鑒定轉(zhuǎn)基因小麥中熒光蛋白的新技術(shù)應(yīng)用研究

摘 要：熒光顯微成像技術(shù)由于特異性好、對(duì)比度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域。熒光顯微成像最常用的檢測(cè)儀器是熒光顯微鏡和活體熒光成像儀，目前活體熒光成像儀用于植物領(lǐng)域的檢測(cè)分析報(bào)道較少。本研究以已獲得的含有紅色熒光蛋白標(biāo)記（DsRed）和綠色熒光蛋白標(biāo)記（GFP）的小麥種子為材料，通過(guò)熒光顯微鏡和活體成像儀觀察及與PCR的對(duì)比進(jìn)行分析，結(jié)果表明：利用熒光顯微鏡觀察到的熒光表達(dá)范圍主要是根尖及幼芽著生處，可以針對(duì)單個(gè)樣品精細(xì)觀察，但是由于視野所限，難以大批量分析，而活體熒光成像儀可同時(shí)觀察的植株數(shù)量較多，通量高，觀察GFP和RFP時(shí)，都能與野生型明顯的區(qū)分開，特異性較好，不會(huì)出現(xiàn)背景噪音，且不同于熒光顯微鏡的是RFP的標(biāo)準(zhǔn)值更高，也更明亮。經(jīng)過(guò)PCR鑒定分析，兩種設(shè)備均能正確篩選出陽(yáng)性植株，且結(jié)果較為一致。本研究可以為表達(dá)熒光蛋白基因植株的鑒別和篩選提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：活體成像儀；熒光顯微鏡；小麥；熒光觀察

中圖分類號(hào)：S512 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0488-5368（2025）01-0004-05

Observation and Identification of Transgenic Wheat Based on Fluorescent Protein Labeling

XUE Xiaodong LI Qinxia

（1. Shangluo University， Shangluo， Shaanxi 726000， China; 2. Collaborative Innovation Center for Resource and Biological Comprehensive Development in Qinba Mountain Area， Hanzhong， Shaanxi 723000， China）

Abstract： Fluorescent microscopic imaging technology is widely used in zoology， neuroscience， cell biology， molecular biology， and other research fields due to its specificity and contrast. The most commonly used detection instruments for fluorescence microscopy imaging are fluorescence microscopy and in vivo imagers， although in vivo imagers have not been extensively reported for plant detection and analysis. This study analyzed the wheat seeds containing red fluorescent markers （DsRed） and green fluorescent markers （GFP） using fluorescence microscopy， in vivo imaging， and PCR comparative observation. The results showed that the fluorescence expression observed with fluorescence microscopy was mainly located at the root tip and young bud growth regions， allowing detailed observation of individual samples. However， due to the limited field of view of the microscope， conducting large-scale analysis was challenging.The in vivo fluorescence imaging instrument could simultaneously observe a large number of plants with high throughput. When observing GFP and RFP， these markers could be clearly distinguished from the wild-type exhibiting high specificity and minimal background noise. Moreover， unlike fluorescence microscopy， the fluorescence intensity of RFP was higher and brighter. After PCR identification and analysis， both devices were able to correctly screen positive plants， and the results were consistent. This study provides theoretical basis and technical support for the identification and screening of transgenic plants.

Key words：Live imaging equipment; Fluorescence microscopes; Wheat; Fluorescence observations

熒光分子成像是通過(guò)激發(fā)光來(lái)激發(fā)熒光基團(tuán)，到達(dá)高能量狀態(tài)的一種靶向成像技術(shù)。常用的有綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白（RFP）及其它熒光報(bào)告基團(tuán)。熒光成像具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，比如其熒光信號(hào)強(qiáng)度高，不需要任何底物或其他輔助因子，只需要有激發(fā)光譜到達(dá)熒光蛋白或染料，便會(huì)釋放出其相應(yīng)的發(fā)射光譜。實(shí)際操作中，熒光成像還具有觀察方便、操作簡(jiǎn)單、特異性好、標(biāo)記靶點(diǎn)多樣化等優(yōu)點(diǎn)^[1]。但是，由于生物體內(nèi)物質(zhì)較為復(fù)雜，通過(guò)激發(fā)光的照射，許多物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生非特異性熒光，這將對(duì)目標(biāo)樣品的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，進(jìn)而影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。尤其是發(fā)光細(xì)胞存在于組織內(nèi)部，探測(cè)深度加大時(shí)，就需要更高能量的激發(fā)，此時(shí)便會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的背景噪音^[2]。

目前，用于觀察熒光成像的儀器主要為熒光顯微鏡與活體成像儀。熒光顯微鏡是利用短波光線照射目標(biāo)細(xì)胞或組織，使之激發(fā)長(zhǎng)波光線（熒光）來(lái)觀察顯微結(jié)構(gòu)的光學(xué)觀測(cè)儀器。現(xiàn)有的熒光顯微鏡將成像分辨率從幾百納米提高至幾納米^[3～7]，實(shí)現(xiàn)了生物精細(xì)結(jié)構(gòu)與精細(xì)動(dòng)態(tài)過(guò)程的高分辨體成像[8～13]。熒光顯微鏡由于波長(zhǎng)較短，分辨率較高，能夠直接顯示標(biāo)記的位置和強(qiáng)度，因此在醫(yī)學(xué)、植物學(xué)及遺傳學(xué)等領(lǐng)域中具有很高的應(yīng)用價(jià)值，其優(yōu)勢(shì)是其它技術(shù)方法難以取代的^[14]，在光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域中占有極其重要的地位[15～18]。活體成像儀是利用熒光報(bào)告基因標(biāo)記相關(guān)的細(xì)胞或DNA，通過(guò)靈敏度較高的成像檢測(cè)系統(tǒng)，可直接觀察和監(jiān)測(cè)動(dòng)物活體的基因表達(dá)，腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及藥物作用等生物學(xué)過(guò)程[19，20]，在動(dòng)物領(lǐng)域應(yīng)用較多，而植物領(lǐng)域應(yīng)用較少。該技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)快、直觀、易于操作、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠等優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)學(xué)研究、生命科學(xué)及藥物開發(fā)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[21，22]。

該研究在前期研究的基礎(chǔ)上，獲得了大量同時(shí)含有熒光標(biāo)記GFP和RFP（DsRed）的陽(yáng)性株系，并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用常規(guī)熒光顯微鏡和活體成像儀進(jìn)行了幼苗的鑒別篩選。由于尚未見(jiàn)此類篩選方法的對(duì)比報(bào)道，另外，目前活體成像儀主要用來(lái)進(jìn)行動(dòng)物觀察研究，而用于植物組織及幼苗的篩選觀察報(bào)道較少，因此該研究對(duì)兩種熒光篩選儀器的使用方法及效率進(jìn)行了分析和總結(jié)，以便為熒光標(biāo)記的應(yīng)用及其鑒定方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的材料為同時(shí)含有GFP和RFP（DsRed）熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小麥（Fielder），以對(duì)應(yīng)的野生型材料作為對(duì)照，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。保存的種子來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室。生長(zhǎng)條件為：長(zhǎng)日照（18h光照/6h黑暗，溫度20℃）。用于PCR的材料為經(jīng)過(guò)熒光觀察確定為陽(yáng)性的小麥幼苗，取5～7葉期的葉片單株混樣，CTAB法提取待測(cè)樣品的DNA，標(biāo)記后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熒光蛋白GFP或RFP的觀察 用于種子及幼苗觀察的活體成像儀使用的是PerkinElmerzei 的IVIS Lumina III 活體成像系統(tǒng)，根據(jù)需要把處理好需要觀察的種子或幼苗放入成像暗箱平臺(tái)，調(diào)節(jié)活體成像系統(tǒng)，使控制平臺(tái)升降到一個(gè)合適視野，開啟照明燈（明場(chǎng)）拍攝背景圖。然后關(guān)閉照明燈，在暗環(huán)境下（暗場(chǎng)）拍攝由植株體內(nèi)發(fā)出的特異熒光，并進(jìn)行保存。熒光顯微鏡使用的是Leica M165 FC，分別調(diào)節(jié)至對(duì)應(yīng)光源的鏡頭下（GFP或RFP）進(jìn)行種子或幼苗的觀察。GFP和RFP熒光檢測(cè)時(shí)，RFP的激發(fā)光波長(zhǎng)為545 nm（Ex=545 nm），GFP的激發(fā)光波長(zhǎng)為475 nm（Ex=475 nm）。

1.2.2 陽(yáng)性苗的PCR驗(yàn)證 對(duì)不同的目的片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中紅色熒光蛋白R(shí)FP（DsRed）引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為741 bp，綠色熒光蛋白GFP引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為596 bp。通過(guò)活體成像儀或者熒光顯微鏡下觀察，確定有熒光的發(fā)芽種子（或干種子），標(biāo)記為待測(cè)陽(yáng)性樣品。PCR方法：隨機(jī)取1.1中樣品的DNA為模板，PCR擴(kuò)增的Mix為諾唯贊的Green Taq Mix，擴(kuò)增體系為20 μL，PCR參數(shù)設(shè)置為35個(gè)循環(huán)（Denaturation：94℃ 30 s；Annealing：55℃ 45 s；Extension：72℃" 1 min），擴(kuò)增結(jié)果與熒光觀察結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光顯微鏡觀察GFP和RFP效果

在同一視野下，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型小麥發(fā)芽種子進(jìn)行觀察，選取的模式分別為白光、紅光（RFP）及綠光（GFP），觀察效果見(jiàn)圖1。通過(guò)熒光顯微鏡觀察種子時(shí)，必須等到種子發(fā)芽后才能觀察到熒光，幼芽大于1～2 cm效果最好，干種子觀察不到。熒光視野下，GFP的表現(xiàn)情況一般有4種：①整個(gè)種子的身體，以及根部和幼芽均可觀察到明顯的綠色熒光，其中，根的基部、幼芽基部最為明亮；②根尖、幼芽基部，著生幼芽的種子一端最為明亮（圖1c），這種情況比①的熒光范圍要小，可以看作是①情況下保留的最亮部分；③只有整個(gè)種子身體有熒光，其他部位沒(méi)有；④只有種子身體的部分有熒光，熒光部位在著生幼芽的種子一端。上述四種情況中，前兩種表現(xiàn)是熒光顯微鏡觀察發(fā)芽種子時(shí)最常見(jiàn)的兩種情況。

熒光顯微鏡視野下，RFP的觀察情況一般有兩種：①紅色熒光主要集中在根尖、幼芽基部及種子著生幼芽的一端；②紅色熒光集中在幼芽的基部，種子身體呈現(xiàn)微弱熒光，其他部位沒(méi)有觀察到明顯熒光（圖1b）。在熒光顯微鏡視野下，RFP和GFP非常相似。可見(jiàn)，紅色熒光的表現(xiàn)狀態(tài)不如綠色熒光豐富。

2.2 活體成像儀觀察GFP和RFP效果

通過(guò)活體成像儀觀察種子時(shí)，與熒光顯微鏡不同，種子不需要發(fā)芽（培養(yǎng)皿浸泡1～2 d），甚至干種子，也可直接觀察到明顯熒光。觀察視野下，由于其可觀察范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通熒光顯微鏡，所以單次通量高，可以同時(shí)觀察較多的種子（圖2），也不需要像熒光顯微鏡一樣旋轉(zhuǎn)鏡頭，只需要在軟件中更改觀察模式（GFP或RFP）就能實(shí)現(xiàn)不同熒光視野之間的切換，操作簡(jiǎn)便。用于觀察GFP和RFP的情況時(shí)，種子的熒光表現(xiàn)情況相似，在同一視野下有四種：①整個(gè)種子身體均可觀察到明顯綠色/紅色熒光，尤其是種子著生幼芽的一端（圖2d，9#、13#、15#）。②只有種子身體的部分有熒光，發(fā)光部位呈條狀（圖2d，RFP的3#、7#、8#）。③種子身體的部分有熒光，發(fā)光部位呈點(diǎn)狀（圖2b，GFP的2#；圖2d，RFP的1#、10#、14#）。通過(guò)對(duì)比觀察可以發(fā)現(xiàn)，活體成像儀用于熒光觀察時(shí)，熒光表現(xiàn)出的特異性較好，相較于熒光顯微鏡而言，背景（WT）清楚無(wú)干擾。

2.3 PCR驗(yàn)證篩選陽(yáng)性植株

隨機(jī)選取在活體成像儀或者熒光顯微鏡下觀察過(guò)的部分種子（發(fā)芽或者干種子），做好標(biāo)記。待種子發(fā)芽并將幼苗移栽后，在5～7葉期提取DNA，針對(duì)目的基因序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。RFP（DsRed）引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為741 bp，GFP引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為596 bp，對(duì)標(biāo)記過(guò)的幼苗隨機(jī)抽取進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定（圖3）。發(fā)現(xiàn)有的樣品只含有一條帶（泳道2、3、7），有的含有兩條（泳道1、4、5等）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PCR與熒光是否一致，進(jìn)行了抽樣分析，發(fā)現(xiàn)活體成像儀與熒光顯微鏡鑒定后的樣品均與PCR驗(yàn)證結(jié)果一致，也就是能觀察到熒光的，PCR檢測(cè)也有相應(yīng)的條帶，沒(méi)有對(duì)應(yīng)熒光的，PCR檢測(cè)沒(méi)有條帶。證明用活體成像儀與熒光顯微鏡，觀察植物種子或幼苗的熒光表達(dá)情況是可行的。

3 討論

3.1 熒光出現(xiàn)背景噪音的處理

近年來(lái)，熒光顯微成像技術(shù)由于良好的特異性、高的對(duì)比度和信噪比，以及熒光成像具有直觀方便、標(biāo)記位點(diǎn)多樣等性能優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)、植物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域^[23]，在微觀光學(xué)研究領(lǐng)域占有重要地位[24～26]。然而，傳統(tǒng)的熒光顯微鏡仍然存在分辨率、成像速度、成像視場(chǎng)的影響，尤其是很多植物體內(nèi)物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，會(huì)產(chǎn)出非特異性熒光，這種熒光對(duì)目標(biāo)樣品的檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致較大的試驗(yàn)誤差。本研究通過(guò)熒光顯微鏡的觀察使用，發(fā)現(xiàn)有的野生型（WT）植物幼苗或者種子，會(huì)觀察到微弱熒光的情況，尤其是RFP（DsRed）觀察的過(guò)程中，更容易出現(xiàn)此類現(xiàn)象，而有的陽(yáng)性苗有時(shí)檢測(cè)熒光表現(xiàn)較弱，甚至看不到明顯熒光，即使改換不同儀器再觀察也是同樣的情形，這可能與植物組織內(nèi)部物質(zhì)有關(guān)，也可能與目標(biāo)基因的表達(dá)量有關(guān)，此類現(xiàn)象尚未見(jiàn)報(bào)道說(shuō)明。這就表明用熒光顯微鏡觀察目標(biāo)樣品的過(guò)程中，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生干擾，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性，影響鑒別篩選的效率和準(zhǔn)確性。由于這類情況較少，本研究在試驗(yàn)過(guò)程中將野生型直接丟掉，換干凈無(wú)干擾的做對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)基因苗只有微弱熒光而難以取舍的，進(jìn)行再次種植觀察，效果有較大改善，多數(shù)可清晰地觀察到相應(yīng)熒光。

3.2 活體成像儀的優(yōu)點(diǎn)

活體成像儀能夠直觀地、動(dòng)態(tài)地觀察到動(dòng)物體綠色/紅色熒光表達(dá)情況，常用于活體動(dòng)物體內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程研究[27～29]，例如小動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，以及細(xì)胞增殖和擴(kuò)散活動(dòng)，甚至可以觀測(cè)特定基因的表達(dá)、細(xì)菌或病毒感染到發(fā)病等生物學(xué)過(guò)程[20，30]，但是在植物研究領(lǐng)域應(yīng)用的比較少。本研究將活體成像儀應(yīng)用在植物的種子與剛發(fā)芽的幼苗上，該儀器使用過(guò)程中，不光是通量高，能同時(shí)觀察大量的材料，而且亮度非常高，準(zhǔn)確度也較高，完全可以代替普通體視熒光顯微鏡的功能。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，活體成像儀觀察GFP和RFP時(shí)，都能與野生型明顯的區(qū)分開，特異性較好，不會(huì)出現(xiàn)背景噪音。GFP觀察效果與熒光顯微鏡觀察效果相似，反而RFP的標(biāo)準(zhǔn)值（color bar）更高，也更明亮。而熒光顯微鏡觀察時(shí)，情況正好相反，即：GFP觀察到的熒光通常來(lái)說(shuō)較明亮，容易觀察，熒光亮度要大于RFP，RFP有時(shí)會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性苗難以捕捉到熒光的情況，GFP無(wú)此情況。說(shuō)明活體成像儀觀察植物組織的時(shí)候，更加的準(zhǔn)確、分辨率更高。

4 結(jié)論

本研究利用活體成像儀進(jìn)行了植物的觀察和分析，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，證明活體成像儀是可以用于植物的研究和篩選的。本文對(duì)活體成像儀及熒光顯微鏡的應(yīng)用做了詳細(xì)的對(duì)比，進(jìn)一步通過(guò)分子技術(shù)的驗(yàn)證和分析，證明了兩種設(shè)備均可用于植物的篩選和研究，且活體成像儀通量高，可同時(shí)處理大批量的試驗(yàn)材料，而熒光顯微鏡更適合于單株或個(gè)體局部的精細(xì)觀察。

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收稿日期：2024-01-30 修回日期：2024-03-20

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳重點(diǎn)科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（21JY008）；商洛學(xué)院科學(xué)與技術(shù)研究基金項(xiàng)目（20SKY010）。

第一作者簡(jiǎn)介：薛曉東（1983-），博士，講師，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)及環(huán)境微生物學(xué)。

通信作者：薛曉東。