了初次交配且無二次交配行為的雌蟲的觸角和腦部組織，同時采集未進行初次交配的同日齡雌蟲的相同部位作為對照。利用二氧化碳麻醉橘小實蠅，使用鑷子（LA501979-6， World Precision Instruments）從觸角基部拔取完整的觸角；使用微型剪刀（503364，World Precision Instruments）剪開橘小實蠅頭部，使用鑷子剝離完整的腦組織；100對觸角作為1個重復，30個腦組織作為1個重復。上述過程重復5次，即5次生物重復。采集過程中，將樣本立即浸沒于液氮中，采集完畢后放入-80℃超低溫冰箱保存。

1.3總RNA提取和檢測

使用TRIzol試劑提取每個樣品的總RNA。使用微量紫外分光光度計（ND ONEC，Gene Company Limited）測定總RNA的濃度，使用片段分析儀Fragment Analyzer 5400（Agilent，美國）全自動毛細管電泳系統測定總RNA的完整性和純度。將檢測合格的RNA樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進行轉錄組測序分析。測序平臺選用Illumina，策略采用PE150。

1.4測序數據預處理和轉錄本定量

Illumina高通量測序儀測序得到原始圖像文件，進行堿基識別（base-calling）和Bcl2Fastq轉化后得到fastq格式的原始測序序列，使用FastQC（v 0.12.1）對原始測序序列進行質檢，然后使用Trimmomatic（v 0.39）過濾并移除接頭序列，得到高質量的有效序列。從國家生物信息中心GSA數據庫（https：∥ngdc.cncb.ac.cn/？ _blank，PRJCA020830）下載橘小實蠅參考基因組，并使用HISAT2-build（v2.2.1）構建索引，用HISAT2軟件（v 2.2.1）將有效序列比對到參考基因組，得到包含比對信息的sam文件；使用SAMtools（v 1.16.1）軟件對sam文件按序列在fastq文件中的順序（即header）和序列從左往右的位點排序，得到bam文件；使用StringTie（v 2.2.1）軟件結合參考基因組注釋文件進行轉錄組組裝，之后用StringTie軟件中prep-DE. py腳本進行基因和轉錄本的定量，得到基因原始表達矩陣和TPM（transcripts per million）值矩陣。

1.5交配前后橘小實蠅雌蟲觸角和腦組織中差異表達基因的分析

使用R語言DESeq2包對交配前后橘小實蠅雌蟲觸角和腦組織分別進行差異表達基因分析，篩選符合Plt;0.05的差異表達基因作為顯著差異表達基因。以橘小實蠅參考基因組中注釋到的所有基因為基礎分別對存在顯著差異表達的基因進行KEGG功能富集分析。符合Plt;0.05且qlt;0.2的通路被定義為顯著富集。按照P值對差異表達基因進行分類，規定Plt;10^-4的基因為變化極顯著的差異基因。

1.6實時熒光定量PCR分析驗證交配前后雌蟲差異基因的轉錄變化

使用Premier-BLAST（https：∥blast. ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）設計橘小實蠅交配后腦部轉錄上調極顯著的基因以及內參基因Actin的特異性引物（表1）。采用TRIzol試劑分別提取14日齡的30頭已交配雌性和30頭未交配雌性的腦組織總RNA。用HiScriptⅢReverse Transcriptase逆轉錄酶（諾唯贊，南京）從2μg總RNA中獲得cDNA。使用熒光定量PCR儀CFX Opus 96（Bio-Rad）設備進行實時熒光定量PCR檢測。10μL反應體系包含：cDNA模板1μL，10 mmol／L上、下游引物各0.5μL，2×Taq Pro SYBR（R）uasterMix染料（TaKaRa）5μL，ddH₂O ₃μL。反應程序：95℃3 min；95C 10 s，55℃30 s，39個循環；65℃5s，95℃ 30 s。所有qPCR試驗均進行3個生物學重復。采用2^-ΔΔC_T相對定量法計算候選基因的相對表達量，利用GraphPad Prism（v 9.5.1）進行差異顯著性分析，首先使用Shapiro-Wilk檢驗對原始數據進行正態性檢驗，然后使用1g（x+1）對非正態分布數據進行轉換。對各基因交配前后的表達水平進行t檢驗，所有重復數據結果均表示為平均值±標準誤差。

1.7橘小實蠅類蛻皮激素激酶（ecdysteroid kinase-like，EcKL）基因家族分析

1.7.1橘小實蠅EcKL基因鑒定和命名

從Interpro數據庫（https：∥www.ebi.ac.uk/interpro／）中下載已公布的EcKL的隱馬爾可夫模型（hidden Markov model，HMM）（登錄號PF02958），根據該模型利用HMMER（v 2.2.1）對橘小實蠅基因組蛋白序列（從實驗室前期測序組裝獲得基因組中獲取）進行搜索，篩選顯著性閾值（E值）lt;10^-5（期望值）的結果作為基因集1。利用已報道的黑腹果蠅EcKL基因蛋白序列，用PSI-BLAST（v 2.14.0）將其與橘小實蠅基因組蛋白序列進行多重比對，從中篩選Elt;10²的結果作為基因集2。選取2個基因集的交集，將其中基因編碼氨基酸序列在Interpro數據庫、CDD數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）和SMART數據庫（smart.embl.de/smart/set_mode.cgi？）中進行結構域驗證。篩選被預測為EcKL的基因作為橘小實蠅候選EcKL基因。按照基因ID順序對橘小實蠅候選EcKL基因進行排序，基因ID最小的命名為BdorEcKL1，其他候選EcKL基因按照基因ID大小順次進行命名。

1.7.2橘小實蠅EcKL基因在腦部和外周組織中表達模式分析

以實驗室構建的橘小實蠅雌雄成蟲腦和外周組織轉錄組數據（已上傳至國家生物信息中心GSA數據庫https：∥ngdc.cncb.ac.cn/？ _blank，PRJCA020830）作為參考基因組，包括腦、觸角、口器、前足、中足、后足、外生殖器共7種組織。利用StringTie（v 2.2.1）軟件對比對到參考基因組的轉錄本進行組裝，計算表達量及TPM值，整合獲得原始表達矩陣及TPM值矩陣。根據TPM值的離群程度對原始表達矩陣進行過濾。最終將過濾后的原始表達矩陣以及樣本分組信息輸入DESeq2，對每個組織分別進行雌雄間差異表達分析，設定閾值為：｜log2 fold change｜gt;1.5，Plt;0.05。提取雌雄成蟲不同組織EcKL候選基因表達矩陣。在R語言中利用Pheatmap構建EcKL候選基因在外周神經組織的表達譜。

1.7.3 EcKL在橘小實蠅和果蠅中的系統發育分析

收集已發表的黑腹果蠅EcKL的氨基酸序列，與上述所獲得的橘小實蠅EcKL氨基酸序列一同使用MAFFT（v 7.515） 進行多序列比對，使用IQ-TREE（v 2.2.0.3）軟件的ModelFinder選項選擇最佳的核苷酸替代模型，以最大似然法構建系統發育樹。

1.8橘小實蠅卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）基因家族分析

1.8.1橘小實蠅Vg基因鑒定和命名

收集NCBI公布的雙翅目昆蟲，包括墨西哥按實蠅Anastrepha ludens、西印度按實蠅Anastrepha obliqua、褐肩果實蠅Bactrocera neohumeralis、瓜實蠅Bactrocera cucurbitae、辣椒實蠅Bactrocera lati-frons、地中海實蠅Ceratitis capitata、黑腹果蠅、雙刺果蠅Drosophila biarmipes和銀額果蠅Drosoph-ila albomicans的卵黃原蛋白（Vg）的氨基酸序列，根據這些序列信息利用HMMER（v 2.2.1）構建隱馬爾可夫模型，搜索橘小實蠅基因組蛋白序列，篩選顯著性閾值Elt;10^-5的結果作為基因集1。從Swissprot數據庫（https：∥www.uniprot.org／）中下載黑腹果蠅卵黃原蛋白基因序列，用PSI-BLAST將其與橘小實蠅基因組蛋白序列進行多重比對，從中篩選Elt;10^-2的結果作為基因集2。選取2個基因集的交集，將其中基因的氨基酸序列在Interpro數據庫、CDD數據庫和SMART數據庫中進行結構域驗證。篩選被預測為Vg的基因作為橘小實蠅候選Vg基因。按照基因ID順序對橘小實蠅候選Vg基因進行排序，基因ID最小的命名為BdorVg1，其他候選Vg基因按照基因ID大小順次進行命名。

1.8.2橘小實蠅Vg基因在腦部和外周組織中表達模式分析

以實驗室前期構建的橘小實蠅雌雄成蟲腦和外周組織轉錄組數據作為參考基因組，包括腦、觸角、口器、前足、中足、后足和外生殖器共7種組織。利用StringTie（v 2.2.1）軟件對比對到參考基因組的轉錄本進行組裝，計算原始表達量及TPM值，整合獲得原始表達矩陣及TPM值矩陣。根據TPM值的離群程度對原始表達矩陣進行過濾。最終將過濾后的原始表達矩陣以及樣本分組信息輸入DESeq2進行差異表達分析，以｜lOg2 fold change｜gt;1.5，Plt;0.05為閾值提取不同性別的顯著差異表達基因。根據橘小實蠅候選Vg基因的基因ID從TPM值矩陣中提取不同組織雌雄Vg候選基因表達矩陣。在R語言中利用Pheatmap構建Vg候選基因在橘小實蠅外周組織的表達譜。

1.8.3Vg在雙翅目物種中的系統發育分析

從Uniprot數據庫（https：∥www. uniprot.org／）下載雙翅目昆蟲Vg基因的氨基酸序列（墨西哥按實蠅、西印度按實蠅、褐肩果實蠅、瓜實蠅、辣椒實蠅、地中海實蠅、黑腹果蠅、雙刺果蠅和銀額果蠅），與上述所獲得的橘小實蠅Vg氨基酸序列一同使用MAFFT（v 7.515）進行多序列比對，使用IQ-TREE（v 2.2.0.3）軟件的ModelFinder選項選擇最佳的核苷酸替代模型，以最大似然法構建系統發育樹。

2結果與分析

2.1橘小實蠅雌雄成蟲的再交配規律

30對12日齡的橘小實蠅初始交配率達到100%。但雌雄成蟲重復交配現象表現出不同的規律。在后續的4d中，當每天都對已交配雄蟲提供充足的未交配雌蟲時，雄蟲均仍然有較高的交配率，13日齡為94.7%，14日齡為94%，15日齡為96%，16日齡為97%，與初次交配率（12日齡）均無明顯差異（F_4，20=2.551，P=0.071），說明雄蟲具有較強的重復交配能力（圖1）。但雌成蟲的重復交配率顯著下降，13日齡為9.4%，14日齡為9.8%，15日齡為10.8%，16日齡為10.6%，與初次交配率相比均差異顯著（Plt;0.0001，13日齡vs 12日齡：t= 84.12；14日齡vs 12日齡：t=112.8；15日齡vs 12日齡：t= 103.7；16日齡vs 12日齡：t=149，df=8）。且13、14、15日齡和16日齡之間相比交配率沒有差異（df=8，13日齡vs 14日齡：t=0.298，P=0.9956；13日齡vs 15日齡：t=1.016，P=0.694 3；13日齡vs 16日齡：t=0.973，P=0.7973；14日齡vs 15日齡：t=0.851，P=0.8825；14日齡vs 16日齡：t=0.8，P=0.9436；15日齡vs16日齡：t=0.191，P=0.9997），說明雌蟲在交配后4d內未產卵的前提下交配率沒有明顯變化，且雌蟲的交配后狀態變化時間點在12日齡至13日齡之間（圖1）。

2.2交配前后轉錄組測序和數據組裝

對橘小實蠅雌蟲交配前后觸角和腦組織共20個樣本進行轉錄組測序，去除低質量的序列后，從觸角中獲得411 779 644條有效序列，從腦中獲得409 750 488條有效序列。數據顯示，Q30均不小于91.85%，GC含量為39.45%～40.68%（表2），說明測序質量較好，完整度高。

2.3橘小實蠅雌性交配前后腦部轉錄組分析

通過比較交配前后雌蟲的觸角和腦部的轉錄組，共獲得45個差異基因。與未交配的雌蟲相比，已交配的雌蟲觸角有1個基因顯著上調，3個基因顯著下調（圖2a）；腦部有20個基因顯著上調，22個基因顯著下調，其中交配后腦部細胞色素P450基因（BdorCyp309a2）、葡萄糖醛基轉移酶基因（BdorUD-PGT）等免疫相關基因顯著上調，腦部磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因（Bdor PEPCK）交配后下調最顯著（圖2b）。由此可知，在觸角和腦組織中，橘小實蠅雌蟲交配前后差異表達基因主要集中在腦組織，因此選擇了腦部組織的差異基因進行后續分析。

KEGG富集分析表明，雌蟲交配后腦組織中顯著上調基因只顯著富集到抗壞血酸和醛酸鹽的代謝通路；下調基因共富集到6個KEGG通路，其中脂肪酸降解通路和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解通路富集最為顯著（圖3）。

以Plt;10-4為標準對橘小實蠅雌蟲交配后腦組織中顯著上調且具有已知功能注釋的基因進行篩選，共獲得5個上調極顯著的關鍵差異基因，其中2個基因同屬于卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）基因，且這2個基因在雌性腦組織差異表達基因中的表達量最高；另有3個基因均屬于類蛻皮激素激酶（ecdyste-roid kinase-like，EcKL）基因（表3）。經qPCR驗證，上述5個基因在交配后轉錄水平均顯著增加（圖4）。

2.4橘小實蠅蛻皮激素激酶基因家族分析

共獲得59個橘小實蠅EcKL候選基因（表4）。為了明確橘小實蠅與黑腹果蠅間EcKL的進化關系，我們構建了59個橘小實蠅、50個黑腹果蠅的EcKL系統發育樹。系統發育樹顯示，橘小實蠅EcKL與黑腹果蠅EckL有明確的支系及聚支關系，進化樹各個分支具有良好的自展值支持；其中橘小實蠅有18個EcKL與黑腹果蠅EcKL一對一聚支（紅色），暗示這些EcKL在橘小實蠅和黑腹果蠅間保守；有2個橘小實蠅EcKL分別與多個黑腹果蠅EcKL聚支（紫色），暗示進化過程中這些分支的黑腹果蠅EcKL可能在橘小實蠅中丟失；有4個黑腹果蠅EcKL分別和多個橘小實蠅EcKL聚支（橙色），暗示這些橘小實蠅EcKL在進化中可能發生了復制或擴張；有24個橘小實蠅EcKL僅在種內聚支（藍色），支系內不包括黑腹果蠅EcKL，說明這些基因為橘小實蠅物種特異性EcKL；另有7個黑腹果蠅EcKL在其種內聚支（綠色），支系內不包括橘小實蠅EcKL（圖5）。

橘小實蠅59個EcKL基因中，有49個在外周神經組織和腦組織表達（TPM≥1），10個不表達（TPMlt;1），根據TPM將這些基因分為高表達基因（TPM≥20）、中表達基因（10≤TPM＜20）和低表達基因（1≤TPM＜10）；在雌性和雄性腦組織中，高表達EcKL基因分別有28個和29個，相較于其他部位占比最高，占腦組織中表達的全部EcKL基因的62%和63%，暗示EcKL基因在腦組織中可能發揮重要功能。另外，BdorEcKL39在腦組織中特異性表達，BdorEcKL36、BdorEcKL38在腦組織中表達量最高，在外周神經組織中低表達或不表達。在外生殖器組織中雌雄顯著差異表達的EcKL基因占比最高，有36個，占在該部位表達的全部EcKL基因的82%，暗示EcKL基因在外生殖器組織中可能發生了性別間功能分化；BdorEcKL4、BdorEcKL13、BdorEcKL41、BdorEcKL42、BdorEcKL44、BdorEcKL45、BdorEcKL49、BdorEcKL50在腦組織及外周神經組織中均為高表達基因，暗示這些基因在神經系統中發揮重要功能（圖6）。

2.5橘小實蠅卵黃原蛋白基因家族分析

橘小實蠅全基因組中共注釋到11個Vg候選基因，獲得了完整的開放閱讀框（表5）。與黑腹果蠅相比，實蠅Vg基因家族有明顯的擴張。根據進化樹可將實蠅Vg分為5個亞類，其中只有2個亞類與黑腹果蠅Vg聚支。在實蠅科物種中，同一物種的多數Vg在進化樹中分布較分散，表明種內保守型不高。在橘小實蠅中，BdorVg5、BdorVg9和BdorVg10單獨聚為一支，未與黑腹果蠅及其他實蠅物種的Vg聚支，表明這3個Vg同源性較高且具有物種特異性；除上述3個Vg外，其他橘小實蠅Vg均與實蠅物種的Vg良好聚支（圖7）。

橘小實蠅外周神經組織和腦組織中共有9個Vg基因表達。對于雌成蟲，觸角、口器、前足、外生殖器中高表達的Vg基因占比最高，達到67%。其中Bdor Vg1.1、Bdor Vg1.2、Bdor Vg2、Bdor Vg3、Bdor Vg9在雌成蟲腦及外周神經組織中均為高表達基因。雄性成蟲在口器組織中高表達Vg基因有6個，其他部位僅有1～3個；其中BdorVg3在兩性腦及外周神經組織中均為高表達基因，BdorVg6、Bdor Vg7和Bdor Vg8僅在雄蟲口器組織中表達（圖8）。

3結論與討論

昆蟲交配后雌蟲會產生一系列明顯的行為變化，如性接受程度降低、趨向性發生變化、產卵量增加等，本研究中，雌成蟲初次交配后次日再次交配的成功率顯著下降，雄性生殖因子進入雌性體內是導致這些行為變化的主要原因。有研究表明，多數橘小實蠅雌蟲一生僅交配1～2次。實蠅雌蟲完成一次交配后往往存在一段時間的生理不應期，在這一段時間內雌蟲會拒絕雄蟲的求偶，不與其發生交配。而雄蟲通常可以連續進行多次交配，且雄蟲獲得后代的數量與其交配過的雌蟲的數量密切相關。在實蠅類昆蟲中，往往會存在雌雄間的性沖突問題，即雄蟲渴望與更多的雌蟲交配，而雌蟲則因為不能從多次的交配中獲益，會拒絕多余的交配。有研究發現，橘小實蠅雌蟲產卵后可以再次交配。本研究僅對雌性交配后產卵前的行為進行觀察，雌性產卵后行為變化機制仍有待進一步研究。

本研究發現，橘小實蠅雌蟲交配后腦部細胞色素P450基因、葡萄糖醛基轉移酶基因等免疫相關基因顯著上調，這表明橘小實蠅雌性交配后免疫反應可能增強，這種現象在黑腹果蠅中也有報道，其原因是交配過程中相關性肽的轉移可以激活雌性的免疫反應。因此我們推測橘小實蠅雌蟲交配后免疫相關基因的表達顯著上調同樣是由性肽調控的。這類免疫基因的上調被認為是雌性的交配成本之一，可能是來源于兩性之間的性拮抗作用。本研究還發現，雌蟲腦組織中交配后下調最顯著的基因為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因，該基因編碼的酶參與糖異生途徑，介導非糖物質向糖類物質轉化。另外，雌蟲交配后腦組織中顯著下調的基因顯著富集到多個糖類物質代謝通路，例如半乳糖代謝通路、戊糖和葡萄糖鹽酸的相互轉化通路（圖3）。這些基因的表達量顯著下調暗示橘小實蠅雌蟲交配后腦組織對糖分的需求下降，我們推測交配后雌蟲可能需要將更多的能量分配到腹部來維持胚胎形成以及產卵，導致了腦部對糖類的需求量降低。

本研究發現，橘小實蠅雌蟲交配后腦部上調最顯著的5個基因有3個屬于EcKL基因家族。昆蟲EcKL參與昆蟲對植物次生代謝物的解毒代謝。例如，黑腹果蠅EcKL基因與咖啡因耐受性有關，可能通過磷酸化介導黑腹果蠅對咖啡因的解毒代謝。咖啡因存在于多種植物中，包括橘小實蠅的寄主植物如柑橘，被認為是一種昆蟲拒食劑。橘小實蠅雌蟲交配后需要在寄主植物上進行產卵，雌成蟲產卵刺傷寄主果實并從中獲取食物，腦部作為神經中樞，其中多個EcKL基因顯著上調，可能與橘小實蠅響應寄主植物次生代謝物有關。另外有研究發現，EcKL介導蛻皮類固醇的可逆磷酸化，這與昆蟲胚胎發生和繁殖過程中的蛻皮類固醇循環有關。此外，蛻皮激素與雙翅目昆蟲卵黃蛋白合成有關，影響卵的數量和質量。因此我們推測EcKL基因還可能參與橘小實蠅雌蟲交配后卵的發生和發育過程。

昆蟲的卵黃原蛋白（Vg）是胚胎發育的主要營養來源，它在胚胎發生時分解為小分子多肽和氨基酸，為胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素和微量元素等營養和功能性物質。研究表明，昆蟲的交配行為會影響Vg基因的表達，例如蜱蟲Dermacentor variabilis和黑毛蟻Lasius niger蟻后在交配后Vg基因表達量上調。Vg主要由脂肪體合成，該組織主要分布在昆蟲的腹部、胸部和頭部，其中腹部脂肪體最為發達。在黑腹果蠅和家蠅Musca domestica中，卵巢是合成Vg的主要部位。本研究在橘小實蠅中也發現了交配后Vg基因轉錄上調，不同的是，這種上調發生在腦部。此外，Vg基因可能通過其他途徑參與行為調控，例如在Vg受體基因被敲除的雌性寄生蜂中，產卵和寄生率下降，與嗅覺感受相關的多個轉錄組顯著下調。這些研究表明，雌性交配后腦部Vg基因轉錄上調可能有多種原因：Vg在腦部的脂肪體中合成后經血淋巴輸送到卵巢，為胚胎提供營養；另外，保幼激素介導Vg的合成，交配后腦部Vg表達上升，而Vg又可以抑制保幼激素水平，兩者形成動態平衡，這種激素水平的變化可能與橘小實蠅交配前后的行為差異有關。因此，未來研究應進一步探索Vg在特殊組織中的潛在功能，為發現新的機制和應用目標提供基礎。

本研究利用基因組和轉錄組數據對橘小實蠅交配后觸角和腦部表達量變化的基因進行了系統鑒定，并對EcKL和Vg兩類關鍵差異表達基因的基因家族成員、作用和表達模式進行了分析，并討論這些基因和繁殖的潛在關系。本研究為進一步研究調控橘小實蠅交配行為的關鍵基因及開發相關防控技術提供了基礎，并有可能促進更加有效和生態友好的害蟲防治策略的發展。