龍牙百合LbAGPS1基因克隆與表達(dá)分析

摘要：【目的】克隆龍牙百合腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）小亞基編碼基因（LbAGPS1），并分析其表達(dá)模式，為通過調(diào)節(jié)該基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)百合鱗莖淀粉合成積累及膨大發(fā)育提供理論依據(jù)。【方法】利用同源克隆技術(shù)從龍牙百合組培苗幼嫩葉片中克隆到LbAGPS1基因，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及亞細(xì)胞定位；采用熒光定量PCR技術(shù)對LbAGPS1基因在龍牙百合葉片、鱗片、鱗莖盤等組織部位的表達(dá)差異進(jìn)行分析。【結(jié)果】LbAGPS1基因包含1個完整的長度為1569 bp的開放閱讀框（ORF），編碼1個由522個氨基酸組成的親水性蛋白，二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋（23.56%）、β-折疊（20.12%）、無規(guī)則卷曲（50.38%）、β-轉(zhuǎn)角（5.94%）組成；LbAGPS1蛋白具有葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶特征結(jié)構(gòu)，屬于cl33437家族蛋白，具有PLN02241、GlgC保守結(jié)構(gòu)域及9個低聚物界面特征與10個配體結(jié)合位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，LbAGPS1蛋白與亞洲百合AGPase蛋白小亞基具有較近的親緣關(guān)系。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，LbAGPS1蛋白在煙草葉片中的表達(dá)主要定位于葉綠體；實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，LbAGPS1基因主要在龍牙百合的鱗莖中表達(dá)，其相對表達(dá)量顯著高于葉片與鱗莖盤的相對表達(dá)量，鱗莖中又以內(nèi)部鱗片相對表達(dá)量最高，其次為中部、外部鱗片。【結(jié)論】LbAGPS1基因編碼蛋白含有cl33437家族PLN02241、GlgC保守結(jié)構(gòu)域及特征位點(diǎn)，主要在鱗莖的鱗片發(fā)育過程中表達(dá)，具有明顯的組織表達(dá)特異性。

關(guān)鍵詞：龍牙百合；LbAGPS1；淀粉；腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；基因表達(dá)

中圖分類號：S644.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0452-10

Cloning and expression analysis of LbAGPS1 gene in Lilium brownii var.Viridulum

ZHANG Jin-zhong1，2，3，LI Chao-sheng3，WEI Li-ping3，CHEN Cui-yun2，LIU Cui-hua2，SUN Jia-man2*

（1Guangzhou Academy of Agricultural and Rural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510335，China；2School of LifeSciences，Jiaying University，Meizhou，Guangdong 514015，China；3Biotechnology Research Institute，GuangxiAcademy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China）

Abstract：【Objective】To clone the small subunit encoding gene for adenosine diphosphate glucose pyrophosphory-lase（AGPase）in Lilium brownii var.viridulum（LbAGPS1），and analyze its expression pattern，which could provide theoretical basis for promoting starch synthesis，accumulation and expansion of lily bulbs by regulating the expression of this gene.【Method】The geneLbAGPS1 was cloned from young leaves of tissue culture seedlings ofL.brownii var.viridu-lum by homologous cloning technique，and bioinformatic analysis and subcellular localization were performed.The expression difference of LbAGPS1 gene in leaf，scale and bulb base disc of L.brownii var.viridulum was analyzed by fluorescence quantitative PCR.【Result】The results showed that the LbAGPS1 gene contained a complete open reading frame（ORF）of 1569 bp，encoding a hydrophilic protein consisting of 522 amino acids，the secondary structures con-sisted ofα-helix（23.56%），β-fold（20.12%），random coil（50.38%）andβ-turn（5.94%）.The LbAGPS1 protein had the characteristic structure of glucose-1-phosphate adenylate transferase and belonged to the cl33437 family protein.It had"PLN02241，GlgC conserved domains，9 oligomer interface features and 10 ligand binding sites.The phylogenetic tree indicated that the LbAGPS1 protein was closely related to the small subunits of AGPase protein in Asian lily.Subcellular localization analysis showed that LbAGPS1 protein was located in chloroplasts of tobacco leaves.Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the LbAGPS1 gene was mainly expressed in the bulbs ofL.brownii var.viridulum，and the expression level was significantly higher than that in the leaves and bulb base discs.The relative expression level was the highest in the inner scales of the bulbs，followed by the middle and outer scales.【Conclusion】The protein encoded by LbAGPS1 gene contains the PLN02241 and GlgC conserved domains and characteristic sites of the cl33437 family.It is mainly expressed during the development of scales in bulbs and has obvious tissue expression specificity.

Key words：Lilium brownii var.viridulum；LbAGPS1；starch；adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase；gene expression

Foundation items：Guangxi Natural Science Foundation（2021GXNSFAA196014）；Jiaying University Talent Intro-duction Scientific Research Start-up Project（2022RC97）；Jiaying University Research Project（2023KJY03，2022KJZ03）

0引言

【研究意義】龍牙百合（Lilium brownii var.viridu-lum）屬百合科百合屬植物，是我國主要的食用百合之一，同時也具有重要的藥用和觀賞價值（崔羅敏等，2021；李潤根等，2024）；其鱗莖富含淀粉，除用于鮮食外，通常被加工成百合干片、百合粉，為膳食藥用佳品，深受市場青睞。龍牙百合鱗莖種球繁育主要通過播種鱗片繁育小鱗莖的方式進(jìn)行，再經(jīng)2～3年田間種植生長才能成為商品種球（高柱等，2020）。通過組織培養(yǎng)方式繁育百合鱗莖種球是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，該方法能高效率、高質(zhì)量獲得統(tǒng)一性狀的脫毒鱗莖種球，但卻難以培育出膨大的、符合田間種植的鱗莖（韋莉萍等，2014；張進(jìn)忠等，2019）。龍牙百合鱗莖富含淀粉，其淀粉合酶等相關(guān)酶在鱗莖種球膨大發(fā)育、合成淀粉等代謝途徑中具有重要功能；腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophos-phorylase，AGPase）是利用ATP催化G-1-P合成淀粉原料單元腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）的關(guān)鍵酶（姜麗娜等，2008；周彩琴和王麗娟，2011），對AGPase編碼基因進(jìn)行功能分析和表達(dá)調(diào)節(jié)研究有利于了解淀粉合成代謝關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其調(diào)控機(jī)理，從而為開發(fā)高含量淀粉百合鱗莖繁育技術(shù)及改良龍牙百合品質(zhì)提供思路。【前人研究進(jìn)展】淀粉合成代謝相關(guān)酶在水稻、小麥、玉米、馬鈴薯等以收獲富含淀粉谷物或塊莖的糧食作物中研究較多，其中限速酶AGPase為重要的研究熱點(diǎn)。不同作物淀粉合成代謝研究表明，AGPase活性與淀粉含量存在顯著正相關(guān)（Sweet-love et al.，1999），提高其編碼基因的表達(dá)能有效促進(jìn)淀粉含量增加。Smidansky（2002）將玉米AGPase大亞基基因Sh2r6hs轉(zhuǎn)入小麥，其轉(zhuǎn)化植株籽粒產(chǎn)量和整株生物產(chǎn)量均顯著提高。Crevillén等（2005）通過導(dǎo)入反義RNA片段，轉(zhuǎn)錄后水平抑制馬鈴薯AGPase小亞基的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株塊莖AGPase活性顯著下調(diào)，淀粉含量也急劇下降；而導(dǎo)入AGPase基因glgC16進(jìn)行過表達(dá)，則發(fā)現(xiàn)馬鈴薯轉(zhuǎn)化植株塊莖淀粉含量顯著增加。在非主要農(nóng)作物及小眾經(jīng)濟(jì)作物中，AGPase編碼基因的克隆及功能分析也有相關(guān)報道，主要從基因表達(dá)模式對淀粉合成的影響及調(diào)節(jié)進(jìn)行研究。臧玉文等（2016）對紅香芋球莖膨大過程中主要淀粉合成相關(guān)酶活性的研究表明，芋莖基部膨大時AGPase活性與總淀粉含量呈顯著正相關(guān)，并認(rèn)為淀粉的積累與芋球莖的膨大發(fā)育密切相關(guān)。李梓銘等（2021）對浙貝母淀粉代謝基因及其鱗莖發(fā)育進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AGP相關(guān)基因在鱗莖中表達(dá)量最高，且均與淀粉含量呈顯著正相關(guān)。存在AGPase基因多態(tài)型的作物，其不同基因型在植株不同部位的表達(dá)模式也存在差異，對淀粉的合成積累有不同貢獻(xiàn)。甘曉燕等（2016）從22個不同類型馬鈴薯中分離出5種類型AGPase，當(dāng)AGPase基因型為ISQV時，馬鈴薯淀粉含量較高。一般認(rèn)為高等植物AGPase是由2個大亞基與2個小亞基組成的異源四聚體，小亞基主要發(fā)揮催化功能，其物種保守性高于大亞基，大亞基可調(diào)節(jié)小亞基發(fā)揮催化作用（周彩琴和王麗娟，2011）；小亞基含有PLN02241、GlgC保守結(jié)構(gòu)域及配體結(jié)合位點(diǎn)與低聚物界面特征位點(diǎn)；具有葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶功能（張進(jìn)忠等，2019）。前人研究認(rèn)為，AGPase是一個受3-磷酸甘油酸和Pi比率來控制其活性、從而調(diào)控淀粉合成的變構(gòu)酶（Fu etal.，1998），但光合器官與非光合籽粒貯藏器官的AGPase對此表現(xiàn)出差異性（Denyer etal.，1996），可能是由于基因多態(tài)性、表達(dá)特異性或所在的發(fā)揮功能部位存在差異造成。【本研究切入點(diǎn)】龍牙百合鱗莖從形成發(fā)育到商品鱗莖形成是淀粉合成與逐漸積累的過程，淀粉合酶對促進(jìn)淀粉合成代謝具有重要作用，但目前有關(guān)龍牙百合的研究主要集中在組織培養(yǎng)、誘導(dǎo)鱗莖膨大生長方面（張進(jìn)忠等，2019），而關(guān)于鱗莖淀粉合酶編碼基因的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過同源克隆獲取龍牙百合AGPase編碼基因LbAGPS1，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能分析；通過熒光定量PCR檢測該基因在龍牙百合植株不同部位的表達(dá)差異，驗(yàn)證其發(fā)揮功能部位，為通過調(diào)節(jié)該基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)百合鱗莖淀粉合成積累及膨大發(fā)育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

植物材料：龍牙百合組培苗（圖1），由本課題組采用組織培養(yǎng)方式獲得。

主要試劑：總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒DNA Gel Extraction Kit、pMD19-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購于生工生物工程（上海）股份有限公司，SYBR Master Mixture（TaKaRa）、本氏煙草、表達(dá)載體Pcambia2300-GFP購自陜西艾優(yōu)稷生物科技有限公司；其余常規(guī)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

主要儀器：Roche Light Cycler?480 II實(shí)時熒光定量PCR儀、OLYMPUS FV10-ASW激光共聚焦顯微鏡、Eppendorf 5810R離心機(jī)等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 LbAGPS1基因克隆取組培苗幼嫩葉片為材料，參照植物總RNA提取試劑盒說明提取RNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Nano Photometer檢測RNA純度與濃度；用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在NCBI數(shù)據(jù)庫搜索同源關(guān)系相近的該基因序列，并分析其保守序列。采用Primer Premier 5.0設(shè)計克隆引物，ORF-F：5'-ATGGCGATGGCTGCGATCGGCG TT-3'；ORF-R：5'-CGTAGTCTTATATCACAGTCCC GC-3'。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，進(jìn)行35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得目的條帶。利用回收試劑盒切膠回收目的片段，再克隆至pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，再涂布于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將PCR檢測陽性的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 LbAGPS1生物信息學(xué)分析利用ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）分析蛋白理化性質(zhì)；利用ExPASy ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測親/疏水性；利用SignalP-5.0 Services（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）分析信號肽；利用NPS@：SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auto-mat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測三級結(jié)構(gòu)；利用DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；利用NetPhos3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）預(yù)測磷酸化位點(diǎn)；利用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi）預(yù)測亞細(xì)胞定位；利用NCBI CDD程序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd）分析保守結(jié)構(gòu)域。使用DNAMAN 8.0進(jìn)行多序列比對，以MEGA 11.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Bootstrap設(shè)為1000次）。

1.2.3綠色熒光蛋白表達(dá)載體構(gòu)建引物設(shè)計如下：LbAGPS1-2300-F：5'-AGAACACGGGGGACGAGCT CATGGCGATGGCTGCGATCG-3'；LbAGPS1-2300-R：5'-ACCATGGTGTCGACTCTAGATATCACAGTCCCACTAGGGATCAA-3'。

反應(yīng)體系50μL：5×SF Buffer 10μL，上、下游引物各2μL，cDNA模板1μL，dNTP 1μL，Phants HS Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，ddH2O 33μL；擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃10 s，58℃10 s，72℃40 s，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸5 min；16℃保存?zhèn)溆谩?/p>

目的基因LbAGPS1與目標(biāo)載體連接：（1）用Sac I和Xba I雙酶切質(zhì)粒Pcambia2300-GFP，回收大片段；反應(yīng)體系40μL：10×Tango Buffer 8μL，Sac I 2μL，Xba I 1μL，Pcambia2300-GFP質(zhì)粒5μL，ddH2O 24μL，37℃酶切2 h后65℃5 min失活。（2）將上述回收產(chǎn)物與擴(kuò)增所得目的基因回收產(chǎn)物用同源重組連接酶進(jìn)行重組連接，再轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞；連接方法為將目的DNA片段和線性化載體以5∶1摩爾比加到EP管中進(jìn)行重組反應(yīng)，混勻后在37℃放置30min，立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化。（3）菌落PCR檢測與測序驗(yàn)證。在含卡那霉素平板上過夜培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)、白斑篩選，PCR鑒定陽性后挑取陽性菌落測序驗(yàn)證。

1.2.4亞細(xì)胞定位將陽性克隆在LB培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，提取Pcambia2300-LbAGPS1-GFP表達(dá)載體，使用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞；將檢測陽性的農(nóng)桿菌搖菌培養(yǎng)（28℃，200 r/min）；于滅菌的1.5 mL離心管中加入1.0 mL菌液；離心（1000×g，10 min）沉淀菌體，除去上清液，加1.0 mL滲透液，懸浮菌體；取少量懸浮菌液，用稀釋方法使OD600 mm為0.4，室溫靜置1～3 h后作為侵染液待侵染；用去針頭的注射器吸入1.0 mL侵染液，對選定生長期在5～8周的煙草葉背面輕推活塞進(jìn)行葉面侵染；注射后培養(yǎng)2 d，切取侵染區(qū)域，取表皮制片，采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5 LbAGPS1基因表達(dá)分析熒光定量PCR引物設(shè)計，目的基因F：5'-GGATGCCGACAGGAGGTT-3'；R：5'-AATGCGGG CGTTCTTGTC-3'；擴(kuò)增103bp。內(nèi)參基因GAPDH-F：5'-CCATCCAGCAAGGACTGGA G-3'；GAPDH-R：5'-CCGCCTTCTCAAGCCTAACA-3'；擴(kuò)增187 bp。

取葉片與植株下端形成的小鱗片（分內(nèi)、中、外3部分）及鱗莖盤（鱗片著生點(diǎn)）為材料提取RNA。采用試劑盒將1.0μL Oligo dT和2.0μg RNA加入到PCR小管中，補(bǔ)充RNase-free H2O至10.0μL；混勻后離心，73.5℃溫浴7min；之后立即置于冰水混合物中冰浴退火；再加入5×RT buffer 4.0μL、10 mmol/L dNTPs 2.0μL、RNasin（40 U/μL）0.4μL、M-MLV-RTase（200 U/μL）1.0μL、RNase-free H2O 2.6μL進(jìn)行冰上反應(yīng)；上述體系在43.5℃水浴反應(yīng)1h，然后在73.5℃水浴3 min使RT酶失活，得到RT產(chǎn)物cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩７磻?yīng)體系12.0μL：SYBR premix Ex Taq 6.0μL，引物mix（5μmol/L）0.3μL，cDNA模板0.6μL，RNase-free H2O 5.1μL，采用兩步法進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃5 s，60℃30 s，進(jìn)行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量（Livak and Schmitt‐gen，2001）。

2結(jié)果與分析

2.1 LbAGPS1基因克隆及序列分析結(jié)果

提取龍牙百合組培苗葉片RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增LbAGPS1基因編碼序列，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠擴(kuò)增電泳分析，檢測結(jié)果（圖2）顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1000～2000 bp，符合預(yù)期結(jié)果。測序結(jié)果表明，LbAGPS1基因全長1569 bp（GenBank No.MN580669.1），經(jīng)序列比對分析該序列為編碼AGPase小亞基的CDS區(qū)；參考高度相似性序列注釋信息，命名為LbAGPS1；通過同源克隆獲得LbAGPS1編碼的開放閱讀框（ORF）全長序列，該序列長1569 bp，編碼522個氨基酸殘基（圖3）。

2.2 LbAGPS1蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 LbAGPS1蛋白理化性質(zhì)分析蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，LbAGPS1蛋白包含522個氨基酸，其中含量最高的是丙氨酸（Ala），占比10.20%；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為60，帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為57；蛋白分子式為C2529H4031N687O765S17，總原子數(shù)為8029，相對分子量為56845.99 Da，理論等電點(diǎn)為6.35；不穩(wěn)定系數(shù)為37.05，為穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為91.65；第183位氨基酸出現(xiàn)明顯的親水峰值，親/疏水性指數(shù)為-2.489，第211位氨基酸呈現(xiàn)疏水峰值，親/疏水性指數(shù)為2.311，親水性平均值為-0.158，屬于親水蛋白（圖4）。蛋白信號肽分析結(jié)果顯示，該蛋白無信號肽，推測為非分泌蛋白。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)LbAGPS1蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示，LbAGPS1蛋白具有43個磷酸化位點(diǎn)，包括絲氨酸21個、蘇氨酸16個和酪氨酸6個。Plant-mPLoc預(yù)測顯示LbAGPS1蛋白定位于葉綠體。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，LbAGPS1蛋白由23.56%的α-螺旋、20.12%的β-折疊、5.94%的β-轉(zhuǎn)角和50.38%的無規(guī)則卷曲組成（圖5）。SWISS-MODEL預(yù)測LbAGPS1蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖6），應(yīng)用ProMod3（Studer etal.，2021）基于與目標(biāo)模板的比對，其三維結(jié)構(gòu)根據(jù)篩選的質(zhì)量最高模板1yp4.1.A（模板庫SMTL，2024-05-02）建立。以模板的四元結(jié)構(gòu)用于寡聚形式對目標(biāo)序列進(jìn)行建模，其四元結(jié)構(gòu)質(zhì)量評估（QSQE）分值為0.72，反映基于模板構(gòu)建的模型鏈間接觸預(yù)期準(zhǔn)確性較高，表明其與2個ADP亞基、1個ADQ亞基構(gòu)成異源四聚體的形式存在；LbAGPS1蛋白三級結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果相符合。

2.2.2 LbAGPS1蛋白保守結(jié)構(gòu)預(yù)測分析應(yīng)用NCBI提供的CDD程序檢索，結(jié)果顯示，LbAGPS1蛋白屬于cl33437家族蛋白（圖7），在307～1566 bp間具有PLN02241、GlgC保守結(jié)構(gòu)域，此類結(jié)構(gòu)域具有葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶特征；在第150與第205個氨基酸之間有9個低聚物界面特征位點(diǎn)；在第4與第176個氨基酸之間有10個配體結(jié)合位點(diǎn)。2.2.3 LbAGPS1氨基酸序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析通過NCBI Blastp程序比對發(fā)現(xiàn)LbAGPS1氨基酸序列與其他植物AGP蛋白小亞基相似性較高，前50條數(shù)據(jù)顯示相似性為85.00%至99.00%。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果顯示，龍牙百合LbAGPS1蛋白與亞洲百合AGPase小亞基聚在一個分支（圖8），其相似性為99.43%，且與其他植物AGP小亞基的相似性均高于86.00%，說明該序列在物種間及進(jìn)化發(fā)育上相對保守。

2.3 LbAGPS1蛋白表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位結(jié)果

成功構(gòu)建綠色熒光蛋白表達(dá)載體是進(jìn)行亞細(xì)胞定位的前提。通過同源克隆獲得編碼AGPase的同源目的基因LbAGPS1，圖9為目的基因LbAGPS1克隆片段；采用雙酶切方法將目的基因LbAGPS1與Pcambia2300-GFP目標(biāo)載體連接，連接后菌落PCR條帶顯示在1500bp附近（圖10），與預(yù)期結(jié)果相符，測序結(jié)果驗(yàn)證準(zhǔn)確。圖11為成功構(gòu)建的綠色熒光蛋白表達(dá)載體Pcambia2300-LbAGPS1-GFP。

表達(dá)載體Pcambia2300-LbAGPS1-GFP經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染煙草葉片，觀察葉片細(xì)胞中LbAGPS1-GFP融合蛋白的綠色熒光，結(jié)果顯示，LbAGPS1蛋白在煙草葉片中的表達(dá)主要定位于葉綠體（質(zhì)體）（圖12），與Plant-mPLoc預(yù)測結(jié)果一致。

2.4 LbAGPS1基因的表達(dá)分析結(jié)果

組織特異性分析結(jié)果（圖13）顯示，龍牙百合LbAGPS1基因在組培苗葉片、鱗片、鱗莖盤中均有表達(dá)，且在不同組織的表達(dá)存在差異。LbAGPS1基因在葉片與鱗莖盤中的相對表達(dá)量差異不顯著（Pgt;0.05），但在鱗片中的相對表達(dá)量顯著上調(diào)（Plt;0.05，下同），且不同部位鱗片中的相對表達(dá)量均有顯著差異，以內(nèi)部鱗片的相對表達(dá)量最高，其次為中部鱗片及外部鱗片。結(jié)果表明龍牙百合鱗莖形成發(fā)育過程中，LbAGPS1基因主要在鱗片上調(diào)表達(dá)，特別是形成初期的內(nèi)部鱗片表達(dá)量較高，有利于淀粉合成所需葡萄糖供體ADPG的合成與積累，進(jìn)而促進(jìn)富含淀粉鱗片的形態(tài)建成。

3討論

龍牙百合鱗莖富含淀粉，鱗莖發(fā)生、形成及發(fā)育過程也是淀粉合成代謝與積累的過程；通過基因調(diào)控技術(shù)調(diào)節(jié)百合鱗莖形成、生長發(fā)育過程中淀粉的合成途徑，或篩選淀粉合成代謝途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量高的優(yōu)良品系對于百合產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展具有積極意義。淀粉合酶AGPase及編碼基因在高淀粉含量的谷物類及鱗莖、薯類作物中研究較多；因以淀粉為收獲目的，提高作物淀粉產(chǎn)量顯得尤為重要，從酶活生理及基因表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)已成為提高淀粉產(chǎn)量的重要途徑（王謝琴等，2022；田娜等，2023；張正珍等，2023；吳子牛等，2024）；通過對AGPase編碼基因研究發(fā)現(xiàn)，在多種作物中過表達(dá)該基因能顯著提高淀粉合成，而基因缺失表達(dá)則顯著降低淀粉含量（Crevillén et al.，2005），表明可通過基因改造或正調(diào)控AGP基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)作物的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)；同時在不同作物中存在AGP基因多態(tài)型分布，利用分子技術(shù)選育高表達(dá)的基因型品系為作物品種改良提供了新的思考途徑。蘭州百合鱗莖發(fā)育過程中鱗片形態(tài)建成、鱗莖膨大與淀粉合成關(guān)鍵酶AGPase及編碼基因、淀粉的合成積累呈正相關(guān)（張進(jìn)忠等，2019），且編碼基因在鱗莖組織部位具有特異性高表達(dá)，同樣的結(jié)論也出現(xiàn)在對芋、薯類、貝母等作物的研究中（臧玉文等，2016；甘曉燕等，2016；李梓銘等，2021）。對于龍牙百合，膨大的商品鱗莖更為市場所需，由此衍生出有利于提高AGPase活性及編碼基因上調(diào)表達(dá)的技術(shù)措施，如龍牙百合生產(chǎn)種植中通過在初花期摘除花苞達(dá)到營養(yǎng)物質(zhì)向鱗莖庫積累的效果，這可能與花期雌雄蕊發(fā)育需要AGP相關(guān)基因特異性在花器官組織表達(dá)為其提供能量與物質(zhì)有關(guān)（吳世文等，2010），花苞摘除后更有利于AGP在鱗莖組織表達(dá)，從而提高淀粉產(chǎn)量及促使鱗莖膨大；在百合組培鱗莖生產(chǎn)中通過增加碳源用量及利用植物生長調(diào)節(jié)劑上調(diào)AGP相關(guān)基因表達(dá)以提高AGPase活性，從而促進(jìn)淀粉的合成與積累，有利于百合小鱗莖的離體誘導(dǎo)及后期的試管鱗莖膨大發(fā)育（張進(jìn)忠等，2019）。

本研究所克隆的LbAGPS1基因經(jīng)分析含有葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶特征的保守結(jié)構(gòu)域及特征位點(diǎn)，經(jīng)比對分析發(fā)現(xiàn)與其他作物AGP相關(guān)基因具有高度相似性及同源性，為淀粉合成途徑關(guān)鍵酶AGPase編碼基因，后期研究可利用轉(zhuǎn)錄組測序分析不同品種百合AGP相關(guān)基因或龍牙百合中該基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)和篩選淀粉合成代謝途徑中表達(dá)效率較優(yōu)的基因型，進(jìn)而選育優(yōu)良品種。本研究的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)在植物光合器官中LbAGPS1定位于綠葉體，而前人研究表明在貯藏器官中則定位于質(zhì)體（Lee et al.，2007），龍牙百合鱗莖組織培養(yǎng)過程中其受光照的外部鱗片表面會轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，可能由于質(zhì)體（前質(zhì)體）向葉綠體、有色體等質(zhì)體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。另外，通過實(shí)時熒光定量PCR對Actin、GAPDH等常用內(nèi)參基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)GAPDH為龍牙百合不同器官間穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為百合不同發(fā)育期或不同組織部位基因表達(dá)分析研究提供了內(nèi)參基因參考。

4結(jié)論

克隆到龍牙百合淀粉合成代謝途徑關(guān)鍵酶基因LbAGPS1，該基因具有葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶特征的保守結(jié)構(gòu)域及特征位點(diǎn)，編碼催化形成淀粉鏈延長所需底物ADPG的關(guān)鍵酶，與其他作物的AGPase小亞基基因序列高度相似，且主要在鱗莖發(fā)育中表達(dá)。

參考文獻(xiàn)（References）：

崔羅敏，萬麟，周樹軍.2021.三倍體觀賞百合與二倍體食用龍牙百合的雜交分析［J］.西北植物學(xué)報，41（6）：971-976.［Cui L M，Wan L，Zhou S J.2021.Analysis of the hybridization between triploid ornamental lily（Lilium）and diploid edible Lilium brownii var.viridulum［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，41（6）：971-976.］doi：10.7606/j.issn.1000-4025.2021.06.0971.

甘曉燕，鞏檑，聶峰杰，石磊，陳虞超，張麗，宋玉霞.2016.馬鈴薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因多態(tài)性分析［J］.分子植物育種，14（7）：1781-1787.［Gan XY，Gong L，Nie F J，Shi L，Chen Y C，Zhang L，Song Y X.2016.Gene poly-morphism analysis research of AGP in potato［J］.Molecu-lar Plant Breeding，14（7）：1781-1787.］doi：10.13271/j.mpb.014.001781.

高柱，王小玲，王斌，李潤根.2020.龍牙百合脫毒種球培育的施肥效應(yīng)［J］.中國瓜菜，33（11）：56-60.［Gao Z，Wang X L，Wang B，Li R G.2020.Effects of fertilization on the non-virus bulb cultivation of Lilium brownii var.viridulum［J］.China Cucurbits and Vegetables，33（11）：56-60.］doi：10.16861/j.cnki.zggc.2020.0285.

姜麗娜，李冬芬，李春喜，邵云.2008.小麥蔗糖合成酶和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的研究進(jìn)展［J］.作物雜志，（6）：11-15.［Jiang L N，Li D F，Li C X，Shao Y.2008.Recent advances on wheat sucrose synthase and ADP-glucose pyrophosphorylase［J］.Crops，（6）：11-15.］doi：10.16035/j.issn.1001-7283.2008.06.013.

李潤根，于鑫，孫琴琴，黃翠翠，曾慧蘭.2024.龍牙百合褐斑病病原的鑒定、生物學(xué)特性及室內(nèi)藥劑篩選［J］.核農(nóng)學(xué)報，38（8）：1487-1495.［Li R G，Yu X，Sun Q Q，Huang C C，Zeng H L.2024.Identification，characterization the leaf brown spot pathogen in Lilium brownii var.viridulum and screening fungicides against Alternaria arborescens［J］.Journal of Nuclear Agricultural Sciences，38（8）：1487-1495.］doi：10.11869/j.issn.1000-8551.2024.08.1487.

李梓銘，泮儀晨，范小平，江建銘，王志安，王忠華.2021.浙貝母淀粉、蔗糖代謝相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析［J］.核農(nóng)學(xué)報，35（11）：2470-2481.［Li Z M，Pan Y C，F(xiàn)an X P，Jiang J M，Wang Z A，Wang Z H.2021.Cloning and expression analysis of genes related to starch and sucrose metabolism in Fritillaria thunbergia［J］.Journal of Nuclear Agricultural Sciences，35（11）：2470-2481.］doi：10.11869/j.issn.100-8551.2021.11.2470.

田娜，楊亞亞，者永清，王建鵬，吳娜，劉吉利.2023.施鉀對寧南旱區(qū)馬鈴薯塊莖淀粉含量及淀粉合成相關(guān)酶活性的影響［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，58（6）：101-109.［Tian N，Yang Y Y，Zhe Y Q，Wang J P，Wu N，Liu J L.2023.Effects of potassium application on starch content and enzyme activities associated with starch synthesis in potato tuber in arid areas of southern Ningxia［J］.Journal of Gansu Agricultural University，58（6）：101-109.］doi：10.13432/j.cnki.jgsau.2023.06.012.

王謝琴，李瑞雪，張紅，陳嬌，于小蓉，劉漢梅.2022.小麥淀粉合酶基因家族成員的表達(dá)差異分析［J］.麥類作物學(xué)報，42（8）：938-947.［Wang X Q，Li R X，Zhang H，Chen J，Yu X R，Liu H M.2022.Expression differentiation of starch synthase gene family members in wheat［J］.Journal of Triticeae Crops，42（8）：938-947.］doi：10.7606/j.issn.1009-1041.2022.08.04.

韋莉萍，韋紹龍，蘇賓，閉志強(qiáng)，韓沅杉，張進(jìn)忠.2014.蘭州百合鱗莖再生繁殖體系的建立［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，45（5）：742-748.［Wei L P，Wei S L，Su B，Bi Z Q，Han Y S，Zhang J Z.2014.Regeneration propagation system estab-lishment of bulblet derived from scale of Lilium davidii var.Unicolor（Hoog）Cotton［J］.Journal of Southern Agri-culture，45（5）：742-748.］doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2014.5.742.

吳世文，高慶榮，孫哲，王茂婷，孫正娟，袁凱，于松.2010.腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性對小麥K、V、T型不育系育性及籽粒形成的影響［J］.作物學(xué)報，36（6）：995-1002.［Wu S W，Gao Q R，Sun Z，Wang M T，Sun Z J，Yuan K，Yu S.2010.Effects of ADP-glucose pyrophospho-rylase activity on sterility and development of grain in K，V，and T-cytoplasmic male sterile lines in wheat［J］.Acta Agronomica Sinica，36（6）：995-1002.］doi：10.3724/SP.J.1006.2010.00995.

吳子牛，何麗梅，熊瑩，陳凱瑞，楊志遠(yuǎn)，孫永健，呂旭，馬均.2024.氮素穗肥對雜交秈稻籽粒灌漿影響及其與淀粉合成關(guān)鍵酶活性間關(guān)系［J］.中國水稻科學(xué)，38（1）：48-56.［Wu Z N，He L M，Xiong Y，Chen K R，Yang Z Y，Sun Y J，LüX，Ma J.2024.Effect of nitrogen fertilizer topdres-sing for panicle differentiation on grain filling of hybrid indica rice and its relationship with the activities of key enzymes for starch synthesis［J］.Chinese Journal of Rice Science，38（1）：48-56.］doi：10.16819/j.1001-7216.2024.230401.

臧玉文，蔣芳玲，程雅琪，孔祥宇，吳震.2016.紅香芋試管球莖膨大過程中主要碳水化合物含量以及淀粉合成相關(guān)酶活性的動態(tài)研究［J］.西北植物學(xué)報，36（4）：700-705.［Zang Y W，Jiang F L，Cheng Y Q，Kong X Y，Wu Z.2016.Study on the dynamic changes of the major carbohy-drate content and the related enzyme activities during the micro corm development of Colocasia esculenta［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，36（4）：700-705.］doi：10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0700.

張進(jìn)忠，孫嘉曼，李朝生，韋莉萍，范燕萍.2019.百合鱗莖發(fā)育過程中淀粉合成相關(guān)酶基因的克隆及表達(dá)分析［J］.廣西植物，39（4）：446-452.［Zhang J Z，Sun J M，Li C S，Wei L P，F(xiàn)an Y P.2019.Cloning of starch synthesis-related enzyme gene and its expression analysis in process of bulb-let development of Lilium［J］.Guihaia，39（4）：446-452.］doi：10.11931/guihaia.gxzw201802015.

張正珍，慕瑞瑞，王佳，徐燦，陳永偉，張戰(zhàn)勝，吳宏亮，康建宏.2023.鉀素對玉米子粒淀粉形成及產(chǎn)量的影響［J］.玉米科學(xué)，31（6）：49-58.［Zhang Z Z，Mu R R，Wang J，Xu C，Chen Y W，Zhang Z S，Wu H L，Kang J H.2023.Effect of potassium on starch formation and yield of maize kernel［J］.Journal of Maize Sciences，31（6）：49-58.］doi：10.13597/j.cnki.maize.science.20230608.

周彩琴，王麗娟.2011.腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，32（2）：56-59.［Zhou C Q，Wang L J.2011.Advances of research on ADP-glucose pyrophos-phorylase［J］.Journal of Agricultural Sciences，32（2）：56-59.］doi：10.3969/j.issn.1673-0747.2011.02.013.

Crevillén P，Ventriglia T，Pinto F，Orea A，Mérida A，Romero J M.2005.Differential pattern of expression and sugar regulation of Arabidopsis thaliana ADP-glucose pyrophosphorylase-encoding genes［J］.Journal of Biologi-cal Chemistry，280（9）：8143-8149.doi：10.1074/jbc.M411 713200.

Denyer K，Dunlap F，Thorbjrnsen T，Keeling P，Smith A M.1996.The major form of ADP-glucose pyrophosphorylase in maize endosperm is extra-plastidial［J］.Plant Physio-logy，112（2）：779-785.doi：10.1104/pp.112.2.779.

Fu Y，Ballicora M A，Leykam J F，Preiss J.1998.Mechanism of reductive activation of potato tuber ADP-glucose pyro-phosphorylase［J］.Journal of Biological Chemistry，273（39）：25045-25052.doi：10.1074/jbc.273.39.25045.

Lee S K，Hwang S K，Han M，Eom J S，Kang H G，Han Y，Choi S B，Cho M H，Bhoo S H，An G，Hahn T R，Okita T W，Jeon J S.2007.Identification of the ADP-glucose pyro-phosphorylase isoforms essential for starch synthesis in the leaf and seed endosperm of rice（Oryza sativa L.）［J］.Plant Molecular Biology，65（4）：531-546.doi：10.1007/s11103-007-9153-z.

Livak K J，Schmittgen T D.2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCt method［J］.Methods，25（4）：402-408.doi：10.1006/meth.2001.1262.

Smidansky E D，Clancy M，Meyer F D，Lanning S P，Blake N K，Talbert L E，Giroux M J.2002.Enhanced ADP-glucose pyrophosphorylase activity in wheat endosperm increases seed yield［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，99（3）：1724-1729.doi：10.1073/pnas.022635299.

Studer G，Tauriello G，Bienert S，Biasini M，Johner N，Schwede T.2021.ProMod3—A versatile homology modelling tool-box［J］.PLoS Computational Biology，17（1）：e1008667.doi：10.1371/journal.pcbi.1008667.

Sweetlove L J，Müller-Rober B，Willmitzer L，Hill S A.1999.The contribution of adenosine 5'-diphosphoglucose pyro-phosphorylase to the control of starch synthesis in potato tubers［J］.Planta，209（3）：330-337.doi：10.1007/s004250 050640.

（責(zé)任編輯：王暉）