熱帶胎生睡蓮保羅藍(lán)基因組大小及Survey測序分析

摘要：【目的】研究熱帶胎生睡蓮保羅藍(lán)基因組大小等特征，為開展睡蓮全基因組圖譜繪制、重要性狀功能基因挖掘及加快熱帶胎生睡蓮分子育種進(jìn)程提供參考依據(jù)。【方法】以保羅藍(lán)睡蓮2～3 cm長的幼嫩根尖和3～5 cm長幼嫩未展開的葉片為試驗(yàn)材料，以已知基因組大小的玉米為內(nèi)參植物，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測并估算保羅藍(lán)睡蓮的基因組大小，并與已公開發(fā)表的二倍體睡蓮藍(lán)星進(jìn)行比較，初步判斷保羅藍(lán)睡蓮的染色體倍型。采用熒光原位雜交法分析保羅藍(lán)睡蓮染色體數(shù)目、長度等，并結(jié)合基于K-mer分析的全基因組Survey測序和生物信息學(xué)方法，進(jìn)一步明確保羅藍(lán)睡蓮基因組大小、倍性、雜合率、重復(fù)率等信息。【結(jié)果】流式細(xì)胞術(shù)估算保羅藍(lán)睡蓮基因組大小為0.82 Gb，對比二倍體藍(lán)星睡蓮基因組，可初步判斷出其為四倍體。利用基因組DAPI熒光染色及熒光原位雜交進(jìn)一步證明保羅藍(lán)睡蓮基因組為四倍體，具有56條染色體，長度為0.45～1.50μm，核型公式為2n=4x=56。利用BGI測序平臺對保羅藍(lán)睡蓮進(jìn)行Survey測序分析，獲得原始序列615552560條，有效堿基共92.33 Gb，其中GC含量為39.45%，Q20為97.08%，Q30為91.97%；有效序列（Clean reads）615552500條，有效堿基共89.17 Gb，其中Clean reads中GC含量為39.00%，Q20為97.11%，Q30為92.05%。Survey總測序深度為106.9X，通過K-mer（K=19）分析修正后的保羅藍(lán)睡蓮基因組大小為834.12 Mb，雜合率為1.95%，重復(fù)率為68.48%。Smudgeplot分析結(jié)果也表明保羅藍(lán)睡蓮為四倍體，其中以四倍體AAAB出現(xiàn)的頻率最高，為0.43。【結(jié)論】保羅藍(lán)睡蓮基因組屬于高雜合高重復(fù)的復(fù)雜四倍體基因組，推測其基因組結(jié)構(gòu)為AAAB，具有3套同源單倍型基因組，組裝難度較高。

關(guān)鍵詞：保羅藍(lán)睡蓮；流式細(xì)胞術(shù)；熒光原位雜交；Survey測序；K-mer分析

中圖分類號：S682.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0407-09

Genome size and Survey sequencing of tropical viviparous Nymphaea‘Paul Stetson’

SU Qun1，ZHAO Jia-hui1，WANG Hong-yan1，LAYan-fei1，F(xiàn)ANG Ming-ya2，SHENG Wei2，SHI Lin2，TANGYu-wei3，TIAN Min4，WANG Ling-yun2*

（1Flower Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007；2Jinhua Academy of Agricultural Sciences/Zhejiang Key Laboratory of Characteristic Aquatic Vegetable Breeding and Cultivation，Jinhua，Zhejiang 321000；3Guangxi Subtropical Crop Research Institute，Nanning，Guangxi 530001；4Flower Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences/National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture，Kunming，Yunnan 650200）

Abstract：【Objective】The study aimed to investigate the genome size and related characteristics of the tropical vivipa-rous Nymphaea‘Paul Stetson’and thereby provide reference for constructing a whole-genome map，mining functional genes for key traits，and accelerating the molecular breeding of tropical viviparous water lilies.【Method】Young root tips（2-3 cm）and young and unfolded leaves（3-5 cm）of Nymphaea‘Paul Stetson’were used as experimental materials，with maize—whose genome size was known—serving as an internal reference.Flow cytometry was employed to estimate the genome size of Nymphaea‘Paul Stetson’，and the results were compared with those of the diploid Nymphaea colora-ta to preliminarily assess its ploidy.In addition，fluorescence in situ hybridization（FISH）was used to analyze the chro-mosome number and length.The genome size，ploidy，heterozygosity rate and repetition rate of Nymphaea‘Paul Stet-son’were further clarified combined with K-mer analysis on whole-genome survey sequencingbioinformatics and bioin-formatics information.【Result】Flow cytometry estimated the genome size of Nymphaea‘Paul Stetson’to be 0.82 Gb，and compared with the genome of diploid Nymphaea‘Paul Stetson’，it could be preliminatively identified as tetraploid.Genomic DAPI fluorescence staining and FISH further confirmed that the genome of Nymphaea‘Paul Stetson’was tetra-ploid，comprising 56 chromosomes with lengths ranging from 0.45 to 1.50μm and a karyotype formula of 2n=4x=56.BGI sequencing platform was used to carry out Survey sequencing analysis of Nymphaea‘Paul Stetson’，and 615552560 raw data were obtained，with a total of 92.33 Gb，in which GC content was 39.45%，Q20 was 97.08%，and Q30 was 91.97%.There were 615552500 clean reads（89.17 Gb），of which the GC content was 39.00%，Q20 was 97.11%and Q30 was 92.05%.The total sequencing depth of Survey was 106.9X.The genome size of the revised Nymphaea‘Paul Stetson’was 834.12Mb，the heterozygous rate was 1.95%，and the repetition rate was 68.48%.The results of Smudgeplot analysis also showed that Nymphaea‘Paul Stetson’was tetraploid，and the frequency of tetraploid AAAB was the highest（0.43）.【Conclusion】The genome of Nymphaea‘Paul Stetson’is a complex tetraploid characterized by high heterozygosity and a high repetition rate.Its structure is hypothesized to be of the AAAB type，comprising 3 sets of homologous haploid ge-nomes，which presents great challenges for genome assembly.

Key words：Nymphaea‘Paul Stetson’；flow cytometry；fluorescence in situ hybridization（FISH）；Survey sequen-cing；K-mer analysis

Foundation items：Guangxi Natural Science Foundation（2023GXNSFAA026279，2023GXNSFBA026347）；Scien-ce and Technology Development Fund and Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinong-ke 2025YP105，Guinongke 2024YP133）

0引言

【研究意義】睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea L.）植物通常具有絢麗多彩的花色和葉色，優(yōu)雅迷人的香氣以及重要的食用和藥用價值，因而受到世界人民的喜愛。全世界睡蓮屬植物約50余種（含變種），通常被分為5個亞屬：Nymphaea、Anecphya、Brachyceras、Hydrocallis和Lotos（Thomas et al.，2011；李淑娟等，2019），根據(jù)生態(tài)類型又可分為耐寒睡蓮和熱帶睡蓮兩大類，熱帶睡蓮在花型、花色和花香上普遍優(yōu)于耐寒睡蓮（黃國振等，2009）。熱帶胎生睡蓮為熱帶睡蓮中一類特殊且重要的睡蓮，因其葉片具有胎生能力，能夠長出新的完整植株，可在短時間內(nèi)繁殖出大量個體，故相較于其他熱帶睡蓮，其種苗價格較為低廉。此外，熱帶胎生睡蓮花梗挺拔、香氣宜人、花葉俱美，因而在園林水景、鮮切花、干花（代用茶）及家庭園藝中得到廣泛應(yīng)用。目前有關(guān)睡蓮屬植物全基因組學(xué)的研究相對較少，已公布的2套睡蓮基因組均為二倍體，且僅有1套組裝到染色體級別（Povilus et al.，2020；Zhang et al.，2020），睡蓮參考基因組過少已嚴(yán)重制約睡蓮屬植物分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。蘇群等（2021）、毛立彥等（2024）利用已公布的二倍體藍(lán)星睡蓮（N.colorata）基因組為參考基因組，分別對熱帶胎生睡蓮小花（N.micrantha）的葉片和保羅藍(lán)睡蓮（Nymphaea‘Paul Stetson’）的花朵不同部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及有參分析，發(fā)現(xiàn)基因比對率僅在60%左右，因此，開展熱帶胎生睡蓮全基因組測序，對開展睡蓮全基因組圖譜繪制、重要性狀功能基因挖掘及加快熱帶胎生睡蓮分子育種進(jìn)程具有重要推動作用。【前人研究進(jìn)展】現(xiàn)階段睡蓮的研究主要集中在資源的引種評價、分子標(biāo)記篩選和遺傳多樣性分析、逆境脅迫下生理響應(yīng)、花色、花香、開花調(diào)控、內(nèi)含物功能活性物質(zhì)及基因組學(xué)和區(qū)系進(jìn)化等方面。其中，在睡蓮資源的引種評價研究方面，蘇群等（2019）、潘慶龍等（2021）基于表型性狀測定和統(tǒng)計學(xué)運(yùn)用等方法，分別對廣西和海南引種的睡蓮資源進(jìn)行評價，初步構(gòu)建了1個睡蓮屬植物的引種綜合評價模型。在分子標(biāo)記篩選和遺傳多樣性分析研究方面，蘇群等（2020，2023）、毛立彥等（2023）分別利用篩選出的ISSR標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記分析了睡蓮屬植物的遺傳多樣性，并構(gòu)建了部分睡蓮原生種（變種）的DNA指紋圖譜和36份睡蓮核心種質(zhì)。在睡蓮逆境脅迫下生理響應(yīng)研究方面，王虹妍等（2022）采用人工遮光方式，探尋米奴塔睡蓮（N.minuta）在不同光照強(qiáng)度下的生長特性及抗氧化生理響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全光照條件下米奴塔睡蓮生長狀況最佳，著花量最大；中度遮光脅迫下生長狀況良好；弱光脅迫則不利于其營養(yǎng)和生殖生長。在睡蓮花色、花香、開花調(diào)控研究方面，Wu等（2016）利用轉(zhuǎn)錄組測序和代謝物分析，初步揭示泰國王睡蓮（Nymphaea‘King of Siam’）藍(lán)色花瓣形成機(jī)制，并指出UA3GTs是誘導(dǎo)泰國王睡蓮藍(lán)色花瓣形成的重要調(diào)控基因。Ke等（2018）通過對睡蓮花瓣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生長素相關(guān)基因在調(diào)控睡蓮晝夜節(jié)律開花中起到中心調(diào)節(jié)作用。Zhou等（2024）利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對黃金國睡蓮（Nymphaea‘Eldorado’）不同花期和不同花器官中的揮發(fā)物進(jìn)行檢測分析，共檢測到60種揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs），結(jié)果表明不同花期和不同花器官的揮發(fā)性有機(jī)化合物含量存在顯著差異。在睡蓮內(nèi)含物功能活性物質(zhì)研究方面，Pank-lai等（2024）從柔毛齒葉睡蓮（N.pubescens）中提取到的化合物槲皮素3-甲基醚3′-O-β-木吡喃苷被證明對小鼠有血管松弛作用。在睡蓮基因組學(xué)和區(qū)系進(jìn)化研究方面，Povilus等（2020）組裝了盧旺達(dá)睡蓮（N.thermarum）的基因組草圖，并將其與其他有形成層和無形成層譜系的基因組進(jìn)行比較，揭示了基因丟失和分化譜系的特異性模式，指出睡蓮是第1個通過失去維管形成層而偏離其祖先木本習(xí)性的世系之一。Zhang等（2020）通過構(gòu)建藍(lán)星睡蓮染色體級基因組，發(fā)現(xiàn)睡蓮目（Nymphaeales）是僅次于無油樟目（Amborellales）最古老的被子植物基部類群之一。鑒于植物基因組倍型、重復(fù)率等的復(fù)雜多樣性，在開展全基因組測序前對該物種基因組進(jìn)行評估，以確定最佳測序、組裝策略等顯得尤為重要（丁淑金等，2023）。流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）和基于全基因組低深度測序的K-mer分析常被用于物種基因組信息的評估，已在園藝觀賞植物如美人蕉（Canna indica L.）（江思容等，2022）、阿丁楓（Altingia chinensis）（丁淑金等，2023）、蜘蛛抱蛋屬（Aspidistra）（陳婷婷，2024）和觀賞海棠屬（Malus）（張艷艷等，2024）；藥用植物如車前屬（Plantago）（梅啟明等，2021）、地黃（Rehmannia glutinosa）（趙樂等，2021）、菊苣（Cichorium intybus L.）（費(fèi)星宇等，2022）和白及（Bletillastriata）（楊淵等，2023）等得到廣泛應(yīng)用，但在多倍體睡蓮中的應(yīng)用尚未見公開報道。【本研究切入點(diǎn)】熱帶胎生睡蓮的花型和花色等性狀相對單一，具有較大的育種改進(jìn)空間。睡蓮屬植物染色體倍型極為復(fù)雜，具有豐富的表型多樣性，并表現(xiàn)出高水平的種間多態(tài)性，不同亞屬間在花型、花色、葉色、花香甚至開花習(xí)性上均存在很大差異（黃國振等，2009；Pellicer etal.，2013）。高質(zhì)量基因組信息是物種研究的基礎(chǔ)，已成為深入研究該物種分子機(jī)制的關(guān)鍵內(nèi)容。現(xiàn)有的二倍體藍(lán)星睡蓮參考基因組很難在分子層面滿足不同類型睡蓮的研究需求，如熱帶胎生睡蓮葉的“胎生”發(fā)育等，故其他類型睡蓮高質(zhì)量的參考基因組組裝亟需進(jìn)一步探索。為揭示熱帶胎生睡蓮的基因組信息，同時也為了避免盲目性，在全面深度測序之前，低覆蓋度的全基因組調(diào)查尤為重要，因其可以決定基因組測序中最合適的測序及拼裝方式。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用流式細(xì)胞術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)并結(jié)合生信方法分析熱帶胎生睡蓮保羅藍(lán)全基因組染色體大小、核型、倍型以及利用高通量測序技術(shù)對其進(jìn)行了Survey測序分析，并基于K-mer和Smudgeplot分析方法來進(jìn)一步推斷保羅藍(lán)睡蓮基因組的大小、雜合率和基因組結(jié)構(gòu)等信息，以期為開展睡蓮全基因組圖譜繪制、重要性狀功能基因挖掘及加快熱帶胎生睡蓮分子育種進(jìn)程提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

于2022年7月采集保羅藍(lán)睡蓮3～5 cm長處于沉水階段的幼嫩未展開葉片，分成2份，1份新鮮葉片直接用于Survey測序試驗(yàn)；另1份經(jīng)液氮速凍后，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r挖取3株長勢健壯的保羅藍(lán)睡蓮開花大苗，將根部泥土清洗干凈后，切除全部須根和木質(zhì)化的塊莖，并整株浸泡在清水中，7～10 d后待浸泡的保羅藍(lán)睡蓮萌發(fā)出2～3 cm長的幼嫩根尖時剪下備用，設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，樣品編號分別為BLL-1、BLL-2、BLL-3。試驗(yàn)用的所有保羅藍(lán)睡蓮均由同1株保羅藍(lán)睡蓮葉片胎生繁殖獲得，并全部種植并保存于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所睡蓮資源圃中。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1流式細(xì)胞術(shù)分析試驗(yàn)操作參照Dolezel和Bartos（2005）的方法并進(jìn)行改良。具體步驟為將適量已切碎的保羅藍(lán)睡蓮新鮮葉片組織浸沒于解離液中，并靜置10 min后隨即過濾，得到細(xì)胞核懸浮液。將400μL的碘化丙啶（PI）和RNAase溶液混合后加入細(xì)胞核懸浮液中，冰上避光染色0.5～1.0 h，獲得待測樣品。

以玉米樣品（基因組大小約2.3 Gb）作為內(nèi)參，和上一步制成的待測樣品按等比例混合后，利用BD FACScalibur流式細(xì)胞儀檢測，在488 nm藍(lán)光激發(fā)下，檢測PI的熒光強(qiáng)度。變異系數(shù)（CV）控制在5%以內(nèi)，通過比較玉米內(nèi)參的熒光強(qiáng)度，待測保羅藍(lán)睡蓮樣品中DNA含量計算公式如下：

待測樣品中DNA含量=內(nèi)參DNA含量×待測樣品的熒光強(qiáng)度/內(nèi)參樣品的熒光強(qiáng)度

1.2.2 DAPI熒光染色使用ddH2O將4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶解，配制成DAPI溶液，取適量DAPI水溶液，使用PBS緩沖液按1∶1000稀釋，制成濃度為0.5μg/mL的DAPI工作液。將處理后待染色的細(xì)胞與DAPI工作液室溫孵育15 min，使DAPI與DNA充分結(jié)合。使用PBS緩慢沖洗樣本后，使用帶有適當(dāng)激發(fā)和發(fā)射波長濾光片的熒光顯微鏡觀察染色效果。

1.2.3熒光原位雜交法分析試驗(yàn)操作參照J(rèn)iang（2019）、楊淵等（2023）的方法并進(jìn)行改良。具體步驟：首先將90%的冰乙酸預(yù)冷，將睡蓮幼嫩根尖置于其中靜置處理約15min后，用ddH2O清洗幾遍；之后將處理過的睡蓮根尖用纖維素酶和果膠酶體積比為3∶1的混合酶進(jìn)行酶解。將酶解完全后的根尖用70%酒精緩慢清洗幾遍后，與先前制備好的熒光原位雜交探針雜交，并在高像素的熒光顯微鏡下拍照、分析；最后將上一步酶解后未完全解離的睡蓮根尖再1次破碎、振蕩和離心后，用冰乙酸瞬時離心處理，在顯微鏡下找到處于分裂相的細(xì)胞后拍照保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 DNA提取、檢測和Survey測序使用DP305-02植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）［天根生化科技（北京）有限公司］提取保羅藍(lán)睡蓮DNA，采用NanoDrop 2000C超微量分光光度計測定DNA濃度和純度。基因組Survey測序委托武漢貝納科技有限公司完成，即對檢測合格的保羅藍(lán)睡蓮葉片DNA構(gòu)建測序文庫，利用BGI平臺對檢測合格的文庫進(jìn)行測序（DNBSEQ-T7）。由于原始序列（Raw yeads）可能包含低質(zhì)量序列、接頭序列等，為保證信息分析結(jié)果的可靠性，對原始測序數(shù)據(jù)過濾后得到有效序列（Clean reads）。

1.2.5 K-mer分析和Smudgeplot分析將Survey測序得到的Clean reads，利用K-mer分析法估計保羅藍(lán)睡蓮基因組大小、雜合率等情況（Guillaume and Kingsford，2011）；使用Jellyfish（version 2.2.10）得到Kmer頻率—深度分布，并對基因組大小進(jìn)行估計。利用Smudgeplot通過比較K-mer對覆蓋度的總數(shù)（CovA+CovB）和相對覆蓋度［CovB/（CovA+CovB）］，統(tǒng)計雜合K-mers對的數(shù)量，由于每個單倍型結(jié)構(gòu)都在圖上呈現(xiàn)一個污點(diǎn)（Smudge），采用污點(diǎn)熱度表示單倍型結(jié)構(gòu)在基因組中出現(xiàn)的頻率，頻率最高的單倍型結(jié)構(gòu)即為預(yù)測物種倍性，進(jìn)而解析保羅藍(lán)睡蓮基因組結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果與分析

2.1保羅藍(lán)睡蓮流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果

以已知基因組大小的玉米為內(nèi)參植物進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測定，估算保羅藍(lán)睡蓮的基因組序列大小。由圖1可知，保羅藍(lán)睡蓮呈現(xiàn)的峰整體狀態(tài)較好，背景碎片少，測定峰的位置沒有重疊干擾且重復(fù)性好，說明用玉米基因組作為內(nèi)參基因組的準(zhǔn)確性較高。經(jīng)3次重復(fù)測定，得到保羅藍(lán)睡蓮與內(nèi)參植物玉米的熒光強(qiáng)度比值，由此測算得到保羅藍(lán)睡蓮的基因組大小均為0.82 Gb（表1），約為公開發(fā)表二倍體藍(lán)星睡蓮基因組大小的2倍，初步判斷保羅藍(lán)睡蓮為四倍體植物。

2.2保羅藍(lán)睡蓮熒光原位雜交法分析結(jié)果

利用DAPI藍(lán)色熒光的DNA染料處理保羅藍(lán)睡蓮根尖染色體標(biāo)本，可以清晰地辨認(rèn)出染色體形態(tài)，獲得染色體數(shù)目，保羅藍(lán)睡蓮基因組包含56條染色體，染色體長度為0.45～1.50μm（圖2-A）。

將保羅藍(lán)睡蓮根尖樣本的染色體標(biāo)本，利用端粒重復(fù)序列探針進(jìn)行熒光原位雜交法分析，結(jié)果清晰顯示保羅藍(lán)睡蓮基因組包含56條染色體，與DAPI藍(lán)色熒光染色結(jié)果一致（圖2-B）。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用18S rDNA探針進(jìn)行熒光原位雜交法分析，4條染色體均顯示18S rDNA（綠色）雜交信號，推測保羅藍(lán)睡蓮為四倍體，核型公式為2n=4x=56（圖2-C）。

2.3保羅藍(lán)睡蓮Survey測序結(jié)果

由表2可知，基于BGI測序平臺，獲得保羅藍(lán)睡蓮Raw reads共615552560條，有效堿基共92.33 Gb，其中GC含量為39.45%，Q20為97.08%，Q30為91.97%。過濾后得到Clean reads共615552500條，有效堿基共89.17 Gb，其中Clean reads中GC含量為39.00%，Q20為97.11%，Q30為92.05%，當(dāng)Q20≥95%，Q30將近90%時，測序結(jié)果即可滿足進(jìn)一步組裝和Survey分析。

2.4保羅藍(lán)睡蓮K-mer分析及Smudgeplot分析結(jié)果

對過濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行K-mer分析，估計基因組大小、雜合率、重復(fù)序列等情況。由圖3可知，當(dāng)K=19時，得到K-mer的頻率分布情況，K-mer曲線在深度（Depth）為42.5X時的附近出現(xiàn)主峰，且在深度80.0X附近出現(xiàn)1個次主峰，次主峰后面出現(xiàn)較為明顯的拖帶現(xiàn)象，說明測試的保羅藍(lán)睡蓮染色體基因組有一定比率的重復(fù)序列。根據(jù)公式估算可知，保羅藍(lán)睡蓮總測序深度為106.9X，基因組大小為834.12 Mb，雜合率為1.95%，重復(fù)率約68.48%，依據(jù)K-mer結(jié)果分析，預(yù)測得到K-mer總數(shù)為70748835274（表3）。

以相對覆蓋度為橫坐標(biāo)，總覆蓋度（CovA+CovB）為縱坐標(biāo)，構(gòu)建保羅藍(lán)睡蓮Smudgeplot熱圖，結(jié)果由圖4可知，保羅藍(lán)睡蓮基因組結(jié)構(gòu)有4種類型，其中以四倍體AAAB出現(xiàn)的頻率最高，為0.43。結(jié)合K-mer分析結(jié)果，可進(jìn)一步推測出保羅藍(lán)睡蓮基因組屬于高雜合、高重復(fù)的復(fù)雜四倍體基因組。

3討論

不同物種基因組的雜合率、重復(fù)序列往往差異較大，基因組Survey測序深度雖較低，但結(jié)合K-mer分析，可快速獲得基因組的基本信息，如基因組大小、雜合率、重復(fù)序列比例等，為后續(xù)全基因組測序，構(gòu)建高質(zhì)量的染色體級基因組提供技術(shù)依據(jù)。物種尤其是同源多倍體，因多套染色體間高度相似而導(dǎo)致組裝難度極大，使基因組組裝難以達(dá)到理想的組裝效果（唐蝶和周倩，2021），因此在構(gòu)建保羅藍(lán)睡蓮高質(zhì)量參考基因組前，進(jìn)行基因組Survey測序顯得尤為重要。根據(jù)K-mer分析預(yù)測結(jié)果，通常按基因組重復(fù)率是否大于50%，劃分為高重復(fù)基因組（重復(fù)率≥50%）和低重復(fù)基因組（重復(fù)率lt;50%）；將基因組雜合率高于0.8%的稱為高雜合基因組，而通常認(rèn)為低雜合基因組則是雜合率介于0.5%和0.8%之間（伍艷芳等，2014）。本研究中基因組Survey測序后經(jīng)K-mer統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果顯示保羅藍(lán)睡蓮基因組雜合率為1.95%，重復(fù)率為68.48%，屬于高雜合高重復(fù)的復(fù)雜四倍體基因組。此外，Smudgeplot分析結(jié)果顯示保羅藍(lán)睡蓮基因組結(jié)構(gòu)可能為AAAB，具有3套同源單倍型基因組，這無疑增加了基因組組裝難度。后續(xù)開展保羅藍(lán)睡蓮基因組測序工作，單一的二代測序技術(shù)已無法組裝出滿意的結(jié)果，建議將二代測序技術(shù)和三代測序技術(shù)，如PacBio單分子實(shí)時測序或Nanopore測序結(jié)合，同時輔以Hi-C組裝等技術(shù)，以便獲得高質(zhì)量的染色體級基因組。

熱帶胎生睡蓮?fù)ǔＶ杆弻購V熱帶亞屬中葉片可進(jìn)行胎生發(fā)育并形成胎生苗的一類重要而特殊的類群，現(xiàn)有的熱帶胎生睡蓮其葉片胎生性狀均直接或間接來源于1個睡蓮原生種，即小花睡蓮。保羅藍(lán)睡蓮花型美觀、花梗挺水性好、花香濃郁、育性好，具有很高的推廣應(yīng)用和育種價值，但其為雜交種，親本來源并不清楚。睡蓮屬染色體數(shù)目分析一直備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，Pellicer等（2013）研究表明，小花睡蓮基因組大小為889.98 Mb，為二倍體，但本研究結(jié)果顯示小花睡蓮與其雜交后代保羅藍(lán)睡蓮一樣均為四倍體。此外，Hossain等（2007）、Pellicer等（2013）研究發(fā)現(xiàn)廣熱帶睡蓮亞屬中的延藥睡蓮（N.nouchali）有多種倍型（2n=28、56、84），結(jié)合上述3種睡蓮的表型特征，推測保羅藍(lán)睡蓮是小花睡蓮與延藥睡蓮的雜交后代，但需等保羅藍(lán)睡蓮基因組組裝出來后做進(jìn)一步的分析驗(yàn)證。保羅藍(lán)睡蓮葉片具有非常強(qiáng)的胎生發(fā)育能力，且具有美麗的藍(lán)色花瓣和誘人的香氣，其水生的特性使得上述性狀更為獨(dú)特，同為被子植物基部類群中更古老的無油樟目花型、花色單一且葉片無胎生性狀（Albert et al.，2013）。故對保羅藍(lán)睡蓮開展全基因組測序研究，不僅對揭示睡蓮屬植物重要性狀的調(diào)控機(jī)制具有重要意義，還將會對其他胎生植物胎生性狀以及花色、花香的起源進(jìn)化提供重要信息。

目前睡蓮屬中藍(lán)星睡蓮和盧旺達(dá)睡蓮的基因組已公開報道，但僅藍(lán)星睡蓮基因組組裝到了染色體級別（Povilus et al.，2020；Zhang et al.，2020）。睡蓮屬植物作為最古老的被子植物之一，其復(fù)雜的多倍型現(xiàn)象和很多獨(dú)特性狀，如花朵變色、葉胎生發(fā)育等性狀均是二倍體藍(lán)星睡蓮不具有的，因此對更多的睡蓮屬植物進(jìn)行全基因組測序，構(gòu)建睡蓮泛基因組，對促進(jìn)睡蓮屬植物分子生物學(xué)發(fā)展具有重要意義。本研究通過對保羅藍(lán)睡蓮基因組DAPI熒光染色及熒光原位雜交最終明確了保羅藍(lán)睡蓮染色體數(shù)量，通過流式細(xì)胞術(shù)和Survey測序結(jié)合K-mer和Smudgeplot分析預(yù)估了其基因組大小和雜合率、重復(fù)率及基因組的結(jié)構(gòu)等信息，可為后續(xù)開展保羅藍(lán)睡蓮全基因組的精細(xì)圖譜提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

4結(jié)論

熱帶胎生睡蓮保羅藍(lán)為高雜合高重復(fù)的復(fù)雜四倍體基因組，推測其基因組結(jié)構(gòu)為AAAB，具有3套同源單倍型基因組，組裝難度較高。后續(xù)開展保羅藍(lán)睡蓮基因組測序工作，單一的二代測序技術(shù)已無法組裝出滿意的結(jié)果，建議將二代測序技術(shù)和三代測序技術(shù)，如PacBio單分子實(shí)時測序或Nanopore測序結(jié)合，同時輔以Hi-C組裝等技術(shù)，以便獲得高質(zhì)量的染色體級基因組。

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（責(zé)任編輯：陳燕，李洪艷）