鱷梨屬3種油梨葉綠體基因組密碼子偏好性分析

摘要：【目的】分析鱷梨屬3種油梨葉綠體基因組密碼子的使用偏好性，為油梨葉綠體基因工程中提高外源基因在載體內表達及油梨分子育種提供理論依據。【方法】以在鱷梨屬3種油梨（墨西哥種、危地馬拉種和西印度群島種）葉綠體基因組中篩選出的49條編碼區（CDS）序列為研究對象，利用Excel 2010、Origin 2021、TBtools、CodonW 1.4.2、Chi-plot在線網站和CUSP軟件對3種油梨葉綠體基因組密碼子進行密碼子組成分析、參數相關分析、中性繪圖分析、ENC-plot分析、PR2-plot分析和最優密碼子分析。【結果】3種油梨葉綠體基因組密碼子第1、第2和第3位上堿基GC含量的排序為GC1gt;GC2gt;GC3，表明GC在密碼子不同位置上的分布不均勻。GC1分別與GC2、GC3、GC及ENC呈正相關，其中GC1與GC之間的相關系數最高（0.80）。GC2分別與GC3和ENC呈負相關。中性繪圖分析結果顯示，墨西哥種、危地馬拉種和西印度群島種3種油梨葉綠體基因組GC3與GC12間的回歸系數分別為0.0956、0.0869和0.0872，相關系數分別為0.0050、0.0042和0.0043，表明密碼子使用偏好性主要受自然選擇的影響。ENC-plot分析結果顯示，大多數基因偏離標準曲線散布在標準曲線下方，較少的基因分布在標準曲線上方或接近標準曲線，表明不同的基因受突變壓力和自然選擇影響不同。3種油梨葉綠體密碼子偏好性受自然選擇的影響程度較大。PR2-plot分析結果顯示，密碼子第3位上的堿基T的使用頻率高于A，而G的使用頻率高于C，說明密碼子使用偏好性除受到突變壓力影響外，也受自然選擇等因素的影響。鱷梨屬3種油梨均篩選出15個最優密碼子，分別為UUU、UUA、UUG、CUU、AUU、GUU、UCU、CCU、CCC、ACU、ACC、GCU、UAA、UGU和AGA。【結論】鱷梨屬3種油梨葉綠體基因組密碼子偏好性主要受到自然選擇的影響，同時也受突變壓力等多重因素的共同作用；并篩選出的15個最優密碼子的第3位堿基大多以A/U結尾。

關鍵詞：鱷梨屬；葉綠體基因組；密碼子偏好性；最優密碼子

中圖分類號：S667.9文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0573-10

Codon bias analysis in chloroplast genomes of 3 avocado species in Persea

QI Mei-jun，ZHANG Zhen-wei，DONG Shi-lang，ZHANG Rong-qi，ZHANG Qiu-yan，DUAN Yu-ting，WANG Kai，LYU Zhi-peng，HUANG Wen-long，GEYu*

（College of Tropical Crops，Yunnan Agricultural University，Pu’er，Yunnan 665099，China）

Abstract：【Objective】To study the codon bias in chloroplast genome of 3 avocado species in Persea，which could provide theoretical basis for improving the expression of exogenous genes in genetic engineering of avocado and molecu-lar breeding of avocado.【Method】The 49 coding region（CDS）sequences in chloroplast genomes of 3 avocado species in Persea（P.americana var.drymifolia，P.americana var.guatemalensis，P.americana var.americana）were selected as the study object.Using Excel 2010，Origin 2021，TBtools，CodonW 1.4.2，Chiplot online website and CUSP software，codon composition analysis，parameter correlation analysis，neutral mapping analysis，ENC-plot analysis，PR2-plot analysis and optimal codon analysis of chloroplast genomes codons of 3 avocado species were carried out.【Result】The se-quence of GC content at the first，second and third bases of the chloroplast genome codons of 3 avocado species was GC1gt;GC2gt;GC3，indicating that the distribution of GC at different codon locations was uneven.GC1 was positively correlated with GC2，GC3，GC and ENC，and the correlation coefficient between GC1 and GC was the highest（0.80）.GC2 was negatively correlated with GC3 and ENC respectively.The results of neutral mapping analysis showed that the regression coefficients between the chloroplast genome GC3 and GC12 of P.americana var.drymifolia，P.americana var.guatemalensis and P.americana var.americana were 0.0956，0.0869 and 0.0872，and the correlation coefficients were 0.0050，0.0042 and 0.0043 respectively.It showed that codon bias was mainly influenced by natural selection.The results of ENC-plot analysis showed that most genes deviated from the standard curve and were scattered below the standard curve，while a few genes were distributed above or close to the standard curve，indicating that different genes were af-fected differently by mutation pressure and natural selection.The chloroplast codon preference of 3 avocado species were greatly affected by natural selection.PR2-plot analysis results showed that the usage bias of base T at the third position of the codon was higher than that of A，while that of G was higher than that of C，indicating that the usage bias of the codon was affected not only by mutation pressure，but also by natural selection and other factors.A total of 15 optimal codons were screened from 3 avocado species in Persea：UUU，UUA，UUG，CUU，AUU，GUU，UCU，CCU，CCC，ACU，ACC，GCU，UAA，UGU and AGA.【Conclusion】The codon bias in the chloroplast genomes of 3 avocado species in Persea are mainly influenced by natural selection，but also influenced by multiple factors such as mutation pressure，and most of the third bases of the 15 optimal codons screened ended in"A/U.

Key words：Persea；chloroplast genome；codon usage bias；optimal codon

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32260735）；Young Talent Project of Yunnan Re-vitalization Talent Support Project（XDYC-QNRC-2022-0711）；Yunnan Expert Basic Scientific Research Station Project（2021RYZJGZZ004）；Yunnan Agricultural University Undergraduate Practical Teaching，Labor Education and Rural Edu-cation Teaching Reform Research and Practice Project（2024SJJX036）

0引言

【研究意義】油梨（Persea americana Mill.）也被稱為鱷梨，隸屬于樟科（Lauraceae）鱷梨屬（Persea）的亞熱帶和熱帶果樹（Duarte et al.，2016；Hernandez et al.，2022）。油梨果肉具有豐富的脂肪酸及其他營養物質，同時油梨也是亞熱帶和熱帶地區的重要經濟果樹（Amado et al.，2019；Wang et al.，2019；Juarez-Escobar et al.，2021）。葉綠體是植物進行光合作用的場所（Dobrogojski et al.，2020）。在植物響應脅迫和成長過程中需要調節葉綠體的發育和生物發生（Li etal.，2022）。葉綠體基因組被證實能反映生物系統發育進化關系（Ma etal.，2020），此外，葉綠體在重組歷程中，遺傳進化的選擇壓力小，因此可反映出植物在進化歷程中長時間累積的遺傳變異，可用于追溯物種的遷徙和起源（Green，2011；Su et al.，2020）。密碼子使用偏差是指同義密碼子的不隨機或優先應用。密碼子偏差因物種、群體或科的不同存在差異，且因生物體內基因不同而表現出差異。密碼子使用偏差是由各物種生物體的突變壓力、遺傳漂移和自然選擇演化而來（Parvathy et al.，2022）。研究密碼子偏好性有利于探究物種的遺傳進化及其基因表達特征（Wang et al.，2022）。因此，分析鱷梨屬3種油梨葉綠體基因組密碼子偏好性，對通過基因工程提高鱷梨屬植物葉綠體外源基因在載體內表達及油梨的分子育種具有重要意義。【前人研究進展】在大多數被子植物葉綠體基因組中，大倒置重復序列的2個拷貝把基因組其余部分劃分成大和小單拷貝2個獨特的DNA區域（Raubeson et al.，2007）。伴隨著大量物種葉綠體基因組測序完成，截至目前，關于葉綠體基因組密碼子偏好性的分析已在連翹［Forsythia suspensa（Oleaceae）］（Wang et al.，2017）、水稻屬（Oryza）（Chakraborty et al.，2020）、木薯（Manihot esculenta Crantz）（Geng et al.，2022）、櫻桃（Prunus pseudocerasus Lindl.）（Song et al.，2022）和咖啡（Coffea spp.）（Li etal.，2023）等植物中完成。辛雅萱等（2020）以篩選獲得的杜梨（Pyrus betulifolia Bge.）葉綠體基因組中37條蛋白編碼序列為研究對象，對其葉綠體基因組密碼子的使用偏性進行分析，結果發現18個最優密碼子多以A/U結尾，并且密碼子偏性受多重因素影響。唐玉娟等（2021）通過分析芒果（Mangifera indicate L.）葉綠體基因組密碼子的使用偏好，結果發現芒果葉綠體基因組密碼子使用偏好受自然選擇和突變壓力等因素共同影響。賴瑞聯等（2022）通過分析橄欖（Canarium album）葉綠體基因組密碼子使用偏好性，結果發現橄欖葉綠體基因組密碼子偏好性較弱，并且大部分偏好使用A/T。肖明昆等（2022）通過研究云南樟（Cinnamomum glanduliferum）葉綠體基因組密碼子使用偏好性，篩選得到12個最優密碼子，發現云南樟葉綠體基因組的密碼子使用偏好性較弱，偏好使用以A/U結尾的密碼子并且密碼子使用偏好性受自然選擇影響較大。楊祥燕等（2022）從菠蘿（Ananas comosus）葉綠體基因組密碼子中獲得18個最優密碼子并且大部分偏好以A/U結尾，自然選擇和突變壓力相對均衡地影響著菠蘿葉綠體基因組密碼子使用偏好性。葉綠體基因組密碼子偏好性并非單一因素影響的結果，這種偏好性可能受自然選擇、突變壓力和其他因素的共同影響。李亞麒等（2023）研究發現，高產小粒咖啡（Coffea arabica L.）葉綠體基因組偏好使用以A/T結尾的密碼子，并且其密碼子的使用偏好受自然選擇、突變壓力、基因表達水平、基因長度等多種因素共同影響。王杰敏等（2023）通過分析24份忍冬屬（Lonicera）材料葉綠體基因組密碼子使用偏好性，結果表明密碼子第3位堿基組成對基因表達有著很大影響，24份忍冬屬各物種間的進化相似并且親緣關系較近。王淘等（2023）通過研究枳（Citrus trifoliata）葉綠體基因組密碼子的使用偏性，結果表明選擇是影響密碼子偏好性的主要因素。朱艷和韓長志（2024）對普通核桃（Juglans regia）與深紋核桃（Juglans sigillat）中葉綠體基因組密碼子使用特征進行對比分析，結果從普通核桃中篩選出14個最優密碼子，從深紋核桃中篩選出17個最優密碼子。一般來說，葉綠體基因組密碼子普遍使用偏好性較低且富含A/U，受突變壓力和自然選擇的雙重影響，自然選擇是主要影響因素，但趙森等（2020）研究發現秋茄（Kandelia obovata）葉綠體基因組密碼子偏好使用以A/U結尾的密碼子，密碼子使用偏好性的主要影響因素是突變壓力，堿基組成和自然選擇對其也有一定影響。【本研究切入點】目前，盡管對油梨葉綠體基因組的測序已完成，但尚未有關于油梨葉綠體基因組密碼子偏好性的研究報道。【擬解決的關鍵問題】利用Excel 2010、Origin 2021、TBtools、CodonW 1.4.2、Chiplot和CUSP對鱷梨屬3種油梨葉綠體基因組密碼子的使用偏差進行統計分析，為油梨葉綠體基因工程中提高外源基因在載體內表達及油梨分子育種提供理論依據。

1材料與方法

1.1油梨葉綠體基因組的數據來源

Ge等（2019）已將測出的6份（3個品系）油梨的葉綠體基因序列數據提交至NCBI數據庫，3個油梨品系分別為墨西哥種（P.americana var.drymifolia）、危地馬拉種（P.americana var.guatemalensis）和西印度群島種（P.americana var.americana），每個品系2種。本研究從3個油梨品系中分別選取1種進行分析研究。從NCBI公共數據庫中分別下載油梨墨西哥種、危地馬拉種和西印度群島種葉綠體基因組序列，登錄號分別為MK959368、MK959370和MK959367。使用CPGAVAS2在線工具以油梨（登錄號KX437771）為參考基因組序列，獲取油梨墨西哥種、地馬拉種和西印度群島種的編碼區（CDS）序列。在獲得的CDS序列中，剔除重復且CDS總長度小于300 bp的序列，選擇以ATG為起始密碼子并且以TAA、TAG和TGA為終止密碼子的CDS序列分析密碼子偏好性。3種油梨分別獲得49條符合要求的CDS序列用于后續分析。

1.2密碼子相關參數計算分析

運用CodonW 1.4.2和CUSP分析獲得3種油梨CDS序列，使用Excel 2010對各CDS上密碼子第1位堿基的GC含量（GC1）、第2位堿基的GC含量（GC2）、第3位堿基的GC含量（GC3）、密碼子總GC含量（GC）和有效密碼子數（ENC）進行統計，分析密碼子適應指數（CAI）、密碼子偏好性指數（CBI）、最優密碼子使用頻率（FOP）、親/疏水性指數（GRAVY）、芳香性系數（Aromo）和同義密碼子相對使用度（RSCU）等參數。

1.3中性繪圖分析

計算GC1和GC2的平均值，記為GC12，使用Excel 2010以GC12作為縱坐標，以GC3作為橫坐標繪制相應散點圖并進行分析。當線性回歸接近1時，密碼子中不同位置上的堿基組成幾乎相同，表明該基因受突變壓力的影響較大。反之，密碼子中不同位置上的堿基組成差異較大時，則表明基因更多是受到選擇壓力的影響（Chen et al.，2023）。

1.4 ENC-plot分析

ENC能顯示隨機選擇與密碼子的偏差程度，是反映同義密碼子使用不均衡程度的主要指標（Zhang et al.，2021）。以GC3為橫坐標，ENC為縱坐標繪制散點圖，參考Wright（1990）的方法增添ENC標準曲線。當ENC分布在標準曲線上方或附近時，說明突變壓力在密碼子使用中起關鍵性作用；相反，當ENC分布在離標準曲線下方較遠的位置時，則說明密碼子的使用受自然選擇制約較大（Shenget al.，2021）。為進一步展示ENC理論值與ENC實際值間的差別大小，采用公式計算ENC比值，ENC比值=（ENC理論值-ENC實際值）/ENC理論值，依次算出3種油梨葉綠體基因組每個基因的ENC比值。

1.5 PR2-plot分析

PR2可用來指示自然選擇和突變壓力對密碼子使用偏倚的影響（Andargie and Congyi，2022）。使用A3/（A3+T3）為縱坐標，G3/（G3+C3）為橫坐標繪制散點圖。散點圖中心點表示C=G且A=T。當基因均勻地分布在平面圖上時，表明密碼子使用偏好主要由突變壓力引起（Wang et al.，2018）。

1.6最優密碼子分析

將3種油梨葉綠體基因組基因的ENC由小到大進行排序，分別選取ENC最大值和最小值10%的基因建立高表達庫和低表達庫。通過公式計算RSCU差值（△RSCU），計算公式如下：

△RSCU=高表達庫RSCU-低表達庫RSCU

當RSCUgt;1.00時代表高頻密碼子；當△RSCU≥0.08時代表高表達密碼子；當RSCUgt;1.00同時△RSCU≥0.08時表示最優密碼子（Rao et al.，2024）。

1.7統計分析

使用TBtools繪制熱圖，采用Origin 2021進行相關分析，運用Chiplot在線網站繪制柱狀圖。

2結果與分析

2.1 3種油梨葉綠體基因組密碼子組成分析結果

運用CUSP和CodonW 1.4.2對3種油梨葉綠體基因組的49條CDS序列進行分析，結果如表1所示。墨西哥種、地馬拉種和西印度群島種3種油梨T3的含量分別為45.41%、45.44%、45.47%；A3的含量分別為41.85%、41.88%和41.86%，說明3種油梨葉綠體編碼基因上的第3位堿基以T/A結尾為主。3種油梨葉綠體基因組密碼子第1、第2和第3位堿基GC的排序為GC1gt;GC2gt;GC3，表明GC在密碼子不同位置上的分布不均勻，其中，墨西哥種、地馬拉種和西印度群島種3種油梨GC1分別為46.88%、46.86%和46.89%，GC3分別為31.64%、31.59%和31.63%。3種油梨葉綠體基因組GC分別是39.13%、39.10%和39.12%，說明3種油梨葉綠體編碼基因中T/A堿基含量較多。由圖1可知，CBI均小于0，FOP和CAI偏向于0，表明3種油梨葉綠體基因的表達水平比較低。對3種油梨各基因密碼子的GC和ENC采用TBtools繪制熱圖，結果如圖2所示。各基因間的GC存在一定差別，且GC3與GC1、GC2間差別較大。3種油梨的ENC均gt;36.00，其中基因ycf4的ENC最高，為59.30。3種油梨間基因ENC和GC存在一定差別，但差別較小。

2.2 3種油梨葉綠體基因組堿基組成參數相關分析結果

對3種油梨葉綠體基因組中堿基組成參數GC1、GC2、GC3、GC和ENC進行相關分析，結果如圖3所示。GC1與GC2、GC3、GC和ENC均呈正相關，其中GC1與GC的相關系數最高，均為0.80；GC和ENC的相關系數最低，最小值為0.03。GC2與GC3、ENC均呈負相關，其中，墨西哥種和西印度群島種GC2和ENC的相關系數相同，均為-0.37；危地馬拉種GC2和ENC相關系數為-0.38。

2.3 3種油梨葉綠體基因組中性繪圖分析結果

如圖4所示，墨西哥種、地馬拉種和西印度群島種3種油梨葉綠體基因組密碼子GC12分別為0.3428～0.5497、0.3417～0.5497和0.3422～0.5497；GC3分別為0.2244～0.3705、0.2244～0.3706和0.2244～0.3701，3種油梨的GC12和GC3幾乎重合，表明3種油梨葉綠體基因組較為保守。由圖4可知，墨西哥種、地馬拉種和西印度群島種3種油梨葉綠體基因組GC3與GC12的回歸系數分別為0.0956、0.0869和0.0872，相關系數（R2）分別為0.0050、0.0042和0.0043，表明3種油梨葉綠體基因組GC3與GC12相關性較弱，密碼子使用偏好性主要受自然選擇影響。

2. 4 3種油梨葉綠體基因組ENC-plot分析結果

由圖5可知，3種油梨葉綠體基因組大多基因偏 離標準曲線，且散布在標準曲線下方，較少的基因散 布在標準曲線上方或接近標準曲線，說明不同基因 受突變壓力和自然選擇的影響有所不同。如圖6所 示，較少基因分布在-0.05～0.05，大多數基因分布在 -0.05～0.05 之外，說明大多數基因的 ENC 實際值與 ENC期望值差距較大，突變壓力在密碼子使用偏差 的形成中作用較小，從整體上來看，3種油梨葉綠體 密碼子偏好性受自然選擇的影響程度較大。

2. 5 3種油梨葉綠體基因組PR2-plot分析結果

如3種油梨葉綠體基因組PR2-plot分析散點圖（圖7）所示，3種油梨葉綠體基因的坐標點在4個區域內的散布不均勻，主要分布于A3/（A3+T3）lt;0.5的區域并且基因在x=0.5垂直線右邊分布較多，表明密碼子第3位上堿基T的使用頻率高于A，而G的使用頻率高于C。因此，3種油梨葉綠體基因組密碼子的第3位堿基在選擇上有一定偏好性，且密碼子使用偏好性除受到突變壓力影響外，也受自然選擇等因素的影響。

2.6 3種油梨葉綠體基因組最優密碼子分析結果

將3種油梨葉綠體基因組基因的ENC由小到大進行排序后，篩選出的高表達基因均為rps14、rps18、rpl16、psbA、rps12；低表達基因均為ycf4、clpP、petA、ycf3、ycf2。RSCUgt;1.00同時△RSCU≥0.08時表示最優密碼子，對3種油梨的RSCU和△RSCU進行統計分析，結果如表2所示。3種油梨都篩均選出15個最優密碼子，分別是UUU、UUA、UUG、CUU、AUU、GUU、UCU、CCU、CCC、ACU、ACC、GCU、UAA、UGU和AGA，其中9個最優密碼子以U結尾，3個最優密碼子以A結尾，2個最優密碼子以C結尾，1個最優密碼子以G結尾。由此可知，最優密碼子的第3位堿基大多都以A/U結尾。

3討論

本研究以3種油梨葉綠體基因組數據為研究對象，將篩選得到的49條CDS序列進行密碼子組成研究并分析影響其偏好性的因素。對葉綠體基因組中密碼子組成分析結果表明，GC在密碼子不同位置上的分布不均勻，第1、第2和第3位上堿基的GC表現為GC1gt;GC2gt;GC3。墨西哥種、地馬拉種和西印度群島種3種鱷梨屬基因組GC分別是39.13%、39.10%和39.12%，表明GC3以T/A結尾為主，與白楊（Populus alba）（Zhou et al.，2008）和胡桃（Juglans regia L.）（Zenget al.，2023）相似。GC1與GC2、GC3、GC和ENC均呈正相關，其中GC1與GC的相關系數最高，均為0.80。GC2與GC3、ENC均呈負相關。Wang等（2020）研究發現ENClt;35，表明密碼子偏好性強；當ENCgt;35，說明密碼子偏好性弱，3種油梨的ENC均gt;36，表明3種油梨密碼子的偏好性較弱。為研究導致密碼子偏好性的因素，本研究對3種油梨葉綠體基因組密碼子進行了中性繪圖、ENC-plot分析和PR2-plot分析，結果顯示，中性繪圖、PR2-plot分析和ENC-plot分析均表現出3種油梨密碼子使用偏好性主要受自然選擇的影響。ENC比值頻率分布結果顯示，較少基因分布在-0.05～0.05，大多數基因分布在-0.05～0.05之外，表明大多數基因的ENC實際值與ENC期望值差距較大，受突變壓力影響較小。PR2-plot分析結果表明，3種油梨葉綠體基因的坐標點在4個區域內的散布不均勻，第3位上的堿基T的使用頻率高于A，而G的使用頻率高于C，3種油梨葉綠體基因組密碼子的第3位堿基在選擇上有一定偏好性，偏好表現為第3位上的堿基T的使用頻率比A高，而G的使用頻率比C高。3種油梨的密碼子相關參數的數值幾乎重合，密碼子偏好性非常相似，推測3種油梨進化方式一致，且近緣種間葉綠體基因組進化較為保守。本研究結果發現3種油梨具有相同的最優密碼子，篩選出15個最優密碼子，分別是UUU、UUA、UUG、CUU、AUU、GUU、UCU、CCU、CCC、ACU、ACC、GCU、UAA、UGU和AGA，并且最優密碼子的第3位堿基大多都以A/U結尾，推測與雙子葉植物密碼子偏好A/U結尾存在一定關系（Wang and Roossinck，2006）。

4結論

3種油梨葉綠體基因組密碼子偏好性主要受到自然選擇的影響，同時也受突變壓力等多重因素的共同作用；篩選獲得的15個最優密碼子第3位堿基大多以A/U結尾。

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（責任編輯：陳燕，李洪艷）